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Resumo

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Resumo

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que causa a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é uma séria ameaça à saúde pública em geral. Durante as temporadas de gripe, a disseminação do SARS-CoV-2 e de outros vírus respiratórios pode causar uma carga populacional de doença respiratória difícil de controlar. Para isso, os vírus respiratórios SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) precisarão ser cuidadosamente observados nas próximas temporadas de outono e inverno, particularmente no caso do SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, que compartilham fatores epidemiológicos semelhantes, como populações suscetíveis, modo de transmissão e síndromes clínicas. Sem ensaios alvo-específicos, pode ser difícil diferenciar entre os casos desses vírus devido às suas semelhanças. Assim, um ensaio multiplex sensível e direcionado que possa facilmente diferenciar entre esses alvos virais será útil para os profissionais de saúde. Neste estudo, nós desenvolvemos um ensaio baseado em transcriptase reversa em tempo real utilizando um kit RT-qPCR de uma etapa R3T desenvolvido internamente para detecção simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Com apenas 10 cópias de seus RNAs sintéticos, podemos identificar com sucesso alvos SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV simultaneamente com 100% de especificidade. Este ensaio é encontrado para ser preciso, confiável, simples, sensível e específico. O método desenvolvido pode ser usado como um ensaio de diagnóstico SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2 otimizado em hospitais, centros médicos e laboratórios de diagnóstico, bem como para fins de pesquisa.

Introdução

A pandemia da doença 2019 do coronavirus em curso (COVID-19) é causada pelo novo coronavirus conhecido como coronavirus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)1. Devido à forte contagiosidade do SAR-CoV-2 e à capacidade de transmissão rápida, a pandemia de COVID-19 surgiu na cidade de Wuhan, na China, e se espalhou rapidamente pelo mundo. Isso acabou levando ao aparecimento de sinais de desconforto respiratório e até mesmo à morte 2,3,4. A COVID-19 foi declarada pandemia em mais de 213 países, esperando-se um aumento acentuado no número de casos confirmados, como evidenciado pelos trabalhos publicados por diferentes estudos de pesquisa 3,5. A COVID-19 é transmitida principalmente por pequenas gotículas respiratórias que os indivíduos infectados liberam no ambiente e depois são expostos a indivíduos vulneráveis por inalação ou contato próximo com superfícies contaminadas. Quando essas gotículas entram em contato com a mucosa dos olhos, boca ou nariz, a pessoa pode se infectar6. Estatísticas divulgadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que houve mais de 76 milhões de casos confirmados da pandemia no mundo, com impressionantes 7 milhões demortes7. Assim, as Nações Unidas classificaram a pandemia causada pela doença COVID-19 como um desastre por causa de seu impacto direto na vida de bilhões de pessoas em todo o mundo e teve efeitos econômicos, ambientais e sociais de longo alcance.

Iniciativas de saúde pública, incluindo testes completos, detecção precoce, rastreamento de contatos e isolamento de casos, têm se mostrado cruciais para manter a pandemia sob controle 8,9,10,11. Os meses de inverno aumentarão a circulação de outros vírus respiratórios como Influenza A e B com sintomas semelhantes aos da COVID-19, dificultando a identificação, rastreamento e isolamento de casos de COVID-19 no início. Todos os anos, o surto de Influenza A e B inicia-se no final do outono ou início de janeiro, com uma sazonalidade previsível12. Numerosas características epidemiológicas são compartilhadas pelos vírus SARS-CoV-2 e Influenza. Além disso, compartilham semelhanças nas populações suscetíveis que incluem crianças, idosos, imunocomprometidos e indivíduos com comorbidades crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, insuficiência cardíaca e renal ou diabetes 12,13. Esses vírus não apenas compartilham populações vulneráveis, mas também vias de transmissão de contato e gotículas respiratórias14. Prevê-se que os pacientes possam provavelmente contrair mais de um desses vírus respiratórios à medida que a temporada de gripe se aproxima14. Para isso, o rastreamento do SARS-CoV-2 e dos vírus Influenza precisa ser feito em pacientes sintomáticos antes de serem isolados. A realização de testes separados para os três vírus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) não é possível devido à falta global de recursos para extração e diagnóstico de ácidos nucleicos. A fim de triá-los todos em uma reação, um método ou teste precisa ser desenvolvido.

A síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV é um membro da família do coronavírus humano (CoV). Os primeiros isolados do vírus MERS-CoV vieram de um paciente hospitalizado na Arábia Saudita que morreu em setembro de 2012 devido a problemas respiratórios agudos15. Há evidências que sugerem que um hospedeiro reservatório proeminente para o MERS-CoV são os camelos dromedários. Está comprovado que vírus de camelos dromedários infectados são zoonóticos e, portanto, podem infectar humanos16,17. Humanos infectados com esse vírus podem transmiti-lo a outras pessoas por meio de contato próximo18. Até 26 de janeiro de 2018, havia 2143 casos confirmados laboratorialmente de infecção por MERS-CoV, incluindo 750 mortes em todo o mundo19. Os sintomas mais típicos do MERS-CoV são tosse, febre e falta de ar. Também foram relatados que infecções por MERS-CoV apresentam sintomas de pneumonia, diarreia e doença gastrointestinal20. Atualmente, nenhuma vacina comercial ou tratamento específico para MERS-CoV está disponível. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso é essencial para prevenir os surtos generalizados de MERS-CoV e diferenciar o MERS-CoV da doença SARS-CoV-2.

Até o momento, muitas abordagens têm sido propostas para detectar esses vírus, tais como RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, imunoensaio de fluxo lateral30, sensores biomoleculares baseados em papel31, teste de SHERLOCK em um pote32, DNA aptamer33, isotérmico mediado por loop amplificação (LAMP)19,34, etc. Cada um dos métodos acima mencionados tem benefícios e desvantagens únicas em termos de sensibilidade e especificidade. Entre esses métodos, o teste baseado em amplificação de ácido nucleico: multiplex qRT-PCR, é o mais comum e é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.

Neste estudo, nós projectamos e avaliamos várias combinações do primer e sondas para a detecção eficaz, exacta, e simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando RNAs virais sintéticos da torção padrão. Os ensaios multiplexados desenvolvidos para os genes-alvo do MERS-CoV ou do SARS-CoV-2 são recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Esses genes geralmente codificam proteínas e complexos que contribuem para a formação de um complexo de replicação/transcrição (RTC)35, como a região dentro do open reading frame 1a (ORF1a) que é usada para o ensaio MERS-CoV. Além disso, as proteínas estruturais são codificadas pelos genes utilizados em ensaios diagnósticos, tais como a região a montante do gene do envelope (upE) e o gene do nucleocapsídeo (N), que são usados para ensaios MERS-CoV e SARS-Cov-2, respectivamente 35,36. Usamos o kit interno de RT-qPCR de uma etapa R3T para estabelecer o RT-qPCR para a detecção de vírus37. A detecção do vírus, a sensibilidade, a especificidade e a faixa dinâmica do nosso kit RT-qPCR de uma etapa R3T e dos conjuntos de primers foram testados e avaliados usando diluições seriadas de 10 vezes dos RNAs sintéticos de torção padrão. O menor limite prático de detecção foi de aproximadamente 10 cópias transcritas por reação. Como resultado, o kit RT-qPCR de uma etapa R3T interno e conjuntos de primer/sonda podem ser usados e implementados com sucesso para diagnóstico simultâneo de rotina de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

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Protocolo

1. Expressão e purificação da Taq polimerase

  1. Construir um plasmídeo com uma etiqueta hexa-histidina clivável no término C da enzima.
  2. Transformar 50 ng do vetor de expressão em cepa de E. coli BL21-(DE3) seguindo o protocolo padrão38.
  3. Inocular as células transformadas em quatro frascos de 6 L cada um contendo 2 L de caldo de meio 2YT a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir o OD 600 de 0,8 ou o número de célula 6,4 x 108 .
  4. Induzir a expressão da Taq polimerase com 0,5 mM de isopropil-β-d-thiogalactopiranosídeo (IPTG) e incubar a 16 °C por 18 h com agitação.
  5. Colher as células girando-as a 4 °C a 7808 x g durante 10 minutos. Ressuspender os pellets em 200 mL de tampão de lise Taq polimerase gelado (Tabela 1) em 5 mL/g de pellet celular.
  6. Incubar as células com lisozima (2 mg/mL de tampão de lise) e inibidores de protease por 45 min e, em seguida, passar o lisado através de um disruptor celular a 30 kPsi e centrifugar a 22.040 x g por 30 min a 4 °C para separar os detritos celulares.
  7. Aquecer o sobrenadante durante 15 min a 85 °C. Gire para baixo a 95.834 x g por 1 h a 4 °C. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo no gelo utilizando um filtro de 0,45 μm.
  8. Realizar a purificação de proteínas usando Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC) passando primeiro a amostra através de uma coluna Ni-NTA HP de 5 mL a 4 mL/min de vazão usando tampão Taq polimerase A (Tabela 2; Figura 1A).
  9. Lavar com 10 volumes de coluna (CV) de tampão Taq polimerase A e 4% de tampão Taq polimerase B (Tabela 2). Eluir a proteína ligada com um gradiente linear usando Taq polimerase Buffer B acima de 20 CV em um frasco de 100 mL.
  10. Passar o eluente no frasco de 100 mL através de uma coluna de troca catiônica de 5 mL a 4 mL/min usando tampão Taq polimerase C (Tabela 2; Figura 1A).
  11. Lavar com 20 CV de tampão Taq polimerase C 100% e tampão D Taq polimerase 5% (Tabela 2).
  12. Eluir com gradiente linear utilizando tampão Taq polimerase D (Tabela 2) a partir de 5% a 100%.
  13. Verificar as frações eluídas realizando-se eletroforese em gel SDS-PAGE 39 seguida de coloração em gel 40 conforme descrito anteriormente. Resumidamente, pegue 10 μL de cada fração e adicione um volume igual de 2x corante de carregamento SDS. Desnaturar a amostra a 90oC durante 10 min. Coloque as amostras em gel SDS-PAGE a 10% e passe o gel por 25 min a 200 V. Manchar o gel usando Coomassie Brilliant Blue e depois desmanchar.
  14. Recolher todas as fracções que contêm Taq polimerase purificada e dialisar contra tampão de armazenamento da taq polimerase (Tabela 3) a 4 °C. Resumidamente, prepare 2 L do tampão de armazenamento e mergulhe o de diálise no tampão por 2 minutos para hidratar. Injete as frações coletadas usando uma agulha no de diálise e deixe-o durante a noite no tampão de diálise a 200 rpm no agitador.
  15. Após a diálise, medir a concentração de proteínas usando um espectrofotômetro, fazer alíquotas de 10 μL, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.
    NOTA: Filtre todos os buffers para purificação usando um filtro de 0,45 μm antes de carregá-los no sistema FPLC.

2. Expressão de MMLV-RT no sistema de expressão e purificação de células de insetos

  1. Geração e isolamento de DNA bacmid
    1. Clone a sequência de MMLV-RT com uma etiqueta TEV-8xHis-Strep clivável C-término conforme descrito anteriormente41.
    2. Misture 100 ng do vetor de expressão em 50 μL de células DH10Bac e misture suavemente batendo no tubo.
    3. Incubar as células no gelo por 15 min. Choque térmico das células durante 1 min a 42 °C.
    4. Transfira imediatamente no gelo e adicione 400 μL de meio S.O.C. Incubar a 37 °C com agitação durante 4 h.
    5. Placa de 10 μL e 15 μL da mistura em placas de Agar LB contendo três antibióticos; 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 7 μg/mL de gentamicina, juntamente com 40 μg/mL de IPTG e 100 μg/mL de X-Gal para seleção azul-branca.
    6. Incubar as placas a 37 °C durante 48 h. Escolha várias colônias brancas e uma colônia azul como controle e volte a colocá-las em placas de ágar LB frescas contendo os antibióticos acima. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
    7. Após a confirmação do fenótipo branco, escolher algumas colônias e inocular-as em 10 mL de LB contendo 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 7 μg/mL de gentamicina em tubos de 50 mL.
    8. Incubar a cultura a 37 °C com agitação a 170 rpm durante a noite. Pellet down as células girando-as para baixo a 22.040 x g por 10 min.
    9. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 250 μL de solução de ressuspensão do kit miniprep (esta solução precisa ser manuseada de acordo com as instruções do fabricante) e, em seguida, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    10. Adicionar 250 μL de solução de lise, misturar suavemente e incubar durante 3 minutos. Adicionar 350 μL de solução neutralizante, inverter 2x-3x e centrifugar a 22.040 x g por 10 min.
    11. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e adicionar um volume igual de isopropanol gelado e incubar durante 30 minutos a -20 °C.
    12. Pellet down o DNA precipitado girando a 22.040 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 700 μL de etanol gelado a 70%, 2x.
    13. Retire o sobrenadante com uma pipeta sem tocar no pellet. Deixe o ar do pellet secar na capela de fluxo laminar por 5-10 min ou até que nenhum líquido seja visto no tubo. Dissolva o pellet em 100 μL de tampão EB.
  2. Transfecção bacmid e amplificação viral
    1. Preparação do vírus P1
      1. Em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, semente ~ 9 x 105 células/poço em 2 mL de meio de cultura de células de insetos.
      2. Incubar a placa por ~30 min à temperatura ambiente para permitir que as células se fixem.
      3. Preparar a mistura Bacmid/Fugene da seguinte forma: misturar 1 μg de ADN Bacmid e 300 μL de meios de células de insectos num tubo. Em outro tubo, misturar 8 μL de reagente de transfecção e 300 μL de meio de células de insetos. Misture ambas as misturas por pipetagem suave e deixe por ~30 min à temperatura ambiente para que o complexo reagente bacmid/transfecção se forme.
      4. Adicione a mistura de complexo bacmid (~210 μL) a cada poço gota a gota e sele a placa com um filme transparente.
      5. Incubar a placa a 27 °C durante 3-4 dias.
      6. Pegue o meio que contém o vírus, adicione FBS (concentração final de 2%), filtre usando filtro de 0,45 μm e armazene a 4°C no escuro como estoque de vírus P1.
    2. Preparação do vírus P2
      1. Transfectar 50 mL de células de insetos a 2 x 106 células/mL com 3 mL de vírus P1 em um frasco de cultura.
      2. Incubar a 27 °C com agitação a 100 rpm durante 4-6 dias até que a percentagem de células mortas atinja 25%-30%.
      3. Centrifugar a 300 x g por 10 min e coletar o sobrenadante que contém o vírus.
      4. Adicionar FBS a uma concentração final de 2%, filtrar através de filtro de 0,45 μm e alíquota de 1 mL cada e armazenar a -80 °C como estoque de vírus P2.
    3. Preparação do vírus P3
      1. Transfectar 100 mL de células de insetos a 2 x 106 células/mL com os 2 mL do vírus P2 em um frasco de cultura.
      2. Incubar a 27 °C com agitação a 100 rpm durante 3-4 dias até que a percentagem de células mortas atinja 15%-20%.
      3. Centrifugar as células a 300 x g por 10 min e coletar o sobrenadante que contém o vírus.
      4. Adicionar FBS a uma concentração final de 2%. Filtrar através de um filtro de 0,45 μm. Pode ser armazenado no escuro a 4 °C por 1 mês.
  3. Expressão e purificação de MMLV-RT em células de insetos
    1. Adicionar 5 ml de vírus P3 a células frescas de insectos a uma densidade de 2 x 106 células/ml (frasco de 700 ml/2L) num total de 6 frascos.
    2. Colher as células após 55-60 h de pós-transfecção girando a 7808 x g por 10 min.
    3. Ressuspender os pellets celulares em 200 mL de tampão de lise MMLV-RT (Tabela 4). Passar o lisado através de um disruptor celular a 15 kPsi e centrifugar a 22.040 x g durante 30 minutos a 4 °C.
    4. Transfira o sobrenadante para novos tubos e gire novamente a 95.834 x g a 4 °C por 1 h. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo no gelo utilizando um filtro de 0,45 μm.
    5. Iniciar a purificação da proteína usando FPLC passando primeiro a amostra através da coluna Ni-NTA Excel 5 mL (Figura 1B) a 4 mL/min de fluxo usando o tampão A do MMLV-RT (Tabela 5).
    6. Lavar a coluna com 10 CV de tampão A e 4% de tampão B MMLV-RT (Tabela 5) e eluir a proteína com gradiente linear de tampão B MMLV-RT acima de 20 CV em frasco de 100 mL.
    7. Passar a amostra eluída pela coluna Strep 5 mL (Figura 1B) balanceada com tampão C MMLV-RT (Tabela 5).
    8. Lavar a coluna com 10 CV de tampão C 100% MMLV-RT e eluir a proteína com gradiente linear com 20 CV de tampão D (Tabela 5).
    9. Verifique as frações eluídas realizando o SDS-PAGE como feito é os passos 1.13.-1.14. e coletar as frações que contêm MMLV-RT purificado para serem dialisadas contra o tampão de armazenamento MMLV-RT (Tabela 6) a 4 °C.
    10. Medir a concentração de proteínas usando Nanodrop, alíquota, congelamento instantâneo em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.
      NOTA: Filtre todos os buffers para purificação usando um filtro de 0,45 μm antes de carregá-los no sistema FPLC.

3. Preparação interna de componentes do kit RT-qPCR multiplex R3T de uma etapa

  1. Preparação da mistura tampão
    1. Prepare o buffer 2x para a reação RT-qPCR que contém os reagentes mostrados anteriormente em37. Preparar todos os reagentes em água DNase/RNase-Free e a mistura tampão armazenada num congelador de -20 °C.
  2. Primers e Sondas Conjuntos e primers preparação de misturas
    NOTA: Os testes e primers utilizados estão listados na Tabela 7. O kit multiplexado de Influenza e SARS-CoV-2 contém 3 sondas e 4 conjuntos de primers para frente e para trás. As sondas são rotuladas nas extremidades 5′ usando repórteres 6-carboxifluoresceína (FAM) para InfA, Texas Red-XN para SARS-CoV-2 (gene N) e Yakima Yellow para InfB. O kit multiplexado MERS-CoV e SARS-CoV-2 contém 3 sondas e 3 conjuntos de primers para frente e para trás. As sondas também são rotuladas nas extremidades 5′ usando repórteres Texas Red-XN para MERS-CoV (gene ORF1a), VIC para MERS-CoV (gene UpE) e 6-carboxifluoresceína (FAM) SARS-CoV-2 (gene N).
    1. Preparar uma mistura de primers contendo todos os primers e sondas listados na Tabela 7 com uma concentração final de 6,7 μM para cada primer forward e reverse e 1,25 μM para cada sonda em um tubo de 1,5 mL. Conservar a mistura de primers no congelador a -20 °C. Use o buffer de eluição para compor o volume necessário.
  3. Preparação de misturas enzimáticas
    1. Preparar a mistura enzimática Taq polimerase (30 U/μL) e MMLV-RT (60 ng/μL) no tampão de armazenamento da Taq polimerase, conforme mostrado na Tabela 3 , para compor o volume necessário. Execute esta etapa no gelo e armazene a mistura de enzimas a -20 °C.
  4. Modelo de RNA
    1. Ressuspender RNAs sintéticos de SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B e MERS-CoV separadamente em 100 μL de 1x tampão Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl e 1 mM EDTA (pH 8,0) para fazer um estoque de 1 x 106 cópias de RNA/μL.
    2. Misturar RNAs sintéticos para RT-qPCR nas seguintes configurações: 1) SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, adicionando 5 μL de cada estoque de vírus a 50 μL de volume para fazer 1 x 105 cópias de RNA/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV adicionando 5 μL de cada estoque de vírus a 50 μL de volume para fazer 1 x 105 cópias de RNA/μL. Faça diluições seriadas de 10 vezes de cada mistura de RNA sintético variando de 1 x 105 cópias de RNA/μL a 10 cópias de RNA/μL.
      NOTA: Certifique-se de usar água gelada DNase/RNase-Free para preparar a diluição em série dos modelos.

4. Teste interno multiplexado de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, teste RT-qPCR de uma etapa de MERS-CoV

NOTA: Desinfete as superfícies da estação de trabalho e use um modelo de placa de 96 poços para planejar o layout da placa PCR.

  1. Preparação da placa de 96 poços
    1. Descongelar 2x tampão e mistura de primers. Mantenha a mistura de enzimas no gelo.
    2. A cada poço, adicione 10 μL de mistura tampão 2x, 1,5 μL da mistura de primers, 1 μL de mistura enzimática, 6,5 μL de Água Livre de DNase/RNase e 1 μL da mistura de RNA correspondente que precisa ser testada. O volume final em cada poço é de 20 μL. Consulte o layout preparado para obter ajuda com esta etapa.
      NOTA: Recomenda-se fazer uma mistura mestre com base no número de reações que contêm todos os reagentes, exceto a amostra de RNA, para evitar viés de pipetagem. Além disso, realize as reações em duplicata ou triplicata para evitar erros técnicos.
    3. Sele a placa com um selo de placa de PCR adesivo e centrífuga brevemente por 1 min para coletar todo o líquido no fundo da placa. Certifique-se de que cada poço tenha o mesmo volume de líquido e esteja livre de bolhas antes de transferir as amostras para a máquina de qPCR.
      NOTA: Todas as reações de PCR precisam ser configuradas no gelo.
  2. Programa de PCR
    1. Abra o programa da máquina qPCR em tempo real e escolha as seguintes propriedades experimentais:
      O tipo de bloco: Fast 96 poços (0,1 mL)
      Configuração do experimento: curva padrão
      Reagentes: Reagentes TaqMan
      Executar propriedades: Padrão.
    2. Defina todos os alvos gênicos e seu corante repórter conforme apresentado na Tabela 7. Além disso, definir nomes de amostras para cada reação a ser testada para facilitar a análise das curvas de amplificação.
    3. Atribua alvos e amostras ao layout da placa do programa com base na placa de 96 poços.
    4. Defina o seguinte programa de ciclo no instrumento de PCR da seguinte maneira:
      55 °C por 10 min
      40 ciclos: 94 °C por 1 min
      94 °C por 10 s
      68 °C por 10 s
      68 °C por 20 s; aqui adquirem fluorescência.
    5. Transfira a placa para a máquina qPCR em tempo real e coloque-a no suporte garantindo a orientação correta da placa e inicie a corrida.
    6. Escolha o local do arquivo para salvar os dados experimentais.
  3. Análise de dados
    1. É essencial examinar primeiramente as parcelas de amplificação produzidas pelo programa qPCR. Analisar o limite de detecção para avaliar a concentração mínima de RNA que pode ser detectada.
    2. Plotar o log do número de cópias de RNA no eixo x e o valor Ct médio correspondente no eixo y para avaliar a sensibilidade do ensaio. A inclinação e o R2 indicam a confiabilidade e eficiência da reação.

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Resultados

Nos últimos anos, houve avanços significativos na abordagem diagnóstica para detecção de vírus respiratórios comuns por meio de PCR21,22,23,24,25. No entanto, apesar desses avanços, a abordagem multiplexada, que permite detectar vários vírus em um único teste, não foi amplamente implementada, particularmente na plataforma RT-qPCR. Este método foi ...

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Discussão

Há uma pesada carga econômica sobre o sistema de saúde em todo o mundo resultante das altas taxas de infecção e mortalidade devido à disseminação de vírus respiratórios comuns, como as variantes SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivados pelo senso de responsabilidade em aliviar essa carga, percebemos a necessidade de um ensaio diagnóstico rápido, preciso e acessível, como o RT-qPCR, para distinguir en...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah através do financiamento principal e do National Term Grand Challenge (NTGC) para S.M.H.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

Referências

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