JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إعدادا لتبلور ناقل الستيرول ABCG5 / G8. يتم إعادة تشكيل ABCG5 / G8 إلى ثنائيات للتبلور المعلق والقطرة. لا يتطلب البروتوكول مواد أو ركائز متخصصة ، مما يجعله متاحا وسهل التكيف في أي مختبر لتحديد بنية البروتين من خلال علم البلورات بالأشعة السينية.

Abstract

تشكل ناقلات الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) بروتينات غشائية مدمجة في الدهون. عادة ما يتم استخراج هذه البروتينات الغشائية من طبقة الدهون المزدوجة إلى بيئة مائية عن طريق استخدام المنظفات. تعمل هذه المنظفات على تفكيك طبقة الدهون المزدوجة وإذابة البروتينات. يشكل الموائل الجوهرية للبروتينات الغشائية داخل الطبقة الثنائية الدهنية تحديا في الحفاظ على استقرارها وتوحيدها في محلول التوصيف الهيكلي. Bicelles ، التي تتكون من مزيج من الدهون الفوسفاتية طويلة وقصيرة السلسلة والمنظفات ، تكرر بنية الدهون الطبيعية. يعمل استخدام bicelles الدهنية والمنظفات كنظام نموذجي مناسب للحصول على بلورات حيود عالية الجودة ، وتحديدا لتحديد البنية عالية الدقة لبروتينات الغشاء. من خلال هذه البيئات الدقيقة الاصطناعية ، تحافظ البروتينات الغشائية على شكلها ووظائفها الأصلية ، مما يسهل تكوين بلورات ثلاثية الأبعاد. في هذا النهج ، تم إعادة دمج ABCG5 / G8 غير المتجانس القابل للذوبان في المنظفات في ثنائي DMPC / CHAPSO ، مع استكمال الكوليسترول. تم استخدام هذا الإعداد في الإجراء التجريبي لنشر البخار لبلورة البروتين.

Introduction

تشكل ناقلات الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) عائلة فائقة من البروتينات الغشائية المسؤولة عن عمليات النقل المتنوعة المعتمدة على ATP عبر الأغشية البيولوجية1،2،3،4،5. هذه البروتينات الناقلة متورطة في أمراض القلب والأوعية الدموية وتلعب دورا مهما في تسهيل تدفق الكوليسترول إلى الصفراء لإفرازه لاحقا في الكبد. وبالتالي ، حظي استقلاب الكوليسترول والتوازن باهتمام كبير على مر السنين6. تتضمن آلية محددة تشارك في التخلص من الكوليسترول والستيرول الآخر من الجسم أعضاء من فصيلة ABCG البشرية ، ولا سيما ABCG5 / G8 غير المتجانسة7،8،9،10. تؤدي الطفرات في أي من هذه الجينات إلى تعطيل المغاير ، مما يؤدي إلى فقدان الوظيفة والتسبب في سيتوستيروليميا ، وهو اضطراب يؤثر على الاتجار بستيرول11،12،13. نظرا لأهمية المرض ودوره في تعزيز تدفق الكوليسترول ، جذبت ناقلات الستيرول اهتماما كبيرا. ومع ذلك ، فإن التفاصيل المعقدة لآليتها الجزيئية وانتقائية الركيزة لا تزال غير معلنة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توضيح البنية البلورية ل ABCG5 / G8 هو خطوة حاسمة نحو فهم الآليات ووظائف المصب في نقل الكوليسترول.

تتطلب البروتينات الغشائية التثبيت داخل الأغشية لتطوى وتعمل بشكل صحيح. وبالتالي ، فإن استخراج البروتينات الغشائية من بيئتها الطبيعية غالبا ما يؤدي إلى عدم استقرار البروتين ، واختلال طيه ، وفقدان الوظيفة14,15. تؤكد هذه التحديات على العقبات الأساسية التي تواجه تبلور البروتين الغشائي. ومع ذلك ، فإن إعادة تكوين البروتينات إلى طبقات ثنائية من المنظفات الاصطناعية ، مثل bicelles ، قد ظهرت كحل لهذا المأزق ، مما يتيح الحفاظ على بروتينات الغشاء داخل بيئة ثنائية الطبقة تشبه السكانالأصليين 16. Bicelles عبارة عن مجموعات من الدهون الفوسفاتية الاصطناعية والمنظفات المعلقة والقابلة للذوبان في الماء. والجدير بالذكر أنهم يتبنون بنية ثنائية الطبقة تحاكي الأغشية البيولوجية16،17،18. يمكن أن تنتقل Bicelles بين المراحل السائلة والجل بناء على درجة الحرارة واللزوجة. يستفيد تبلور Bicelle من الأقراص ثنائية الطبقة الصغيرة واللزوجة المنخفضة في درجات حرارة منخفضة ، مما يسهل الخلط الشامل للبروتينات والمحاليل ثنائية السيل. يعتمد حجم البيسيلات على نسبة المنظفات إلى الدهون أثناء التحضير19,20. تشمل المنظفات السائدة لتكوين ثنائي الخلية 3- [(3-كولاميدو بروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -2-هيدروكسي-1-بروبان سلفونات (CHAPSO) ، جنبا إلى جنب مع 3- [(3-كولاميدو بروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -1-بروبان سلفونات (CHAPS) و 1،2-ديتريديكانويل-sn-جلسرينول-3-فوسفوكولين (DHPC) 21. تستخدم هذه المنظفات جنبا إلى جنب مع الدهون مثل دي ميريستويل-فوسفاتيديل كولين (DMPC) و 1-بالميتويل-2-أوليويل-فوسفاتيديل كولين (POPC). علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة الوظائف الكاملة للبروتينات الغشائية داخل bicelles في ظل الظروف الفسيولوجية. على سبيل المثال ، نجح لي وزملاؤه في بلورة البنية البلورية ل ABCG5 / ABCG8 والإبلاغ عنها بناء على طبقة ثنائية دهنية22,23. في عملية التبلور ، يمكن استيعاب مخاليط البروتين ثنائي الخلية باستخدام المعدات القياسية ، بما في ذلك روبوتات التبلور عالية الإنتاجية24. ومع ذلك ، فإن جدوى استخدام bicelles تتوقف على الثبات الحراري للبروتينات بسبب ظروف التبلور في درجات حرارة أعلى. ومع ذلك ، عند مقارنتها بالتقنيات الأخرى ، تظل ظروف التبلور المطلوبة للبروتينات الغشائية خفيفة بشكل عام ، بما في ذلك تركيزات منخفضة من المادة المرسبة والملح والعازلة. وهذا يجعل كلا من مخاليط البروتين ثنائي الخلية ونشر البخار أدوات فعالة وسهلة التنفيذ للدراسات الهيكلية للبروتينات الغشائية.

يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية في تحضير البروتين وتبلور ثنائي الخلية لتحديد البنية البلورية للأشعة السينية ل ABCG5 / G8 بدقة عالية (الشكل 1).

Protocol

1. الاستنساخ والتعبير عن البروتين

  1. استنساخ جين ABCG5 / G8 البشري في خميرة Pichia pastoris باتباع البروتوكولات السابقة25,26. باختصار ، اشتق متجهات التعبير pSGP18 و pLIC من pPICZB. أضف علامة تشفر موقع الأنزيم البروتيني 3C لفيروس الأنف متبوعا بببتيد ربط الكالمودولين (CBP) إلى المحطة C ل ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. أضف علامة ستة هستيدين مفصولة بجليكاين (6GlyHis6) إلى المحطة C ل ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). شارك في تحويل البلازميدات إلى سلالة Pichia KM71H باستخدام التثقيب الكهربائي.
      ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد للحصول على تفاصيل البلازميدات والوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة.
    2. تنمو خلايا الخميرة المحولة على ألواح أجار MD عند 28 درجة مئوية.
  2. بعد 1-2 أيام ، حدد 10-12 مستعمرة وقم بتلقيحها في 10 مل من الحد الأدنى من وسائط قاعدة النيتروجين خميرة الجلسرين (MGY) باستخدام أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل للثقافة على نطاق صغير.
    1. اصنع ثلاثة ثقوب صغيرة في غطاء أنبوب الطرد المركزي لتحسين التهوية. اسمح للخلايا بالنمو عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) إلى 10 ، وعادة ما تستغرق 1-2 بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يستغرق نمو الخلايا عادة ما بين 12-24 ساعة.
  3. في اليوم التالي ، خذ 1 لتر من وسائط MGY المعقمة وقم بتلقيحها بالمزرعة الأولية في قارورة سعة 2.4 لتر. احتضان القارورة عند 28 درجة مئوية في حاضنة شاكر عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
    1. للحفاظ على درجة الحموضة بين 5-6 ، أضف 10٪ هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH) حتى يستقر الرقم الهيدروجيني.
  4. اضبط الأس الهيدروجيني وحث التعبير البروتيني بإضافة 1 مل من الميثانول النقي لكل مزرعة 1 لتر (0.1٪ (v / v) ميثانول).
    ملاحظة: تغذية الخلايا بعد ذلك ب 5 مل من الميثانول النقي لكل لتر (0.5٪ (v / v) ميثانول) كل 12 ساعة لمدة إجمالية تتراوح بين 36-48 ساعة.
  5. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. اجمع كريات الخلايا وأعد تعليقها في محلول التحلل (0.33 M سكروز ، 0.3 M Tris-Cl pH 7.5 ، 0.1 M حمض أمينوهيكسانويك ، 1 mM EDTA ، و 1 mM EGTA) إلى تركيز 0.5 جم / مل. قم بتخزين التعليق في درجة حرارة -80 درجة مئوية. عادة ، يمكن للمرء استعادة 30 ± 5 غرام من كتلة الخلية من 1 لتر من الخلايا المستزرعة.
    ملاحظة: قم بتخزين كريات الخلايا مباشرة في الفريزر أو قم بإجراء إعادة تعليق فورية في مخزن التحلل المؤقت لتحضير الغشاء.

2. إعداد الغشاء الميكروسومي

  1. قم بإذابة الخلايا وإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (2 ميكروغرام / مل ليوبتين ، 2 ميكروغرام / مل بيبستاتين أ ، 2 مللي متر PMSF ، انظر جدول المواد).
    1. لمزيد من خلايا التحلل ، استخدم مستحلب مبرد بالثلج أو ميكروفلويديزيد (انظر جدول المواد) عند 25000-30000 رطل / بوصة مربعة. كرر هذه العملية 3-4 مرات.
    2. أجهزة الطرد المركزي لإزالة حطام الخلايا: تدور بسرعة 3500-4000 × غرام لمدة 15 دقيقة ، تليها دورة ثانية عند 15000 × غرام لمدة 30 دقيقة. حافظ على كلتا الدورتين عند 4 درجات مئوية.
  2. لعزل الحويصلات الغشائية الميكروسومية ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة وأخضعها للطرد المركزي الفائق عند 2،00،000 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    1. أعد تعليق حبيبات الغشاء في 50 مل من المخزن المؤقت A (50 mM Tris-Cl pH 8.0 و 100 mM NaCl و 10٪ glycerol) باستخدام خالط dounce. قم بتخزين التعليق في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

3. إعداد البروتين تنقية من heterodimers

  1. قم بإذابة الأغشية الميكروسومية المجمدة ، واضبط التركيز على 4-6 مجم / مل باستخدام محلول الذوبان. يجب أن يحتوي المخزن المؤقت على 50 مللي مول Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ، و 10٪ من الجلسرين ، و 1٪ (وزن / حجم) β-دوديسيل مالتوسيد (β-DDM) ، و 0.5٪ (وزن / حجم) كولات ، و 0.1٪ (وزن / حجم) كوليستيريل هيميسوتشينات (CHS) ، و 5 مللي مول إيميدازول ، و 5 مللي مول β-ميركابتوإيثانول (β-ME) ، و 2 ميكروغرام / مل ليوبتين ، و 2 ميكروغرام / مل بيبستاتين أ ، و 2 مللي مول PMSF (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن للمرء خلط كميات متساوية من إعداد الغشاء ومخزن الذوبان ، أو استخدام مخزن مؤقت للذوبان 2x بدون مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل الاختزال. يساعد الغليان القصير للمخزن المؤقت على إذابة CHS بكفاءة. للتنقية، استخدم فقط المخزن المؤقت المبرد بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
    1. يقلب المزيج بسرعة متوسطة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. اتبع هذا مع التقليب الإضافي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20-30 دقيقة.
    2. الطرد المركزي الخليط عند 1،00،000 × غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الأغشية غير القابلة للذوبان. اجمع المادة الطافية القابلة للذوبان وأضف 20 مللي متر إيميدازول و 0.1 مللي متر TCEP.
  2. قم بإجراء كروماتوغرافيا عمود التقارب26: اربط المادة الطافية القابلة للذوبان بخرز Ni-NTA المتوازن مسبقا (10-15 مل) (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت A (الخطوة 2.2.1) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تجنب استخدام الجلسرين في تشغيل المخازن المؤقتة من هذه النقطة فصاعدا.
    1. اغسل العمود مرتين بأحجام 10 أعمدة من المخزن المؤقت B (50 mM HEPES ، الأس الهيدروجيني 7.5 ، 100 mM NaCl ، 0.1٪ (w / v) β-DDM ، 0.05٪ (w / v) cholate ، 0.01٪ (w / v) CHS ، 0.1 mM TCEP) التي تحتوي على 25 mM إيميدازول.
    2. اغسل العمود ب 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت B تحتوي على 50 مللي متر إيميدازول.
    3. تخلص من البروتين باستخدام Buffer C (Buffer B مع 200 mM imidazole).
    4. أضف 1 mM TCEP (انظر جدول المواد) و 10 mM MgCl2 إلى البروتينات المستخلصة.
    5. تحقق من صحة الكسور المستخلصة على جل SDS-PAGE لتأكيد حجم البروتين الصحيح26.
      ملاحظة: محصول البروتين النموذجي (1ش Ni-NTA): 10-20 ملغ بروتين لكل 6 لتر مزرعة. استخدم DDM عند 10x أو 5x من تركيز المذيلة الحرج (CMC) ، حوالي 0.01٪. يستخدم هذا البروتوكول 0.1٪ DDM.
    6. قم بتخفيف كسور الذروة من شطف Ni-NTA بحجم متساو من Buffer D1 (المخزن المؤقت B مع 1 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2) ، امزج وحمل كسور البروتين على عمود CBP (3-5 مل) (انظر جدول المواد) الذي تمت موازنته مسبقا مع CBP wash Buffer D1.
    7. قم بإجراء عمليات غسل متسلسلة على عمود CBP لتبادل المنظفات باستخدام Buffer D1 و D2 (Buffer B مع 1 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2 ، 0.1٪ (w / v) ديسيل مالتوز نيوبنتيل جليكول (DMNG) ، بدون β-DDM): أولا ، اغسل بأحجام 3 أعمدة من D1 ؛ ثانيا ، اغسل ب 3 مجلدات أعمدة من D1: D2 (3: 1 ، v / v) ؛ ثالثا ، اغسل ب 3 مجلدات أعمدة من D1: D2 (1: 1 ، v / v) ؛ الخطوة الرابعة ، اغسل ب 3 مجلدات أعمدة من D1: D2 (1: 3 ، v / v) ، متبوعة ب 6-10 مجلدات أعمدة من D2.
    8. تخلص من البروتين باستخدام غسول CBP Buffer D2 مع 300 mM NaCl في كسور 1 مل من عمود CBP (إجمالي 10 مل). تركيز الكسور المستخلصة إلى 1-2 مل.
      ملاحظة: العائد النموذجي للبروتين (1st CBP) هو 5-15 ملغ بروتين لكل 6 لتر مزرعة. تعمل منظفات مالتوز نيوبنتيل جلايكول (MNG) على تعزيز تخزين البروتين المنقى عند 4 درجات مئوية. تم استخدام كل من DMNG و Lauryl MNG (LMNG) ، مع DMNG مما أدى إلى بلورات حيود أفضل للأشعة السينية. استخدم DMNG عند 10-20x من تركيز المذيلة الحرج (CMC) ، حوالي 0.003٪. استخدم هذا البروتوكول 0.1٪ DMNG. يمكن تنقية جزء صغير من شطف CBP بشكل أكبر عن طريق كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي (الخطوة 4.4.) لتحليل نشاط ATPase للبروتينات أو تقييم التشتت الأحادي من خلال المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).

4. تحضير البروتين - معالجة ما قبل التبلور

  1. قم بشق الجليكان المرتبط ب N وعلامات CBP باستخدام endoglycosidase H (Endo H ، ~ 0.2 مجم لكل 10-15 مجم من البروتين المنقى) والبروتياز HRV-3C (~ 2 مجم لكل 10-15 مجم من البروتين المنقى) ، على التوالي (انظر جدول المواد). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. أثناء حضانة الأنزيم البروتيني Endo H و 3C ، قم بإجراء الألكلة الاختزالية على البروتينات المجمعة. ابدأ بالحضانة ب 20 ملليمتر يودواسيتاميد (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اتبع هذا مع حضانة 1 ساعة مع 2 مللي متر إضافي يودوأسيتاميد على الجليد.
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على استقرار تخزين البروتين لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية.
  3. استخدم عمود CBP الثاني (1-2 مل) لفصل علامة CBP المشقوقة. استخدم المخزن المؤقت D2 لهذه العملية.
    ملاحظة: إنتاج البروتين النموذجي (2nd CBP) هو 5-10 ملغ بروتين لكل 6 لتر مزرعة.
  4. قم بتنقية البروتين الخالي من علامات CBP باستخدام كروماتوغرافيا ترشيح الهلام. يجب أن يحتوي المخزن المؤقت على 10 مللي مول HEPES ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ (وزن / حجم) DMNG ، و 0.05٪ (وزن / حجم) ، و 0.01٪ (وزن / حجم) CHS.
    ملاحظة: إنتاج البروتين النموذجي (ترشيح الهلام) هو 2-8 مجم بروتين لكل 6 لتر مزرعة. خلال هذه الخطوة ، يشير عدم وجود ذروة DDM (~ 65 كيلو دال) أثناء ترشيح الهلام إلى تبادل المنظفات بنجاح إلى DMNG.
  5. تعديل كسور البروتين المجمعة من خلال المثيلة الاختزالية: أضف 20 مللي مول ثنائي ميثيل أمين بوران (DMAB ، انظر جدول المواد) و 40 مللي متر فورمالديهايد إلى البروتين. احتضان لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية على شاكر تذبذبي. أضف 10 مللي متر DMAB.
    1. كرر الخطوة 4.5 ، بما في ذلك إضافة 10 mM DMAB ، واحتضان طوال الليل (12-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
    2. أوقف التفاعل بإضافة 100 mM Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.5.
  6. قم بتحميل البروتين الميثيلي على عمود Ni-NTA سعة 2 مل متوازن مسبقا مع 100 mM Tris-Cl و pH 8.0 و 100 mM NaCl.
    1. اغسل العمود باستخدام 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل (10 مللي مول HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ، 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ، مع 0.5 مجم / مل DOPC: مخدر (3: 1 ، وزن / وزن) ، 0.1٪ (وزن / حجم) DMNG ، 0.05٪ (وزن / حجم) كولات ، 0.01٪ (وزن / حجم) CHS).
    2. قم بالتخلص من البروتين المعاد تدبريده باستخدام محلول الشطف (10 مللي مول HEPES ، درجة الحموضة 7.5 ، 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 200 مللي مول إيميدازول ، 0.5 مجم / مل DOPC: DOPE (1: 1 ، وزن / وزن) ، 0.1٪ (وزن / حجم) DMNG ، 0.05٪ (وزن / حجم) كولات ، 0.01٪ (وزن / حجم) CHS).
      ملاحظة: إنتاج البروتين النموذجي (2nd Ni-NTA) هو 1-5 مجم بروتين لكل 6 لتر مزرعة.
    3. مرر البروتين المنعش من خلال عمود تحلية PD-10 متوازن مسبقا مع المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 4.4.
  7. احتضان البروتين المحلى والمعاد تدبيره طوال الليل مع الكوليسترول (المحضر في الأيزوبروبانول أو الإيثانول) إلى تركيز نهائي ~ 20 ميكرومتر.
    1. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة المرسب عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 1،50،000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع طاف .
    2. ركز البروتين إلى تركيز نهائي من 30-50 مجم / مل باستخدام مكثف طرد مركزي مقطوع 100 كيلو دالتون.
    3. قم بإزالة المرسب باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولة بأقصى سرعة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    4. احتفظ بالمادة الطافية على الجليد عند 4 درجات مئوية وحدد ظروف التبلور في الثنائيات.
      ملاحظة: يجب استخدام البروتينات المركزة لنمو البلورات في غضون أسبوع. لا تجمد البروتينات.

5. تبلور البروتين في bicelles

  1. قم بإعداد محلول مخزون ثنائي الخلية بنسبة 10٪ مع دهون DMPC ومنظف CHAPSO بنسبة 3: 1 (وزن / وزن) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: استخدم CHAPSO عند 5x من تركيز المذيلة الحرجة (CMC) ، حوالي 0.5٪. يحافظ هذا على تركيز المنظف حول CMC في خليط البروتين ثنائي الخلية (الخطوة 5.2).
    1. أضف منظف H2O المذاب منزوع الأيونات (CHAPSO) إلى الدهون المجففة مسبقا (خليط من 5٪ مول٪ كوليسترول و 95٪ مول DMPC).
      ملاحظة: تحضير تركيبات دهنية مختلفة في الكلوروفورم ، وتجفيفها في أنبوب اختبار زجاجي باستخدام تيار غاز النيتروجين في RT. تخلص من المذيبات المتبقية عن طريق وضعها في غرفة مفرغة طوال الليل ، لتشكيل طبقة دهنية رقيقة.
    2. أعد تعليق الدهون والمنظفات باستخدام صوتنة حمام مائي.
    3. قم بتسخين خليط البيسيل في الماء المبرد بالثلج باستخدام الطاقة المستمرة حتى يصبح المحلول شفافا.
      ملاحظة: استخدم واقي السمع وتأكد من وجود كمية كافية من الثلج للحفاظ على الخليط في مرحلة سائلة.
    4. قم بإزالة المكونات غير المذابة باستخدام مرشح طرد مركزي 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: قم بتخزين محلول bicelle المقتبس في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. قم بإنشاء خليط بروتين / بيسيل على الجليد عن طريق الجمع بلطف بين 10٪ bicelles (الخطوة 5.1.4) والبروتينات (الخطوة 4.7.4) بنسبة 1: 4 (v / v) ، وتحقيق تركيز البروتين النهائي بين 5-10 مجم / مل.
  3. احتضان خليط البروتين وثنائي الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإعداد ظروف التبلور بتنسيق انتشار بخار قطرة معلقة باستخدام ألواح 48 بئرا.
    1. امزج كميات متساوية (0.5 أو 1 ميكرولتر) من خليط البروتين / ثنائي الخلية ومحلول خزان التبلور الذي يحتوي على 1.6 M-2.0 M كبريتات الأمونيوم ، 100 mM MES (درجة الحموضة 6.5) ، 0٪ -4٪ PEG 400 ، و 1 mM TCEP (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: قم بإنشاء مصفوفة من محلول الخزان قبل كل تجربة ، مع ضبط كبريتات الأمونيوم (1.6-2.0 م) و PEG 400 (0٪ -4٪).
    2. احتضان للتبلور عند 20 درجة مئوية.
    3. تحقق من صواني التبلور في اليوم التالي لضمان إحكام إغلاق زجاج الغطاء بشكل صحيح.
    4. راقب نمو الكريستال مرة واحدة على الأقل يوميا. تظهر البلورات عالية الجودة عادة في غضون 1-2 أسابيع ، بقياس 50-150 ميكرومتر × 20-50 ميكرومتر × 2-5 ميكرومتر.
      ملاحظة: قد تستغرق البلورات وقتا أطول لتتشكل بتركيزات بروتين أقل. يجب حصاد البلورات الناضجة في غضون شهر واحد.
    5. انقع بلورات البروتين في 0.2 متر من مالونات الصوديوم وقم بتجميدها في النيتروجين السائل باستخدام حلقات تبريد 50 أو 100 ميكرومتر.
      ملاحظة: في حالة توفر مقياس حيود الأشعة السينية ، اختبر بعض البلورات مع تعرض شعاع الأشعة السينية لمدة 15-30 دقيقة للكشف عن حيود يصل إلى 5 Å. يتطلب الحيود عالي الدقة مصدر ضوء السنكروترون. باستخدام 0.2 M Malonate الصوديوم كواقي من التبريد ، يمكن لبلورة قياس 100 ميكرومتر × 50 ميكرومتر × 2 ميكرومتر أن توفر حوالي 90 إطار صورة حيود مع الأشعة السينية السنكروترونية.

النتائج

يتم التعبير عن نصف ناقلات ABC المؤتلفة ، ABCG5 البشرية ، و ABCG8 ، في خميرة Pichia pastoris . ثم يتم تجزئة جزء غشاء الخميرة من خلال الطرد المركزي. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يتم استخراج البروتينات غير المتجانسة باستخدام كروماتوغرافيا العمود الترادفي. بعد ذلك ، يتم تبلور البروتينات المعالجة كيميائيا عن طريق احتضانها مع bicelles الفوسفوليبيد / الكوليسترول. يتم توفير لمحات عامة تخطيطية لعمليات التنقية والتبلور في الشكل 1.

لتقييم التشتت الأحادي للبروتينات المنقاة ، يتم تلطيخ العينات التي تحتوي على 0.01-0.05 مجم / مل من البروتينات ب 1٪ -2٪ من أسيتات اليورانيل. ثم يتم فحص هذه العينات باستخدام TEM سالبة البقعة (الشكل 2 أ). من أجل تقييم استقرار البروتين دون الخضوع لدورات التجميد والذوبان ، يتم استخدام كروماتوغرافيا ترشيح الهلام التحليلية. يتضمن هذا التحليل مراقبة التخزين الزمني للبروتينات النقية من خلال استخدام حصص صغيرة متساوية الحجم من البروتينات (الشكل 2 ب). قد يكون هناك فقدان طفيف للبروتينات في أجزاء الذروة بعد أسبوع من الحضانة عند 4 درجات مئوية ، ربما بسبب مجاميع البروتين القابلة للذوبان المتبقية. ومع ذلك ، لا يزال إنتاج البروتين الكلي كافيا لنمو البلورات. يعد استخدام TEM للبقع السلبية وكروماتوغرافيا ترشيح الهلام التحليلية ممارسة قياسية لتقييم مدى ملاءمة البروتينات للتبلور ، خاصة من التركيبات الهندسية المختلفة.

لتقييم جودة البروتين في كل خطوة من خطوات عملية كروماتوغرافيا العمود ، وكذلك بعد المعالجة الكيميائية قبل التبلور ، يتم تحميل حصص الكسور المقابلة لعمودين Ni-NTA ، وعمودين CBP ، وترشيح جل واحد ، وألكلة اختزال على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق نفس بيئة التفاعل المستخدمة في الألكلة على توسيم الزئبق بالزئبق الإيثيلي (EMTS)، على الرغم من أن هذا يتجاوز نطاق الدراسة الحالية.

تتم مراقبة نمو البلورات يوميا باستخدام مجهر ستيريو منضدية مزود بمستقطب. تبلغ أبعاد البلورات الناضجة والمناسبة لجمع البيانات عموما 50 ميكرومتر × 100 ميكرومتر × 2 ميكرومتر (الشكل 4). أثناء عملية حصاد البلورات ، يتم تجنب البلورات أو المجموعات الأصغر عمدا.

figure-results-2229
الشكل 1: لمحات عامة تخطيطية للتنقية (A) وتبلور ثنائي الخلية (B) من ABCG5 / G8 غير المتجانس. تحمل تركيبات ABCG5 (hG5) البشرية المؤتلفة و ABCG8 (hG8) علامات RGS-H 6-G-H6 و 3C-CBP ، على التوالي (A ، أعلى). كروماتوغرافيا عمود التقارب الترادفي ، متبوعة بكروماتوغرافيا ترشيح الهلام لتحقيق تنقية غير متجانسة (A ، أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2928
الشكل 2: تقييم التشتت الأحادي (A) والاستقرار (B) للبروتينات المنقاة . (أ) صورة مجهرية إلكترونية لمغايرة ABCG5 / G8 (G5G8) الملطخة سالبا باستخدام TEM. يتم تمييز الجسيمات التمثيلية في دوائر بيضاء صلبة. شريط المقياس = 100 نانومتر. (ب) البروتينات الألكلة المخزنة عند 4 درجات مئوية يتم تحليلها بواسطة كروماتوغرافيا ترشيح الهلام التحليلية على مدار شهر مع فقدان طفيف للبروتينات بعد أسبوع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3685
الشكل 3: تحليل SDS-PAGE لاستخلاصات البروتين من كروماتوغرافيا العمود والألكلة المختزلة. تم تحميل أحجام مختلفة (1-10 ميكرولتر) من كسور البروتين على جل تريس / جليكاين 10٪ وتشغيلها لمدة 45 دقيقة بجهد ثابت يبلغ 200 فولت. تم تلطيخ الجل باللون الأزرق Coomassie ، وإزالة البقع ، وتجفيفه بالهواء ، ومسحه ضوئيا بواسطة ماسح ضوئي منضدي. 1 ° و 2 ° Ni: العمودين الأول والثاني Ni-NTA ؛ 1 ° و 2 ° CBP: أعمدة CBP الأولى والثانية ؛ كسور الذروة الخط الصلب: الكسور المجمعة للتبلور ؛ كسور الذروة خط متقطع: كسور الكتف. EMTS: إيثيل الزئبق ثيوساليسينات. IA: يودواسيداميد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4574
الشكل 4: تقييم نضوج بلورات البروتين بواسطة المجهر الضوئي. تم تصور بلورات ناضجة من ABCG5 / G8 من قطرة التبلور تحت مجهر ستيريو منضدية ومستقطب. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

دفعت التحديات المرتبطة بتبلور البروتينات الغشائية إلى تطوير طرق التبلور المدفوع بطبقة الدهون ، مثل نهج bicelle27 أو الطور التكعيبي الدهني (LCP) 14 . ومع ذلك ، فإن تحقيق التبلور الناجح للبروتينات الغشائية لا يزال يتوقف على الخطوة الحرجة وأحيانا الاختناق لإعداد البروتين. والجدير بالذكر أن ناقلات ABC تمثل عقبة هائلة في زراعة البلورات المناسبة لعلم البلورات بالأشعة السينية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية شاملة لتبسيط تحضير ناقل ستيرول ABCG5 / G8 البشري وتعزيز نمو البلورات من خلال نهج بلورة ثنائي الخلية.

كان أحد الاعتبارات الرئيسية في ابتكار هذا البروتوكول هو ضرورة إنتاج بروتين كبير في المراحل الأولية لتنقية البروتين ، مما يسمح بدرجة معينة من فقدان البروتين أثناء المعالجة السابقة للتبلور (الشكل 3). تتضمن الاستراتيجيات الشائعة لمواجهة هذا التحدي هندسة البروتين واسعة النطاق ، واستخدام مضيفات تعبير متنوعة ، واستكشاف تقويم العظام أو المتجانسات ، من بين مناهج أخرى. ومع ذلك ، مع هذا الإجراء الذي يبدو معقدا ، تم تحديد عدد من الخطوات المحورية التي تدعم نجاح البروتوكول وتوفر أيضا نظرة ثاقبة للقيود المحتملة التي قد تنشأ عند دراسة ناقلات ABC الأخرى أو البروتينات الغشائية بشكل عام.

أولا ، يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي الشامل في كل خطوة لتقليل تراكم البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المراقبة المستمرة للثبات الحراري للبروتينات المنقاة أمر بالغ الأهمية. يستخدم المجهر الإلكتروني للتحقق من التشتت الأحادي للبروتين ، بينما يتتبع ترشيح الهلام التحليلي استقرار البروتين بمرور الوقت (الشكل 2). يمكن أيضا دمج تقنيات بديلة مثل ثنائية اللون الدائرية (CD) أو كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (DSC). علاوة على ذلك ، فإن دمج الدهون في مراحل محددة أمر ضروري لتحقيق أقصى قدر من النشاط والتبلور في ABCG5 / G8 المنقى. على سبيل المثال ، الكولات و CHS ضروريان لإظهار التحلل المائي ATP القابل للقياس. لا غنى عن الدهون الفوسفاتية للحفاظ على استقرار البروتينات الميثيلية ؛ والكوليسترول هو عنصر ضروري في محلول bicelle ، مما يعزز نمو البلورات المناسبة لحيود الأشعة السينية عالي الدقة (الشكل 4).

في جوهرها ، يمكن إنجاز الإجراء بأكمله في غضون أسبوع من الجهد. على عكس LCP ، فإن استرجاع البلورات من صواني التبلور المعلقة أمر مباشر. بالنظر إلى المستقبل ، مع إنتاجية كبيرة من البروتين (حوالي 10 ملغ) ، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة لتطوير التحقيقات البلورية التي تنطوي على طفرات ABCG5 / G8 أو بروتينات النقل الأخرى. هذا مهم بشكل خاص للحالات التي تتهرب حاليا من التصور من خلال المجهر الإلكتروني.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي شيء للكشف عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة (RGPIN 2018-04070) ومنحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-180640) إلى JYL. يعتمد هذا البروتوكول على التقارير الأصلية في الهياكل البلورية ABCG5 / G8 التي أبلغ عنها سابقا فرحات وآخرون 22 ولي وآخرون 23.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABCG5National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022436
ABCG8National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2Wisent600-024-CGAnhydrous
CBPAgilent214303Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin)Sartorius
CHAPSO AnatraceC317Anagrade
CholesterolAnatraceCH200
CHSSteraloidsC6823-000
DMABMilliporeSigma18023897%
DMNGAnatraceNG322
DMPCAnatraceD514
DOPCAvanti850375
DOPCAnatraceD518
DOPEAvanti850725
DTTFisherBP172
Dual Thickness MicroLoopsMiTeGen
EDTABioShopEDT003Disodium salt, dihydrate
EGTAMilliporeSigma324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3)Avestin
Endo HNew England BiolabsP0702
EthanolGreenfieldP016EAANEthyl Alcohol Anhydrous
FormaldehydeMilliporeSigma252549ACS Reagent
GlycerolBioShopGLY004
HEPESBioShopHEP001
HRV-3C proteaseHomemade
ImidazoleBioShopIMD510Reagent grade
IodoacetamideMilliporeSigmaI1149BioUltra
IsopropanolFisherBP2618212
LeupeptinBioShopLEU001
MESMilliporeSigma69892BioUltra
MethanolFisherA412P
MgCl2Wisent800-070-CGHydrated
microfluidizer (LM 20)Microfluidics
NaClBioShopSOD002
NH4OHFisherA669-212ACS Reagent
Ni-NTA superflowQiagen30430Nickel-charged resins
PEG 400MilliporeSigma202398
PepstatinBioShopPEP605
PMSFMilliporeSigmaP7626
pSGP18 and pLIC Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDSBioShopSDS003
Sodium cholateFisher229101
Sodium malonateMilliporeSigma63409
SucroseWisent800-081-WGUltra pure
Superdex 200 30/100 GLCytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)28990944Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEMFEI, Technai
Tris BaseFisherBP152
β-DDMAnatraceD310SSol Grade
β-mercaptoethanolMilliporeSigma
ε-aminocaproic acidFisherAAA1471936

References

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ABCG5 G8 Bicelle Bicelles ABCG5 G8 DMPC CHAPSO Bicelles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved