Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV

Zusammenfassung

Wir präsentieren zwei sondenbasierte, einstufige RT-qPCR-Kits für gängige Atemwegsviren. Der erste Test ist für SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 und H3N2) und Influenza B. Die zweite ist für SARS-Cov-2 (N) und MERS (UpE und ORF1a). Diese Assays können in jedem spezialisierten Labor erfolgreich implementiert werden.

Zusammenfassung

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit der Bevölkerung dar. Während der Grippesaison kann die Ausbreitung von SARS-CoV-2 und anderen Atemwegsviren zu einer bevölkerungsweiten Belastung durch Atemwegserkrankungen führen, die schwer zu bewältigen ist. Dazu müssen die Atemwegsviren SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und das Middle East Respiratory Syndrome (MERS-CoV) in der kommenden Herbst- und Wintersaison sorgfältig überwacht werden, insbesondere im Fall von SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B, die ähnliche epidemiologische Faktoren wie anfällige Bevölkerungsgruppen, Übertragungswege und klinische Syndrome aufweisen. Ohne zielspezifische Assays kann es aufgrund ihrer Ähnlichkeiten schwierig sein, zwischen Fällen dieser Viren zu unterscheiden. Dementsprechend wird ein sensitiver und zielgerichteter Multiplex-Assay, der diese viralen Ziele leicht unterscheiden kann, für Ärzte nützlich sein. In dieser Studie haben wir einen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR-basierten Assay entwickelt, der ein intern entwickeltes einstufiges R3T-RT-qPCR-Kit für den gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, verwendet. Mit nur 10 Kopien ihrer synthetischen RNAs können wir SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und MERS-CoV-Ziele gleichzeitig mit 100%iger Spezifität identifizieren. Dieser Assay erweist sich als genau, zuverlässig, einfach, empfindlich und spezifisch. Die entwickelte Methode kann als optimierter SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und SARS-CoV-2-, MERS-CoV-Diagnosetest in Krankenhäusern, medizinischen Zentren und diagnostischen Laboren sowie zu Forschungszwecken eingesetzt werden.

Einleitung

Die Pandemie der anhaltenden Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das neuartige Coronavirus verursacht, das als schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)¹ bekannt ist. Aufgrund der starken Ansteckungsfähigkeit und der Fähigkeit von SAR-CoV-2 zur schnellen Übertragung entstand die COVID-19-Pandemie in der Stadt Wuhan, China, und breitete sich schnell auf der ganzen Welt aus. Dies führte schließlich zum Auftreten von Atemnotsymptomen und sogar zum Tod ^2,3,4. COVID-19 wurde in mehr als 213 Ländern zur Pandemie erklärt....

Protokoll

1. Taq-Polymerase-Expression und -Reinigung

1. Konstruieren Sie ein Plasmid mit einem spaltbaren Hexa-Histidin-Tag am C-Terminus des Enzyms.
2. Transformieren Sie 50 ng des Expressionsvektors in den Stamm E. coli BL21-(DE3) gemäß dem Standardprotokoll³⁸.
3. Die transformierten Zellen werden in vier 6-l-Kolben mit je 2 l 2YT-Medienbrühe bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inokuliert, bis der OD 600 von 0,8 oder die Zellnummer 6,4 x 10⁸ erreicht ist.
4. Die Taq-Polymerase-Expression wird mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und bei 16 °C für 18 h unter ....

Diskussion

Aufgrund der hohen Infektions- und Sterblichkeitsraten aufgrund der Ausbreitung gängiger Atemwegsviren wie SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV-Varianten 12,19,20 besteht weltweit eine hohe wirtschaftliche Belastung für das Gesundheitssystem. Motiviert durch das Verantwortungsbewusstsein, diese Belastung zu verringern, erkannten wir die Notwendigkeit eines schnellen, präzisen und zugänglichen diagnostischen Assays wie RT-q.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter cups	Thermo Scientific	291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer	Novex	LC2675
6-well tissue culturing plates	Corning	353046
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	A701-3
Ampicillin	Corning	61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL	Cytiva	17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%	Thermo Scientific	A14207.60
DH10Bac competent cells	Fisher Scientific	10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)	Thermo Scientific	68100
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water	Ambion	AM9930
dNTPs	Thermo Scientific	R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells	Invitrogen	C600003
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Elution Buffer	Qiagen	19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)	Expression Systems	96-001-01
FBS Solution	Gibco	A38400-01
Fugene (transfection reagent)	Promega	E2311
Gentamicin	Fisher Scientific	15750060
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-500
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896-100ml
Imidazole	Sigma Aldrich	56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA	Twist Bioscience	103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA	Twist Bioscience	103002
Influenza B synthetic RNA	Twist Bioscience	103003
IPTG	Gold Biotechnology	I3481C100
Kanamycin	Gibco	11815-032
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB Broth media	Fisher Scientific	BP1426-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-10G
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA	Twist Bioscience	103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1093
Miniprep kit	Qiagen	27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL	Cytiva	17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL	Cytiva	17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free	Applied Biosystems	4311971
Potassium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-1
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein marker	Fermentas	26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)	Applied Biosystems
S.O.C medium	Fisher Scientific	15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA	Twist Bioscience	102024
Sf9 insect cells	Gibco	A35243
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL	Cytiva	29401323
Tetracycline	IBI Scientific	IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris-HCl	Affymetrix	22676
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379-100ml
X-Gal	Invitrogen	B1690