Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV

Riepilogo

Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.

Abstract

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) è una seria minaccia per la salute pubblica. Durante le stagioni influenzali, la diffusione del SARS-CoV-2 e di altri virus respiratori può causare un carico di malattie respiratorie a livello di popolazione che è difficile da gestire. Per questo, i virus respiratori SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) dovranno essere attentamente monitorati nelle prossime stagioni autunnali e invernali, in particolare nel caso di SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, che condividono fattori epidemiologici simili come popolazioni suscettibili, modalità di trasmissione e sindromi cliniche. Senza saggi specifici per il bersaglio, può essere difficile distinguere tra i casi di questi virus a causa delle loro somiglianze. Di conseguenza, un test multiplex sensibile e mirato, in grado di differenziare facilmente tra questi bersagli virali, sarà utile per gli operatori sanitari. In questo studio, abbiamo sviluppato un test basato sulla PCR con trascrittasi inversa in tempo reale utilizzando un kit RT-qPCR R3T one-step sviluppato internamente per il rilevamento simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con un minimo di 10 copie dei loro RNA sintetici, possiamo identificare con successo i bersagli di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV contemporaneamente con una specificità del 100%. Questo test è risultato accurato, affidabile, semplice, sensibile e specifico. Il metodo sviluppato può essere utilizzato come test diagnostico ottimizzato per SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV in ospedali, centri medici e laboratori diagnostici, nonché per scopi di ricerca.

Introduzione

La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in corso è causata dal nuovo coronavirus noto come sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)¹. A causa della forte contagiosità e della capacità di trasmissione rapida del SAR-CoV-2, la pandemia di COVID-19 è emersa nella città di Wuhan, in Cina, e si è diffusa rapidamente in tutto il mondo. Questo alla fine ha portato all'inizio di segni di distress respiratorio e persino alla morte ^2,3,4. Il COVID-19 è stato dichiarato pandemia in più di 213 paesi, prevedendo un forte aument....

Protocollo

1. Espressione e purificazione della Taq polimerasi

1. Costruire un plasmide con un tag esa-istidina separabile all'estremità C dell'enzima.
2. Trasformare 50 ng del vettore di espressione nel ceppo di E. coli BL21-(DE3) seguendo il protocollo standard³⁸.
3. Inoculare le cellule trasformate in quattro matracci da 6 L contenenti ciascuno 2 L di brodo di terreno 2YT a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere il OD 600 di 0,8 o il numero di cellule 6,4 x 10⁸ .
4. Indurre l'espressione della Taq polimerasi con 0,5 mM di isopropil-β-d-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare ulte....

Discussione

Il sistema sanitario di tutto il mondo è gravoso dal pesante onere economico derivante dagli elevati tassi di infezione e mortalità dovuti alla diffusione di virus respiratori comuni come le varianti SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV ^12,19,20. Motivati dal senso di responsabilità verso l'alleggerimento di questo onere, ci siamo resi conto della necessità di un test diagnostico rapido, preciso e accessibile come la RT-qPCR.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter cups	Thermo Scientific	291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer	Novex	LC2675
6-well tissue culturing plates	Corning	353046
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	A701-3
Ampicillin	Corning	61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL	Cytiva	17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%	Thermo Scientific	A14207.60
DH10Bac competent cells	Fisher Scientific	10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)	Thermo Scientific	68100
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water	Ambion	AM9930
dNTPs	Thermo Scientific	R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells	Invitrogen	C600003
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Elution Buffer	Qiagen	19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)	Expression Systems	96-001-01
FBS Solution	Gibco	A38400-01
Fugene (transfection reagent)	Promega	E2311
Gentamicin	Fisher Scientific	15750060
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-500
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896-100ml
Imidazole	Sigma Aldrich	56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA	Twist Bioscience	103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA	Twist Bioscience	103002
Influenza B synthetic RNA	Twist Bioscience	103003
IPTG	Gold Biotechnology	I3481C100
Kanamycin	Gibco	11815-032
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB Broth media	Fisher Scientific	BP1426-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-10G
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA	Twist Bioscience	103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1093
Miniprep kit	Qiagen	27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL	Cytiva	17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL	Cytiva	17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free	Applied Biosystems	4311971
Potassium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-1
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein marker	Fermentas	26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)	Applied Biosystems
S.O.C medium	Fisher Scientific	15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA	Twist Bioscience	102024
Sf9 insect cells	Gibco	A35243
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL	Cytiva	29401323
Tetracycline	IBI Scientific	IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris-HCl	Affymetrix	22676
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379-100ml
X-Gal	Invitrogen	B1690