Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שתי ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות בדיקה עבור וירוסים נשימתיים נפוצים. הבדיקה הראשונה היא עבור SARS-CoV-2 (N), שפעת A (H1N1 ו- H3N2) ושפעת B. השני הוא עבור SARS-Cov-2 (N) ו- MERS (UpE ו- ORF1a). בדיקות אלה ניתן ליישם בהצלחה בכל מעבדה מיוחדת.

Abstract

תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) הגורמת למחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) מהווה איום חמור על בריאות הציבור הרחב. במהלך עונות השפעת, התפשטות SARS-CoV-2 ונגיפים נשימתיים אחרים עלולה לגרום לעומס כלל האוכלוסייה של מחלות נשימה שקשה להתמודד איתו. לשם כך, יהיה צורך להשגיח בקפידה על הנגיפים הנשימתיים SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ותסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS-CoV) בעונות הסתיו והחורף הקרובות, במיוחד במקרה של SARS-CoV-2, שפעת A ושפעת B, החולקים גורמים אפידמיולוגיים דומים כמו אוכלוסיות רגישות, אופן העברה ותסמונות קליניות. ללא בדיקות ספציפיות למטרה, זה יכול להיות מאתגר להבדיל בין מקרים של וירוסים אלה בשל הדמיון ביניהם. בהתאם לכך, בדיקת מולטיפלקס רגישה וממוקדת שיכולה להבדיל בקלות בין מטרות ויראליות אלה תהיה שימושית עבור אנשי מקצוע בתחום הבריאות. במחקר זה, פיתחנו בדיקה מבוססת PCR בזמן אמת באמצעות ערכת RT-qPCR חד-שלבית שפותחה על ידי R3T לזיהוי סימולטני של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV. עם 10 עותקים בלבד של הרנ"א הסינתטי שלהם, אנו יכולים לזהות בהצלחה מטרות SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- MERS-CoV בו זמנית עם 100% ספציפיות. בדיקה זו נמצאה מדויקת, אמינה, פשוטה, רגישה וספציפית. השיטה שפותחה יכולה לשמש כבדיקת אבחון אופטימלית של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, בדיקת אבחון MERS-CoV בבתי חולים, מרכזים רפואיים ומעבדות אבחון, כמו גם למטרות מחקר.

Introduction

המגיפה של מחלת הקורונה המתמשכת 2019 (COVID-19) נגרמת על ידי נגיף הקורונה החדש המכונה תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2)1. בשל ההדבקה החזקה של SAR-CoV-2 ויכולת ההעברה המהירה, מגיפת COVID-19 הופיעה בעיר ווהאן שבסין והתפשטה במהירות ברחבי העולם. זה הוביל בסופו של דבר לתחילת סימני מצוקה נשימתית ואפילו למוות 2,3,4. COVID-19 הוכרז כמגיפה ביותר מ -213 מדינות, בציפייה לעלייה תלולה במספר המקרים המאומתים, כפי שמעידים המאמרים שפורסמו על ידי מחקרים שונים 3,5. COVID-19 מועבר בעיקר על ידי טיפות נשימה קטנות שאנשים נגועים משחררים לסביבה ולאחר מכן נחשפים לאנשים פגיעים באמצעות שאיפה או מגע קרוב עם משטחים מזוהמים. כאשר טיפות אלה באות במגע עם רירית העיניים, הפה או האף, אדם עלול להידבק6. נתונים סטטיסטיים שפורסמו על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) מראים כי היו יותר מ -76 מיליון מקרים מאושרים של המגיפה ברחבי העולם, עם מדהים 7 מיליון מקרי מוות7. לפיכך, האו"ם סיווג את המגפה הנגרמת על ידי מחלת COVID-19 כאסון בשל השפעתה הישירה על חייהם של מיליארדי אנשים ברחבי העולם והיו לה השפעות כלכליות, סביבתיות וחברתיות מרחיקות לכת.

יוזמות בתחום בריאות הציבור, כולל בדיקות יסודיות, גילוי מוקדם, מעקב אחר מגעים ובידוד מקרים, הוכחו כולן כחיוניות בשמירה על המגיפה הזו תחת שליטה 8,9,10,11. חודשי החורף יגבירו את התפוצה של וירוסים נשימתיים אחרים כמו שפעת A ו- B עם תסמינים דמויי COVID-19 שיקשו על זיהוי, איתור ובידוד מקרי COVID-19 בשלב מוקדם. בכל שנה, התפרצות שפעת A ו- B מתחילה בסוף הסתיו או בתחילת ינואר עם עונתיות צפויה12. תכונות אפידמיולוגיות רבות משותפות לנגיפי SARS-CoV-2 ושפעת. חוץ מזה, שיתוף קווי דמיון באוכלוסיות רגישות הכוללות ילדים, קשישים, מדוכאי חיסון, ואנשים עם תחלואה נלווית כרונית כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, אי ספיקת לב וכליות, או סוכרת12,13. נגיפים אלה חולקים לא רק אוכלוסיות פגיעות אלא גם נתיבי העברה של מגע וטיפות נשימה14. הצפי הוא שחולים עלולים להידבק ביותר מנגיפים נשימתיים אחדים ככל שעונת השפעת מתקרבתל-14. לשם כך, ההקרנה של SARS-CoV-2 ונגיפי השפעת צריכה להיעשות על חולים סימפטומטיים לפני שהם מבודדים. ביצוע בדיקות נפרדות לשלושת הנגיפים (SARS-CoV-2, שפעת A ושפעת B) אינו אפשרי בשל המחסור העולמי במשאבים למיצוי ואבחון חומצות גרעין. כדי לסנן את כולם בתגובה אחת, יש לפתח שיטה או מבחן.

תסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS)-CoV היא בת משפחה של נגיף הקורונה האנושי (CoV). המבודד הראשון של נגיף MERS-CoV הגיע מחולה מאושפז בערב הסעודית שמת בספטמבר 2012 עקב בעיות נשימה חריפות15. ישנן ראיות המצביעות על כך שמארח מאגר בולט עבור MERS-CoV הוא גמלים דרומטריים. הוכח כי וירוסים מגמלים דרומטריים נגועים הם זואונוטיים ולכן יכולים להדביק בני אדם16,17. בני אדם הנגועים בנגיף זה יכולים להפיץ אותו לאחרים באמצעות מגע קרוב18. נכון ל-26 בינואר 2018, היו 2143 מקרים מאושרים במעבדה של זיהום MERS-CoV, כולל 750 מקרי מוות ברחבי העולם,19. תסמיני MERS-CoV האופייניים ביותר הם שיעול, חום וקוצר נשימה. זיהומים MERS-CoV דווחו גם להציג דלקת ריאות, שלשולים ותסמינים של מחלת מערכת העיכול20. נכון לעכשיו, אין חיסון מסחרי או טיפול ספציפי עבור MERS-CoV זמין. לכן, אבחון מהיר ומדויק חיוני למניעת התפרצויות MERS-CoV נרחבות ולהבחנה בין MERS-CoV למחלת SARS-CoV-2.

עד כה, גישות רבות הוצעו כדי לזהות וירוסים אלה כגון multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, ו CRISPR/Cas329, זרימה צידית immunoassay30, חיישנים ביומולקולריים מבוססי נייר31, בדיקת שרלוק בסיר אחד 32, DNA aptamer33, לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (LAMP)19,34 וכו'. לכל אחת מהשיטות הנ"ל יתרונות וחסרונות ייחודיים מבחינת רגישות וספציפיות. בין שיטות אלה, הבדיקה מבוססת הגברה של חומצות גרעין: multiplex qRT-PCR, היא הנפוצה ביותר ונחשבת לתקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- MERS-CoV.

במחקר זה, תכננו והערכנו שילובי פריימר שונים ובדיקות לזיהוי יעיל, מדויק ובו-זמני של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV תוך שימוש ב- RNA נגיפי סינתטי טוויסט סטנדרטי. הבדיקות המרובות שפותחו עבור גני המטרה MERS-CoV או SARS-CoV-2 מומלצות על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO). גנים אלה מקודדים בדרך כלל חלבונים וקומפלקסים התורמים להיווצרות קומפלקס שכפול/שעתוק (RTC)35, כגון האזור בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה 1a (ORF1a) המשמש לבדיקת MERS-CoV. בנוסף, חלבונים מבניים מקודדים על ידי הגנים המשמשים בבדיקות אבחון כגון האזור במעלה הזרם של גן המעטפת (upE) וגן נוקלאוקפסידים (N) המשמשים לבדיקות MERS-CoV ו- SARS-Cov-2, בהתאמה35,36. השתמשנו בערכת RT-qPCR חד-שלבית R3T כדי להקים את RT-qPCR לזיהוי וירוסים37. זיהוי וירוסים, רגישות, ספציפיות וטווח דינמי של ערכת RT-qPCR בצעד אחד R3T וערכות פריימר נבדקו והוערכו באמצעות דילולים סדרתיים פי 10 של RNA סינתטי עם טוויסט סטנדרטי. מגבלת הזיהוי המעשית הנמוכה ביותר הייתה כ-10 עותקי תמלילים לכל תגובה. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בהצלחה בערכת RT-qPCR החד-שלבית R3T ובערכות פריימר/בדיקה וליישום לאבחון שגרתי בו זמנית של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. ביטוי וטיהור Taq פולימראז

  1. בנו פלסמיד עם תג הקסה-היסטידין ב-C-terminus של האנזים.
  2. המר 50 ננוגרם של וקטור הביטוי לזן E. coli BL21-(DE3) בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי38.
  3. חסן את התאים שעברו טרנספורמציה בארבע צלוחיות 6 L שכל אחת מהן מכילה 2 L של מרק מדיה 2YT ב 37 ° C עם ניעור ב 170 סל"ד עד OD 600 של 0.8 או מספר תא 6.4 x 108 הוא הגיע.
  4. לגרום לביטוי Taq פולימראז עם 0.5 mM של isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) ולדגור עוד יותר ב 16 ° C במשך 18 שעות עם רעיד.
  5. קצור את התאים על ידי סיבובם ב 4 ° C ב 7808 x גרם במשך 10 דקות. יש להשהות מחדש את הכדוריות ב-200 מ"ל של חיץ Taq פולימראז ליזיס קר כקרח (טבלה 1) ב-5 מ"ל/גרם של כדורי תא.
  6. לדגור על התאים עם ליזואנזים (2 מ"ג / מ"ל של חיץ ליזיס) ומעכבי פרוטאז במשך 45 דקות ולאחר מכן להעביר את הליזט דרך משבש תאים ב 30 kPsi וצנטריפוגה ב 22,040 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את פסולת התא.
  7. חממו את הסופרנאטנט במשך 15 דקות בטמפרטורה של 85°C. סחרור כלפי מטה ב- 95,834 x גרם למשך שעה אחת ב- 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט וסננו אותו על קרח באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר.
  8. בצע טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר (FPLC) על-ידי העברת הדגימה תחילה דרך עמודת Ni-NTA HP 5 מ"ל בקצב זרימה של 4 מ"ל/דקה באמצעות מאגר Taq פולימראז A (טבלה 2; איור 1A).
  9. יש לשטוף עם 10 נפחי עמודות (CV) של מאגר Taq פולימראז A ו-4% של מאגר Taq פולימראז B (טבלה 2). יש להקפיד על החלבון הכבול בשיפוע ליניארי באמצעות Taq polymerase Buffer B מעל 20 CV בבקבוק של 100 מ"ל.
  10. מעבירים את המטען בבקבוק 100 מ"ל דרך עמוד חילופי קטיונים 5 מ"ל ב-4 מ"ל/דקה באמצעות חיץ Taq פולימראז C (טבלה 2; איור 1A).
  11. יש לשטוף עם 20 CV של 100% Taq פולימראז חיץ C ו-5% Taq פולימראז חיץ D (טבלה 2).
  12. Elute עם שיפוע ליניארי באמצעות Taq פולימראז חיץ D (טבלה 2) החל מ 5% עד 100%.
  13. בדוק את השברים המדוללים על ידי ביצוע אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE 39 ואחריה צביעת ג'ל 40 כפי שתואר קודם לכן. בקצרה, קח 10 μL מכל שבר והוסף נפח שווה של 2x SDS טעינת צבע. נטרל את הדגימה ב 90oC במשך 10 דקות. טען את הדגימות על ג'ל 10% SDS-PAGE והפעל את הג'ל במשך 25 דקות ב 200 V. לצבוע את הג'ל באמצעות Coomassie Brilliant Blue ולאחר מכן להסיר כתמים.
  14. אסוף את כל השברים המכילים Taq פולימראז מטוהר ודיאליזה כנגד מאגר אחסון Taq פולימראז (טבלה 3) ב-4°C. בקצרה, הכינו 2 ליטר של מאגר האחסון וטבלו את קלטת הדיאליזה במאגר למשך 2 דקות כדי להתייבש. הזריקו את השברים שנאספו באמצעות מחט לתוך קלטת הדיאליזה והשאירו אותה למשך הלילה במאגר הדיאליזה במהירות 200 סל"ד על הבוחש.
  15. לאחר הדיאליזה, למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר, לעשות 10 μL aliquots, הצמד להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C.
    הערה: סנן את כל המאגרים לטיהור באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר לפני טעינתם למערכת FPLC.

2. ביטוי MMLV-RT במערכת ביטוי תאי חרקים וטיהור

  1. יצירת DNA Bacmid ובידוד
    1. שכפל את הרצף של MMLV-RT עם תג TEV-8xHis-Strep הניתן לפיצול C-terminus כפי שתואר קודם41.
    2. ערבבו 100 ng של וקטור הביטוי לתוך 50 μL של תאי DH10Bac וערבבו בעדינות על ידי הקשה על הצינור.
    3. דוגרים על התאים על קרח במשך 15 דקות. הלם חום את התאים למשך דקה אחת ב 42 ° C.
    4. מעבירים מיד על קרח ומוסיפים 400 μL של מדיום S.O.C. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם טלטול במשך 4 שעות.
    5. צלחת 10 μL ו 15 μL של תערובת על צלחות אגר LB המכילות שלוש אנטיביוטיקה; 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין ו-7 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין יחד עם IPTG 40 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל X-Gal לבחירת כחול-לבן.
    6. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 48 שעות. בחרו מספר מושבות לבנות ומושבה כחולה אחת כבקרה, ופזרו אותן מחדש על צלחות אגר LB טריות המכילות את האנטיביוטיקה הנ"ל. לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).
    7. לאחר אישור הפנוטיפ הלבן, בחר כמה מושבות וחסן אותן לתוך 10 מ"ל של מדיה LB המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל Kanamycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, ו 7 מיקרוגרם / מ"ל Gentamicin בצינורות 50 מ"ל.
    8. לדגור על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-170 סל"ד למשך הלילה. גלולה למטה את התאים על ידי סיבוב אותם למטה ב 22,040 x גרם במשך 10 דקות.
    9. דקנו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בתמיסת השעיה של 250 מיקרוליטר מערכת miniprep (יש לטפל בתמיסה זו בהתאם להוראות היצרן), ולאחר מכן העבירו את התמיסה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    10. מוסיפים 250 μL של תמיסת ליזיס, מערבבים בעדינות ודוגרים במשך 3 דקות. הוסף 350 μL של תמיסה מנטרלת, הפוך 2x-3x וצנטריפוגה ב 22,040 x g למשך 10 דקות.
    11. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי ומוסיפים נפח שווה של איזופרופנול קר כקרח ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של -20°C.
    12. גלולה למטה את הדנ"א המואץ על ידי סיבוב ב 22,040 x גרם במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 700 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח, פי 2.
    13. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה בלי לגעת בכדור. תנו לאוויר הכדורי להתייבש במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך 5-10 דקות או עד שלא נראה נוזל בצינור. ממיסים את הגלולה ב-100 μL של חיץ EB.
  2. התפשטות Bacmid והגברת וירוסים
    1. הכנת וירוס P1
      1. בצלחת תרבית רקמה 6 בארות, זרע ~ 9 x 105 תאים / באר ב 2 מ"ל של מדיום תרבית תאי חרקים.
      2. לדגור על הצלחת במשך ~ 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתחבר.
      3. הכינו תערובת Bacmid/Fugene באופן הבא: ערבבו 1 מיקרוגרם של DNA Bacmid ו-300 μL של מדיה של תאי חרקים בצינור אחד. בצינור אחר, מערבבים 8 μL של מגיב transfection ו 300 μL של מדיה תאי חרקים. מערבבים את שתי התערובות על ידי פיפטינג עדין ומשאירים למשך ~30 דקות בטמפרטורת החדר ליצירת קומפלקס מגיב הבקמיד/טרנספקציה.
      4. מוסיפים תערובת תרכובת בקמיד (~ 210 μL) לכל באר ואוטמים את הצלחת בסרט שקוף.
      5. לדגור את הצלחת ב 27 ° C במשך 3-4 ימים.
      6. קח את המדיום המכיל את הנגיף, הוסף FBS (ריכוז סופי 2%), סנן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר ואחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך כמו מלאי וירוס P1.
    2. הכנת וירוס P2
      1. Transfect 50 מ"ל של תאי חרקים ב 2 x 106 תאים / מ"ל עם 3 מ"ל של וירוס P1 בבקבוק תרבית.
      2. דוגרים ב-27 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-100 סל"ד במשך 4-6 ימים עד שאחוז התאים המתים מגיע ל-25%-30%.
      3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant המכיל את הנגיף.
      4. הוסף FBS לריכוז סופי של 2%, סנן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר ו- aliquot 1 מ"ל כל אחד ואחסן ב -80 ° C כמלאי וירוס P2.
    3. הכנת וירוס P3
      1. Transfect 100 מ"ל של תאי חרקים ב 2 x 106 תאים / מ"ל עם 2 מ"ל של וירוס P2 בבקבוק תרבית.
      2. דוגרים ב-27 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-100 סל"ד למשך 3-4 ימים עד שאחוז התאים המתים מגיע ל-15%-20%.
      3. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant המכיל את הנגיף.
      4. הוסף FBS לריכוז סופי של 2%. סנן דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. זה יכול להיות מאוחסן בחושך ב 4 °C (75 °F) במשך חודש אחד.
  3. ביטוי וטיהור MMLV-RT בתאי חרקים
    1. הוסף 5 מ"ל של וירוס P3 לתאי חרקים טריים בצפיפות של 2 x 106 תאים/מ"ל (700 מ"ל / 2L צלוחיות) בסך הכל 6 צלוחיות.
    2. קצור את התאים לאחר 55-60 שעות של לאחר transfection על ידי מסתובב ב 7808 x גרם במשך 10 דקות.
    3. השהה מחדש את כדורי התא ב- 200 מ"ל של מאגר ליזיס MMLV-RT (טבלה 4). העבירו את הליזט דרך משבש תאים ב-15 kPsi וצנטריפוגה ב-22,040 x גרם למשך 30 דקות ב-4°C.
    4. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חדשים ומסתובבים שוב למטה ב-95,834 x גרם ב-4°C למשך שעה אחת. אספו את הסופרנאטנט וסננו אותו על קרח באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר.
    5. התחל טיהור חלבונים באמצעות FPLC על-ידי העברת הדגימה תחילה דרך עמודת Ni-NTA Excel 5 mL (איור 1B) בקצב זרימה של 4 מ"ל/דקה באמצעות מאגר MMLV-RT A (טבלה 5).
    6. שטפו את העמודה עם 10 CV של MMLV-RT חיץ A ו-4% של MMLV-RT חיץ B (טבלה 5) והדפו את החלבון עם השיפוע הליניארי של MMLV-RT buffer B מעל 20 CV בבקבוק של 100 מ"ל.
    7. העבירו את הדגימה המדוללת דרך עמודת Strep 5 mL (איור 1B) המקבילה למאגר MMLV-RT C (טבלה 5).
    8. שטפו את העמודה עם 10 CV של 100% MMLV-RT חיץ C והדפו את החלבון עם שיפוע ליניארי עם 20 CV של חיץ D (טבלה 5).
    9. בדוק את השברים המדוללים על-ידי ביצוע SDS-PAGE כפי שנעשה בשלבים 1.13.-1.14. ואסוף את השברים המכילים MMLV-RT מטוהר לחייג כנגד מאגר אחסון MMLV-RT (טבלה 6) ב- 4 ° C.
    10. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות Nanodrop, aliquot, להקפיא הצמד בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C.
      הערה: סנן את כל המאגרים לטיהור באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר לפני טעינתם למערכת FPLC.

3. הכנת רכיבי ערכת RT-qPCR מולטיפלקס R3T בצעד אחד

  1. הכנת תערובת חיץ
    1. הכן את מאגר 2x לתגובת RT-qPCR המכיל את הריאגנטים שהוצגו קודם לכן ב-37. הכינו את כל הריאגנטים במים נטולי DNase/RNase ואת תערובת החיץ המאוחסנת במקפיא של -20°C.
  2. ערכות פריימר ובדיקה והכנת תערובת פריימרים
    הערה: הבדיקות והפריימרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 7. ערכת המרובבים Influenza ו- SARS-CoV-2 מכילה 3 בדיקות ו -4 ערכות פריימר קדימה ואחורה. הגשושיות מסומנות בקצוות 5′ באמצעות כתבים 6-carboxyfluorescein (FAM) עבור InfA, טקסס Red-XN עבור SARS-CoV-2 (גן N) ויאקימה צהוב עבור InfB. ערכת המרובבים MERS-CoV ו- SARS-CoV-2 מכילה 3 בדיקות ו -3 ערכות פריימר קדימה ואחורה. הגשושיות מסומנות גם בקצוות 5′ באמצעות כתבים Texas Red-XN עבור MERS-CoV (גן ORF1a), VIC עבור MERS-CoV (גן UpE) ו-6-carboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (גן N).
    1. הכינו תערובת פריימר המכילה את כל הפריימרים והגשושיות המפורטים בטבלה 7 עם ריכוז סופי של 6.7 מיקרומטר לכל פריימר קדימה ואחורה ו-1.25 מיקרומטר לכל בדיקה בצינור של 1.5 מ"ל. אחסנו את תערובת הפריימר במקפיא בטמפרטורה של -20°C. השתמש במאגר elution כדי לפצות על עוצמת הקול הנדרשת.
  3. הכנת תערובת אנזימים
    1. הכינו תערובת אנזימים Taq פולימראז (30 U/μL) ו-MMLV-RT (60 ng/μL) במאגר האחסון Taq polymerase כפי שמוצג בטבלה 3 כדי להשלים את הנפח הנדרש. בצעו שלב זה על קרח ואחסנו את תערובת האנזימים בטמפרטורה של -20°C.
  4. תבנית RNA
    1. השהה מחדש RNA סינתטי של SARS-CoV-2, שפעת A H1N1, שפעת A H3N2, שפעת B ו- MERS-CoV בנפרד ב- 100 μL של חיץ Tris-EDTA 1x (10 mM Tri-Cl ו- 1 mM EDTA (pH 8.0) כדי ליצור מלאי של 1 x 106 עותקי RNA / μL.
    2. ערבבו רנ"א סינתטי עבור RT-qPCR בתצורות הבאות: 1) SARS-CoV-2, שפעת A ושפעת B על ידי הוספת 5 μL מכל מלאי וירוסים לנפח 50 μL כדי ליצור 1 x 105 עותקי RNA / μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV על ידי הוספת 5 μL מכל מלאי וירוסים לנפח 50 μL כדי ליצור 1 x 105 עותקי RNA / μL. בצע דילולים סדרתיים פי 10 מכל תערובת RNA סינתטית החל מ- 1 x 105 עותקי RNA / μL ועד 10 עותקי RNA / μL.
      הערה: הקפד להשתמש במים קרים כקרח ללא DNase/RNase כדי להכין את הדילול הסדרתי של התבניות.

4. בתוך הבית מרובה SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV שלב אחד בדיקת RT-qPCR

הערה: יש לחטא משטחי תחנת עבודה ולהשתמש בתבנית צלחת של 96 בארות כדי לתכנן את פריסת לוחית ה-PCR.

  1. הכנת צלחת 96 באר
    1. הפשירו 2x חיץ ותערובת פריימר. יש לשמור את תערובת האנזימים על קרח.
    2. לכל באר, הוסף 10 μL של 2x תערובת חיץ, 1.5 μL של תערובת פריימר, 1 μL של תערובת אנזימים, 6.5 μL של מים ללא DNase/RNase, ו 1 μL של תערובת RNA המתאימה שיש לבדוק. הנפח הסופי בכל באר הוא 20 μL. עיין בפריסה שהוכנה לקבלת עזרה בשלב זה.
      הערה: מומלץ להכין תערובת מאסטר המבוססת על מספר התגובות המכילות את כל הריאגנטים למעט דגימת הרנ"א כדי למנוע הטיית פיפטינג. בנוסף, בצע את התגובות כפולות או משולשות כדי למנוע שגיאות טכניות.
    3. אטמו את הצלחת עם חותם לוחית PCR דביק וצנטריפוגה למשך דקה אחת כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצלחת. ודא כי כל באר יש את אותו נפח של נוזל והוא ללא בועות לפני העברת הדגימות למכונת qPCR.
      הערה: כל תגובות ה-PCR צריכות להיות מוגדרות על קרח.
  2. תוכנית PCR
    1. פתח את תוכנית מכונת qPCR בזמן אמת ובחר את מאפייני הניסוי הבאים:
      סוג הבלוק: מהיר 96-באר (0.1 מ"ל)
      הגדרת ניסוי: עקומה סטנדרטית
      ריאגנטים: ריאגנטים TaqMan
      הפעל מאפיינים: רגיל.
    2. הגדר את כל מטרות הגן ואת צבע המדווח שלהן כפי שמוצג בטבלה 7. בנוסף, הגדר שמות מדגם עבור כל תגובה כדי להיבדק לניתוח קל יותר של עקומות ההגברה.
    3. הקצה יעדים ודוגמאות לפריסת הלוחות של התוכנית בהתבסס על לוח 96 הקידוחים.
    4. הגדר את תוכנית המחזור הבאה במכשיר ה- PCR באופן הבא:
      55 °C למשך 10 דקות
      40 מחזורים: 94°C למשך דקה אחת
      94°C למשך 10 שניות
      68°C למשך 10 שניות
      68 °C עבור 20 שניות; כאן לרכוש פלואורסצנטיות.
    5. העבר את הצלחת למכונת qPCR בזמן אמת והנח אותה במחזיק תוך הבטחת הכיוון הנכון של הצלחת והתחל את הריצה.
    6. בחר את מיקום הקובץ כדי לשמור את הנתונים הניסיוניים.
  3. ניתוח נתונים
    1. חיוני לבחון תחילה את חלקות ההגברה המיוצרות על ידי תוכנית qPCR. נתח את גבול הזיהוי כדי להעריך את ריכוז ה- RNA המינימלי שניתן לזהות.
    2. התווה את היומן של מספר העתק RNA על ציר x ואת ערך ה- Ct הממוצע המתאים על ציר y כדי להעריך את רגישות הבדיקה. המדרון וה- R2 מצביעים על האמינות והיעילות של התגובה.

תוצאות

בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בגישת האבחון לאיתור נגיפים נשימתיים נפוצים בגישותPCR 21,22,23,24,25. עם זאת, למרות התקדמות זו, גישת המרובב, המאפשרת זיהוי וירוסים מרובים בבדיקה אחת, לא יושמה באופן נרחב, ב?...

Discussion

קיים נטל כלכלי כבד על מערכת הבריאות בעולם כתוצאה משיעורי ההדבקה והתמותה הגבוהים עקב התפשטות וירוסים נשימתיים נפוצים כגון SARS-CoV-2, שפעת A/B וגרסאות MERS-CoV 12,19,20. מתוך תחושת אחריות להקלת נטל זה, הבנו את הצורך בבדיקת אבחון מהירה, מדויקת ונגישה כגו...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה באמצעות מימון ליבה והאתגר הגדול של המונח הלאומי (NTGC) ל- S.M.H.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201TaqMMLV RTCOVID 19SARS CoV 2A BMERS CoVRT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved