Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

Özet

ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları, lipid gömülü membran proteinlerini oluşturur. Bu membran proteinlerinin lipid çift tabakasından sulu bir ortama ekstrakte edilmesi tipik olarak deterjanlar kullanılarak elde edilir. Bu deterjanlar, lipid çift tabakasını parçalar ve proteinleri çözündürür. Lipid çift tabakası içindeki membran proteinlerinin içsel habitatı, yapısal karakterizasyon için çözeltide stabilitelerini ve tekdüzeliklerini korumada bir zorluk teşkil eder. Uzun ve kısa zincirli fosfolipidler ve deterjanların bir karışımını içeren biseller, doğal lipit yapısını kopyalar. Lipid bisellerinin ve deterjanların kullanımı, özellikle membran proteinlerinin yüksek çözünürlüklü yapısını belirlemek için yüksek kaliteli kırınım kristalleri elde etmek için uygun bir model sistem görevi görür. Bu sentetik mikro ortamlar aracılığıyla, membran proteinleri doğal konformasyonlarını ve işlevselliklerini koruyarak üç boyutlu kristallerin oluşumunu kolaylaştırır. Bu yaklaşımda, deterjanla çözündürülmüş heterodimerik ABCG5 / G8, kolesterol ile desteklenmiş DMPC / CHAPSO bisellerine yeniden entegre edildi. Bu kurulum, protein kristalizasyonu için buhar difüzyon deneysel prosedüründe kullanıldı.

Giriş

ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları, biyolojik membranlar 1,2,3,4,5 boyunca çeşitli ATP'ye bağlı taşıma işlemlerinden sorumlu bir membran proteinleri üst ailesini oluşturur. Bu taşıyıcı proteinler kardiyovasküler hastalıklarda rol oynar ve daha sonra karaciğerde atılım için safraya kolesterol akışını kolaylaştırmada önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, kolesterol metabolizması ve dengesi yıllar boyunca büyük ilgi görmüştür6. Kolesterol ve diğer sterollerin vücuttan atılmasında rol oynayan spesifik bir mekanizma, insan ABCG alt ailesinin üyelerini, özellikle heterodimerik ABCG5 / G8 7,8,9,10'u içerir. Bu genlerden herhangi birindeki mutasyonlar heterodimeri bozarak fonksiyon kaybına yol açar ve sterol kaçakçılığını etkileyen bir bozukluk olan sitosterolemiye neden olur11,12,13. Hastalığın önemi ve kolesterol akışını teşvik etmedeki rolleri göz önüne alındığında, sterol taşıyıcıları büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, moleküler mekanizmalarının ve substrat seçiciliklerinin karmaşık ayrıntıları büyük ölçüde açıklanmamıştır. Bu nedenle, ABCG5 / G8'in kristal yapısının aydınlatılması, kolesterol taşınmasındaki mekanizmaları ve aşağı akış fonksiyonlarını anlamak için çok önemli bir adımdır.

Membran proteinlerinin katlanması ve düzgün çalışması için membranların içinde sabitlenmesi gerekir. Sonuç olarak, zar proteinlerinin doğal ortamlarından çıkarılması genellikle protein kararsızlığına, yanlış katlanmaya ve işlev kaybına neden olur14,15. Bu zorluklar, membran protein kristalizasyonunda karşılaşılan birincil engellerin altını çizmektedir. Bununla birlikte, proteinlerin biseller gibi sentetik deterjan çift katmanlarına yeniden yapılandırılması, bu çıkmaza bir çözüm olarak ortaya çıkmış ve zar proteinlerinin doğal benzeri bir çift katmanlı ortam içinde korunmasını sağlamıştır16. Biseller, suda süspanse edilmiş ve çözündürülmüş sentetik fosfolipitlerin ve deterjanların birleşimleridir. Özellikle, biyolojik zarları taklit eden iki katmanlı bir yapıya sahiptirler16,17,18. Biseller, sıcaklık ve viskoziteye bağlı olarak sıvı ve jel fazları arasında geçiş yapabilir. Bicelle kristalizasyonu, küçük çift katmanlı disklerden ve düşük sıcaklıklarda düşük viskoziteden yararlanarak proteinlerin ve bicelle çözeltilerinin tamamen karıştırılmasını kolaylaştırır. Bisellerin boyutu, hazırlama sırasındaki deterjan-lipit oranınabağlıdır 19,20. Bisel oluşumu için yaygın deterjanlar arasında 3-[(3-kolamidopropil)dimetilamonyo]-2-hidroksi-1-propansülfonat (CHAPSO) ile birlikte 3-[(3-kolamidopropil)dimetilamonyak]-1-propansülfonat (CHAPS) ve 1,2-ditridekanoil-sn-gliserol-3-fosfokolin (DHPC)21. Bu deterjanlar, di-miristoil-fosfatidilkolin (DMPC) ve 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilkolin (POPC) gibi lipitlerle birlikte kullanılır. Ayrıca, son çalışmalar, fizyolojik koşullar altında iki hücre içindeki zar proteinlerinin tam işlevselliğini göstermiştir. Örneğin, Lee ve meslektaşları başarılı bir şekilde kristalize ettiler ve ABCG5 / ABCG8'in kristal yapısını bir lipid çift tabakası22,23'e dayanarak bildirdiler. Kristalizasyon işleminde, protein-bisel karışımları, yüksek verimli kristalizasyon robotları24 dahil olmak üzere standart ekipman kullanılarak barındırılabilir. Bununla birlikte, iki selin kullanılmasının fizibilitesi, daha yüksek sıcaklıklarda kristalleşme koşulları nedeniyle proteinlerin termostabilitesine bağlıdır. Bununla birlikte, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, membran proteinleri için gerekli kristalleşme koşulları genellikle hafif kalır ve düşük konsantrasyonlarda çökeltici, tuz ve tampon içerir. Bu, hem protein-bisel karışımlarını hem de buhar difüzyonunu, zar proteinlerinin yapısal çalışmaları için etkili ve kolay uygulanabilir araçlar haline getirir.

Bu protokol, ABCG5/G8'in X-ışını kristal yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için protein hazırlama ve bisel kristalizasyonundaki temel adımları özetlemektedir (Şekil 1).

Protokol

1. Klonlama ve protein ekspresyonu

  1. İnsan ABCG5 / G8 genini, önceki protokolleri izleyerek Pichia pastoris mayasına klonlayın25,26. Kısaca, pPICZB'den pSGP18 ve pLIC ekspresyon vektörlerini türetin. ABCG8 cDNA'nın (pSGP18-G8-3C-CBP) C-terminaline bir rinovirüs 3C proteaz bölgesini ve ardından bir kalmodulin bağlayıcı peptidi (CBP) kodlayan bir etiket ekleyin.
    1. ABCG5 cDNA'nın (pLIC-G5-H12) C-terminaline bir glisin (His 6 GlyHis6) ile ayrılmış altı histidin etiketi ekleyin. Elektroporasyon kullanarak plazmitleri Pichia suşu KM71H'ye birlikte dönüştürün.
      NOT: Kullanılan plazmitlerin, ortamların ve tamponların ayrıntıları için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
    2. Dönüştürülmüş maya hücrelerini MD agar plakalarında 28 °C'de büyütün.
  2. 1-2 gün sonra, 10-12 koloni seçin ve bunları küçük ölçekli kültür için 50 mL santrifüj tüpleri kullanarak 10 mL minimal gliserol maya azot bazı (MGY) ortamına aşılayın.
    1. Daha iyi havalandırma için santrifüj tüpü kapağında üç küçük delik açın. 600 nm'deki (OD600) optik yoğunluk 10'a ulaşana kadar hücrelerin 28 ° C'de 250 rpm'de sürekli çalkalayarak büyümesine izin verin, genellikle 1-2 gece sürer.
      NOT: Hücre büyümesi genellikle 12-24 saat sürer.
  3. Ertesi gün, 1 L steril MGY ortamı alın ve 2.4 L'lik bir şişede birincil kültürle aşılayın. Şişeyi 28 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde 250 rpm'de 24 saat inkübe edin.
    1. pH'ı 5-6 arasında tutmak için, pH stabilize olana kadar% 10 amonyum hidroksit (NH4OH) ekleyin.
  4. 1 L kültür başına 1 mL saf metanol (%0,1 (h/h) metanol) ekleyerek pH'ı ayarlayın ve protein ekspresyonunu indükleyin.
    NOT: Daha sonra hücreleri, toplam 36-48 saat boyunca her 12 saatte bir litre kültür başına 5 mL saf metanol (%0,5 (h/h) metanol) ile besleyin.
  5. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyerek hücreleri hasat edin.
  6. Hücre peletlerini toplayın ve bunları lizis tamponunda (0.33 M sükroz, 0.3 M Tris-Cl pH 7.5, 0.1 M aminoheksanoik asit, 1 mM EDTA ve 1 mM EGTA) 0.5 g / mL'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Süspansiyonu -80 °C'de saklayın. Tipik olarak, 1 L kültürlenmiş hücreden 30 ± 5 g hücre kütlesi geri kazanılabilir.
    NOT: Hücre peletlerini doğrudan dondurucuda saklayın veya membran preparatları için lizis tamponunda anında yeniden süspansiyon gerçekleştirin.

2. Mikrozomal membranın hazırlanması

  1. Hücreleri çözün ve proteaz inhibitörleri ekleyin (2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A, 2 mM PMSF, bkz.
    1. Hücreleri daha da parçalamak için, 25.000-30.000 psi'de buzla soğutulmuş bir emülgatör veya mikroakışkanlaştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Bu işlemi 3-4 kez tekrarlayın.
    2. Hücre kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin: 15 dakika boyunca 3.500-4.000 x g'da döndürün, ardından 30 dakika boyunca 15.000 x g'de ikinci bir sıkma yapın. Her iki dönüşü de 4 °C'de tutun.
  2. Mikrozomal membran veziküllerini izole etmek için, süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 2,00,000 °C'de 1.5 saat boyunca 4 x g'de ultrasantrifüjlemeye tabi tutun.
    1. Membran peletini 50 mL Tampon A (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl ve %10 gliserol) içinde bir dounce homojenizatör kullanarak yeniden süspanse edin. Süspansiyonu -80 °C'de saklayın.

3. Heterodimerlerin protein hazırlama-saflaştırılması

  1. Donmuş mikrozomal membranları çözün ve çözündürme tamponu kullanarak konsantrasyonu 4-6 mg / mL'ye ayarlayın. Tampon 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, %10 gliserol, %1 (a/h) β-dodesil maltozit (β-DDM), %0.5 (a/h) kolat, %0.1 (a/h) kolesteril hemisüksinat (CHS), 5 mM imidazol, 5 mM β-merkaptoetanol (β-ME), 2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A ve 2 mM PMSF içermelidir (bkz.
    NOT: Eşit hacimlerde membran preparatı ve çözündürme tamponu karıştırılabilir veya proteaz inhibitörleri ve indirgeyici maddeler olmadan 2x çözündürme tamponu kullanılabilir. Tamponun kısa kaynaması, CHS'nin verimli bir şekilde çözülmesine yardımcı olur. Saflaştırma için sadece 4 °C soğutmalı tampon kullanın.
    1. Karışımı 4 °C'de 1 saat orta hızda karıştırın. Bunu, oda sıcaklığında (RT) 20-30 dakika ek karıştırarak takip edin.
    2. Çözünmeyen zarları çıkarmak için karışımı 1,00,000 x g'da 30 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Çözünmüş süpernatanı toplayın ve 20 mM imidazol ve 0.1 mM TCEP ekleyin.
  2. Afinite kolon kromatografisi26 gerçekleştirin: çözündürülmüş süpernatanı gece boyunca Tampon A'da (adım 2.2.1) önceden dengelenmiş Ni-NTA boncuklarına (10-15 mL) (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.
    NOT: Bu noktadan itibaren çalışan arabelleklerde gliserol kullanmaktan kaçının.
    1. Kolonu 10 kolon hacmi Tampon B (50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, %0.1 (a/h) β-DDM, %0.05 (a/h) kolat, %0.01 (a/h) CHS, 0.1 mM TCEP) ile iki kez yıkayın.
    2. Kolonu 50 mM imidazol içeren 10 kolon hacmi Tampon B ile yıkayın.
    3. Tampon C (200 mM imidazol ile Tampon B) kullanarak proteini çoğaltın.
    4. Ayrıştırılan proteinlere 1 mM TCEP (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 mM MgCl2 ekleyin.
    5. Doğru protein boyutunu26 doğrulamak için bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayrıştırılmış fraksiyonları doğrulayın.
      NOT: Tipik protein verimi (1st Ni-NTA): 6 L kültür başına 10-20 mg protein. DDM'yi kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 10x veya 5x'inde, yaklaşık %0,01'inde kullanın. Bu protokol %0,1 DDM kullanır.
    6. Ni-NTA elüsyonundan elde edilen pik fraksiyonları eşit hacimde Tampon D1 (1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2 ile Tampon B) ile seyreltin, karıştırın ve protein fraksiyonlarını bir CBP kolonuna yükleyin (3-5 mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) CBP yıkama Tamponu D1 ile önceden dengelenmiştir.
    7. Tampon D1 ve D2 (1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, %0.1 (a/h) desil-maltoz neopentil glikol (DMNG) ile Tampon B) kullanarak deterjan değiştirmek için CBP kolonunda sıralı yıkamalar gerçekleştirin, β-DDM olmadan: önce 3 kolon hacmi D1 ile yıkayın; ikincisi, 3 sütun hacmi D1:D2 (3:1, v/v) ile yıkayın; üçüncü olarak, 3 sütun hacmi D1:D2 (1:1, v/v) ile yıkayın; dördüncü adım, 3 sütun hacmi D1:D2 (1:3, v/v) ve ardından 6-10 sütun hacmi D2 ile yıkayın.
    8. CBP kolonundan 2 mL fraksiyonlarda 300 mM NaCl ile CBP yıkama Tamponu D10 kullanarak proteini elute edin. Ayrıştırılan fraksiyonları 1-2 mL'ye konsantre edin.
      NOT: Tipik protein verimi (1st CBP), 6 L kültür başına 5-15 mg proteindir. Maltoz neopentil glikol (MNG) deterjanları, 4 °C'de saflaştırılmış protein depolamasını artırır. Hem DMNG hem de Lauril MNG (LMNG) kullanıldı ve DMNG daha iyi X-ışını kırınım kristalleri verdi. DMNG'yi kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 10-20 katında, yaklaşık% 0.003'te kullanın. Bu protokol %0.1 DMNG kullandı. CBP elüatının bir kısmı, proteinlerin ATPaz aktivitesini analiz etmek veya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yoluyla mono-dağılımı değerlendirmek için jel filtrasyon kromatografisi (adım 4.4.) ile daha da saflaştırılabilir.

4. Protein hazırlama-ön kristalizasyon işlemi

  1. Sırasıyla endoglikozidaz H (Endo H, 10-15 mg saflaştırılmış protein başına ~ 0.2 mg) ve HRV-3C proteaz (10-15 mg saflaştırılmış protein başına ~ 2 mg) kullanarak N-bağlı glikanları ve CBP etiketlerini ayırın (bkz. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  2. Endo H ve 3C proteaz inkübasyonu sırasında, havuzlanmış proteinler üzerinde indirgeyici alkilasyon gerçekleştirin. 4 ° C'de gece boyunca 20 mM iyodoasetamid ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe ederek başlayın. Bunu, buz üzerinde ek 2 mM iyodoasetamid ile 1 saatlik bir inkübasyon ile takip edin.
    NOT: Bu adım, protein depolamasını 4 °C'de bir aya kadar stabilize eder.
  3. Bölünmüş CBP etiketini ayırmak için ikinci bir CBP sütunu (1-2 mL) kullanın. Bu işlem için Buffer D2'yi kullanın.
    NOT: Tipik protein verimi (2ndCBP ), 6 L kültür başına 5-10 mg proteindir.
  4. Jel filtrasyon kromatografisi kullanarak CBP etiketsiz proteini saflaştırın. Tampon 10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, %0.1 (a/h) DMNG, %0.05 (a/h) kolat ve %0.01 (a/h) CHS içermelidir.
    NOT: Tipik protein verimi (jel filtrasyonu) 6 L kültür başına 2-8 mg proteindir. Bu adım sırasında, jel filtrasyonu sırasında bir DDM tepe noktasının (~65 kD) olmaması, DMNG'ye başarılı deterjan değişimini gösterir.
  5. İndirgeyici metilasyon yoluyla havuzlanmış protein fraksiyonlarını değiştirin: proteine 20 mM dimetilamin boran (DMAB, Malzeme Tablosuna bakınız) ve 40 mM formaldehit ekleyin. Salınımlı bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de 2 saat inkübe edin. 10 mM DMAB ekleyin.
    1. 10 mM DMAB ilavesi de dahil olmak üzere adım 4.5'i tekrarlayın ve gece boyunca (12-18 saat) 4 °C'de inkübe edin.
    2. 100 mM Tris-Cl, pH 7.5 ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  6. Metillenmiş proteini, 100 mM Tris-Cl, pH 8.0 ve 100 mM NaCl ile önceden dengelenmiş 2 mL Ni-NTA kolonuna yükleyin.
    1. Kolonu 10 kolon hacmi yıkama tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mg/mL DOPC ILE: DOPE (3:1, a/a), %0.1 (a/h) DMNG, %0.05 (a/h) kolat, %0.01 (a/h) CHS).
    2. Elüsyon tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0.5 mg/mL DOPC: DOPE (1:1, a/a), %0,1 (a/h) DMNG, %0,05 (a/h) kolat, %0,01 (a/h) CHS).
      NOT: Tipik protein verimi (2nd Ni-NTA), 6 L kültür başına 1-5 mg proteindir.
    3. Protein elüatlarını, adım 4.4'te kullanılan tampon ile önceden dengelenmiş bir PD-10 tuzdan arındırma kolonundan geçirin.
  7. Tuzdan arındırılmış ve yeniden lipidlenmiş proteini gece boyunca kolesterol (izopropanol veya etanol içinde hazırlanmış) ile ~20 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar inkübe edin.
    1. Ertesi sabah, çökelticiyi 1,50,000 °C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da ultrasantrifüjleme ile çıkarın. Süpernatanı topla.
    2. Proteini, 100 kDa'lık bir kesme santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak 30-50 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona konsantre edin.
    3. 4 °C'de 30 dakika boyunca en yüksek hızda tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak çökelticiyi çıkarın.
    4. Süpernatanı 4 °C'de buz üzerinde tutun ve iki selde kristalleşme koşulları oluşturun.
      NOT: Konsantre proteinler bir hafta içinde kristal büyümesi için kullanılmalıdır. Proteinleri dondurmayın.

5. İki sellerde protein kristalizasyonu

  1. DMPC lipidleri ve CHAPSO deterjan ile 3:1 (a/a) oranında %10'luk bir bicelle stok çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: CHAPSO'yu kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 5 katında, yaklaşık %0.5'inde kullanın. Bu, protein-bisel karışımındaki CMC'si etrafındaki deterjan konsantrasyonunu korur (adım 5.2).
    1. Önceden kurutulmuş lipitlere (% 5 mol kolesterol ve% 95 mol DMPC karışımı) deiyonizeH2O-çözünmüş deterjan (CHAPSO) ekleyin.
      NOT: Kloroformda çeşitli lipit bileşimleri hazırlayın ve bunları RT'de bir nitrojen gazı akışı kullanarak bir cam test tüpünde kurutun. Artık çözücüleri gece boyunca bir vakum odasına yerleştirerek ince bir lipit tabakası oluşturarak ortadan kaldırın.
    2. Bir su banyosu sonikatörü kullanarak lipitleri ve deterjanı yeniden süspanse edin.
    3. Çözelti şeffaf hale gelene kadar sürekli güç kullanarak bicelle karışımını buzla soğutulmuş suda sonikleştirin.
      NOT: İşitme koruması kullanın ve karışımı sıvı fazda tutmak için yeterli buz kaynağı sağlayın.
    4. Çözünmemiş bileşenleri 0,2 μm santrifüj filtre ile çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Aliquoted bicelle solüsyonunu -80 °C'de saklayın.
  2. %10 çift hücreli (adım 5.1.4) ve proteinleri (adım 4.7.4) 1:4 (v/v) oranında nazikçe birleştirerek ve 5-10 mg/mL arasında bir nihai protein konsantrasyonu elde ederek buz üzerinde bir protein/bisel karışımı oluşturun.
  3. Protein ve bicelle karışımını buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  4. 48 oyuklu plakalar kullanarak asılı damla buhar difüzyon formatında kristalleşme koşullarını ayarlayın.
    1. 1.6 M-2.0 M amonyum sülfat, 100 mM MES (pH 6.5),% 0 -% 4 PEG 400 ve 1 mM TCEP içeren eşit hacimlerde (0.5 veya 1 μL) protein / bicelle karışımı ve kristalizasyon rezervuar çözeltisini karıştırın (bkz.
      NOT: Her deneyden önce amonyum sülfat (1.6-2.0 M) ve PEG 400'ü (%0-%4) ayarlayarak rezervuar çözeltisinin bir matrisini oluşturun.
    2. 20 °C'de kristalleşme için inkübe edin.
    3. Kapak camının düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için ertesi gün kristalizasyon tepsilerini kontrol edin.
    4. Kristal büyümesini günde en az bir kez izleyin. Yüksek kaliteli kristaller genellikle 1-2 hafta içinde ortaya çıkar ve 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm boyutlarındadır.
      NOT: Kristallerin daha düşük protein konsantrasyonlarında oluşması daha uzun sürebilir. Olgun kristaller bir ay içinde hasat edilmelidir.
    5. Protein kristallerini 0,2 M sodyum malonat içine batırın ve 50 veya 100 μm kriyo döngüleri kullanarak sıvı nitrojen içinde dondurun.
      NOT: Bir X-ışını difraktometresi varsa, 5 Å'ye kadar kırınımı ortaya çıkarmak için 15-30 dakikalık X-ışını ışınına maruz kalan birkaç kristali test edin. Daha yüksek çözünürlüklü kırınım, bir senkrotron ışık kaynağı gerektirir. Kriyo-koruyucu olarak 0,2 M sodyum malonat kullanarak, 100 μm x 50 μm x 2 μm ölçülerinde bir kristal, senkrotron X-ışını ile yaklaşık 90 kırınım görüntü çerçevesi sağlayabilir.

Temsili Sonuçlar

Rekombinant ABC yarı taşıyıcıları, insan ABCG5 ve ABCG8, Pichia pastoris mayasında birlikte eksprese edilir. Maya membran fraksiyonu daha sonra santrifüjleme yoluyla fraksiyonlanır. Bu protokolde belirtildiği gibi, heterodimerik proteinler tandem kolon kromatografisi kullanılarak ekstrakte edilir. Daha sonra, kimyasal olarak ön işleme tabi tutulmuş proteinler, fosfolipid/kolesterol biselleri ile inkübe edilerek kristalleştirilir. Saflaştırma ve kristalizasyon proseslerinin şematik özetleri Şekil 1'de verilmiştir.

Saflaştırılmış proteinlerin monodispersitesini değerlendirmek için, 0.01-0.05 mg/mL protein içeren numuneler %1-2 uranil asetat ile boyanır. Bu numuneler daha sonra negatif lekeli TEM kullanılarak incelenir (Şekil 2A). Donma-çözülme döngülerine girmeden protein stabilitesini değerlendirmek için analitik jel filtrasyon kromatografisi kullanılır. Bu analiz, proteinlerin küçük, eşit hacimli alikotlarının kullanılmasıyla saflaştırılmış proteinlerin zaman boyunca depolanmasının izlenmesini içerir (Şekil 2B). 4 ° C'de bir haftalık inkübasyondan sonra, muhtemelen kalıntı çözünür protein agregatları nedeniyle, pik fraksiyonlarda hafif bir protein kaybı olabilir. Bununla birlikte, genel protein verimi kristal büyümesi için yeterli kalır. Negatif leke TEM ve analitik jel filtrasyon kromatografisinin kullanımı, özellikle farklı mühendislik yapılarından proteinlerin kristalizasyon için uygunluğunu değerlendirmek için standart bir uygulamadır.

Kolon kromatografisi işleminin her adımında ve ayrıca kristalizasyon öncesi kimyasal işlemden sonra protein kalitesinin değerlendirilmesi için, iki Ni-NTA kolonuna, iki CBP kolonuna, bir jel filtrasyonuna ve indirgeyici alkilasyona karşılık gelen fraksiyonların alikotları %10'luk bir SDS-PAGE jeli üzerine yüklenir (Şekil 3). Ek olarak, alkilasyon için kullanılan aynı reaksiyon ortamı, etil cıva (EMTS) ile cıva etiketlemesi için uygulanabilir, ancak bu, mevcut çalışmanın kapsamı dışındadır.

Kristallerin büyümesi, polarizör ile donatılmış bir masa üstü stereo mikroskop kullanılarak günlük olarak izlenir. Olgun ve veri toplamaya uygun kristaller genellikle 50 μm x 100 μm x 2 μm boyutlarına ulaşır (Şekil 4). Kristal toplama işlemi sırasında, daha küçük kristallerden veya kümelerden kasıtlı olarak kaçınılır.

figure-representative results-2618
Şekil 1: Heterodimerik ABCG5/G8'in saflaştırılması (A) ve bisel kristalizasyonu (B) için şematik genel bakış. Rekombinant insan ABCG5 (hG5) ve ABCG8 (hG8) yapıları sırasıyla RGS-H 6-G-H6 ve 3C-CBP etiketlerini taşır (A, üstte). Tandem afinite kolon kromatografisi, ardından heterodimerik saflaştırma elde etmek için jel filtrasyon kromatografisi (A, alt). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-representative results-3393
Şekil 2: Saflaştırılmış proteinlerin mono-dispersitesinin (A) ve stabilitesinin (B) değerlendirilmesi . (A) TEM kullanılarak negatif boyanmış ABCG5/G8 (G5G8) heterodimerlerinin elektron mikrografı. Temsili parçacıklar düz beyaz dairelerle vurgulanır. Ölçek çubuğu = 100 nm. (B) 4 ° C'de depolanan alkillenmiş proteinler, bir ay boyunca analitik jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilir ve bir hafta sonra hafif bir protein kaybı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-representative results-4243
Şekil 3: Kolon kromatografisi ve indirgeyici alkilasyonun protein elüatlarının SDS-PAGE analizi. Çeşitli hacimlerde (1-10 μL) protein fraksiyonları% 10'luk bir Tris / Glisin jeli üzerine yüklendi ve 200 V'luk sabit bir voltajda 45 dakika boyunca çalıştırıldı. Jel, Coomassie mavisi ile boyandı, lekesi çıkarıldı, havada kurutuldu ve bir masa üstü tarayıcı tarafından tarandı. 1 ° ve 2 ° Ni: birinci ve ikinci Ni-NTA sütunları; 1 ° ve 2 ° CBP: birinci ve ikinci CBP sütunları; Tepe Fraksiyonları katı çizgisi: kristalizasyon için havuzlanmış fraksiyonlar; Tepe Kesirleri kesikli çizgi: omuz kesirleri; EMTS: etil cıva tiyosalisinat; IA: iyodoasedamid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-representative results-5268
Şekil 4: Işık mikroskobu ile protein kristali olgunlaşmasının değerlendirilmesi. Bir kristalizasyon damlasından ABCG5 / G8'in olgun kristalleri, bir masa üstü ve polarizör donanımlı stereo mikroskop altında görselleştirildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Kristalleşen membran proteinleri ile ilgili zorluklar, bicelle27 veya lipid kübik faz (LCP)14 yaklaşımları gibi lipid-çift tabaka güdümlü kristalizasyon yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, zar proteinlerinin başarılı bir şekilde kristalleşmesinin sağlanması, protein hazırlamanın kritik ve bazen darboğazlı adımına bağlıdır. Özellikle, ABC taşıyıcıları, X-ışını kristalografisi için uygun kristallerin yetiştirilmesinde zorlu bir engel teşkil etmektedir. Bu protokol, insan ABCG5/G8 sterol taşıyıcısının hazırlanmasını kolaylaştırmak ve bicelle kristalizasyon yaklaşımı yoluyla kristal büyümesini teşvik etmek için kapsamlı uygulamalı rehberlik sağlar.

Bu protokolün tasarlanmasında önemli bir husus, protein saflaştırmasının ilk aşamalarında, kristalizasyon öncesi işlem sırasında belirli bir derecede protein kaybına izin veren önemli bir protein verimi zorunluluğuydu (Şekil 3). Bu zorluğun üstesinden gelmek için yaygın stratejiler, diğer yaklaşımların yanı sıra kapsamlı protein mühendisliğini, çeşitli ekspresyon konakçılarının kullanımını ve ortologların veya homologların araştırılmasını içerir. Bununla birlikte, görünüşte karmaşık olan bu prosedürle, protokolün başarısını destekleyen ve ayrıca diğer ABC taşıyıcılarını veya genel olarak zar proteinlerini incelerken ortaya çıkabilecek potansiyel sınırlamalar hakkında fikir veren bir dizi önemli adım tanımlanmıştır.

İlk olarak, bu protokol, protein agregasyonunu en aza indirmek için her adımda kapsamlı santrifüjleme kullanır. Ek olarak, saflaştırılmış proteinlerin termostabilitesinin sürekli izlenmesi çok önemlidir. Elektron mikroskobu, protein monodispersitesini doğrulamak için kullanılırken, analitik jel filtrasyonu zaman içinde protein stabilitesini izler (Şekil 2). Dairesel dikroizm (CD) veya diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) gibi alternatif teknikler de dahil edilebilir. Ayrıca, lipitlerin belirli aşamalarda dahil edilmesi, saflaştırılmış ABCG5/G8'in hem aktivitesini hem de kristalogenezini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Örneğin, ölçülebilir ATP hidrolizi sergilemek için kolat ve CHS gereklidir; fosfolipitler, metillenmiş proteinlerin stabilitesini korumak için vazgeçilmezdir; ve kolesterol, yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınımı için uygun kristal büyümesini teşvik eden bicelle çözeltisinin gerekli bir bileşenidir (Şekil 4).

Özünde, tüm prosedür bir haftalık çabayla gerçekleştirilebilir. LCP'nin aksine, kristallerin asılı damla kristalizasyon tepsilerinden alınması basittir. İleriye bakıldığında, önemli bir protein verimi (yaklaşık 10 mg) ile bu protokol, ABCG5 / G8 mutantlarını veya diğer taşıyıcı proteinleri içeren kristalografik araştırmaların geliştirilmesi için kolayca uyarlanabilir. Bu, özellikle şu anda elektron mikroskobu ile görselleştirmeden kaçan durumlar için geçerlidir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, JYL'ye Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Hibesi (RGPIN 2018-04070) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Araştırma Projesi Hibesi (PJT-180640) tarafından desteklenmektedir. Bu protokol, daha önce Farhat ve ark.22 ve Lee ve ark.23 tarafından bildirilen ABCG5/G8 kristal yapılarındaki orijinal raporlara dayanmaktadır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)2SO4MilliporeSigmaA4915
ABCG5National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022436
ABCG8National Institute of Health collection NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2Wisent600-024-CGAnhydrous
CBPAgilent214303Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin)Sartorius
CHAPSO AnatraceC317Anagrade
CholesterolAnatraceCH200
CHSSteraloidsC6823-000
DMABMilliporeSigma18023897%
DMNGAnatraceNG322
DMPCAnatraceD514
DOPCAvanti850375
DOPCAnatraceD518
DOPEAvanti850725
DTTFisherBP172
Dual Thickness MicroLoopsMiTeGen
EDTABioShopEDT003Disodium salt, dihydrate
EGTAMilliporeSigma324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3)Avestin
Endo HNew England BiolabsP0702
EthanolGreenfieldP016EAANEthyl Alcohol Anhydrous
FormaldehydeMilliporeSigma252549ACS Reagent
GlycerolBioShopGLY004
HEPESBioShopHEP001
HRV-3C proteaseHomemade
ImidazoleBioShopIMD510Reagent grade
IodoacetamideMilliporeSigmaI1149BioUltra
IsopropanolFisherBP2618212
LeupeptinBioShopLEU001
MESMilliporeSigma69892BioUltra
MethanolFisherA412P
MgCl2Wisent800-070-CGHydrated
microfluidizer (LM 20)Microfluidics
NaClBioShopSOD002
NH4OHFisherA669-212ACS Reagent
Ni-NTA superflowQiagen30430Nickel-charged resins
PEG 400MilliporeSigma202398
PepstatinBioShopPEP605
PMSFMilliporeSigmaP7626
pSGP18 and pLIC Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDSBioShopSDS003
Sodium cholateFisher229101
Sodium malonateMilliporeSigma63409
SucroseWisent800-081-WGUltra pure
Superdex 200 30/100 GLCytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)28990944Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEMFEI, Technai
Tris BaseFisherBP152
β-DDMAnatraceD310SSol Grade
β-mercaptoethanolMilliporeSigma
ε-aminocaproic acidFisherAAA1471936

Referanslar

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ABCG5 G8Lipidik BicelleX n KristalografisiMembran ProteinleriLipid ift KatmanlDeterjanlarKararl l kTekd zelikYap sal KarakterizasyonBisellerFosfolipitlerY ksek Kaliteli K r n m KristalleriY ksek z n rl kl YapDo al KonformasyonlevsellikBoyutlu KristallerDeterjanla z n r Heterodimerik ABCG5 G8DMPC CHAPSO BisellerKolesterolBuhar Dif zyonuProtein Kristalizasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır