Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج لتليف عضلات الفم والوجه. مقارنة الأنسجة بين الفئران ماستر وعضلة الظنبوب الأمامية بعد إصابة التجمد أكدت تليف عضلات العضلة. سيسهل هذا النموذج إجراء مزيد من التحقيق في الآلية الكامنة وراء تليف عضلات الفم والوجه.

Abstract

تشكل عضلة الفم والوجه مجموعة فرعية من الأنسجة العضلية الهيكلية ، مع مسار تطوري متميز وأصل تطوري. على عكس عضلات الأطراف المشتقة من السوميت ، تنشأ عضلات الفم والوجه من الأقواس المتفرعة ، مع مساهمات حصرية من القمة العصبية القحفية. كشفت دراسة حديثة أن التجديد يختلف أيضا في مجموعة عضلات الفم والوجه. ومع ذلك ، لا يزال يتعين الكشف عن الآلية التنظيمية الأساسية. تركز نماذج تجديد العضلات الهيكلية الحالية بشكل أساسي على الأطراف وعضلات الجذع. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الثلج الجاف للحث على إصابة التجمد في عضلة عظمة الفأر وعضلة الظنبوب الأمامية لإنشاء نموذج تليف عضلات الفم والوجه. كانت الديناميات الزمنية للخلايا الساتلية العضلية والأسلاف الليفية الأديبوجينية مختلفة بين العضلتين ، مما أدى إلى ضعف تجديد الألياف العضلية وترسب المصفوفة خارج الخلية المفرط. بمساعدة هذا النموذج ، يمكن إجراء تحقيق أعمق في تجديد العضلات في منطقة الفم والوجه لتطوير مناهج علاجية للمرضى الذين يعانون من أمراض الفم والوجه.

Introduction

تعتبر عضلات الفم والوجه ضرورية في الأنشطة الفسيولوجية اليومية مثل المضغ والكلام والتنفس وتعبيرات الوجه1. ومع ذلك ، في التشوهات الخلقية الفموية الوجهية ، تظهر هذه العضلات تغيرات ضامرة وتليفية ، مما يؤدي إلى ضعف صحة الجسم والإدراك الاجتماعي2. لا تزال الجراحة الترميمية للوجه هي علاج الخط الأول ، ولكن ما يصل إلى 30-70٪ من مرضى ما بعد الجراحة لا يزالون يعانون من فقدان العضلات واختلال وظيفي في العضلات 3,4 يعزى فشل تجديد عضلات الفم والوجه إلى عوامل جوهرية لا يمكن تصحيحها بالجراحة وحدها.

ظهور عضلات الفم والوجه هو حداثة تطورية ، يرافق رأس الفقاريات المعقدة والقلبالحجرة 5,6. على عكس نظرائهم من الأطراف المشتقة من سوميت ، تنشأ عضلات الفم والوجه من القوس المتفرع7. هذه الخصائص التطورية والجينية قد تهيئهم لسلوكيات تجددية متميزة8. تم الإبلاغ عن أن عضلة العضلة العضلية (MAS) أصيبت بتليف شديد في الوقت الذي تجددت فيه عضلة الظنبوب الأمامية (TA) بالكامل بعد التعرض لنفس القدر من الإصابة 1,9. ومع ذلك ، فإن الآلية الأساسية للتجديد لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج إصابة التجمد لعضلة الفئران لتسهيل التحقيق في تجديد عضلات الفم والوجه. اخترنا 14 يوما بعد الإصابة كنقطة زمنية لتقييم النمط الظاهري للتليف لأنها كانت أقرب نقطة زمنية يمكن فيها اكتشاف تباعد ملحوظ بين عضلتين. يتطلب التجديد الكامل ل MAS بعد الإصابة 40 أسبوعا على الأقل1. باستمرار ، كشفت هذه الدراسة عن ترسب ملحوظ للكولاجين بعد إصابة التجمد في MAS مقارنة بالتجديد المنتظم ل TA في 14 يوما بعد الإصابة. بمساعدة هذا النموذج ، يمكن إجراء المزيد من الدراسات الميكانيكية لضمور العضلات والتليف ، مما سيساعد بدوره في تطوير طرق علاجية محتملة لتعزيز تجديد عضلات الفم والوجه بعد الجراحة.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2020-114). تم تربية ذكور الفئران C57BL / 6 (5 أسابيع) في منشأة يتم التحكم فيها بالرطوبة (53 ± 2٪) ويتم التحكم في درجة حرارتها (23 ± 2 درجة مئوية) وكانت في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إصابة التجمد

  1. التخدير: قم بتخدير الفئران بكرات قطنية مبللة بالإيزوفلوران وحقن تيلتامين-زولازيبام داخل الصفاق بجرعة 50 مجم / كجم. تم توفير التسكين قبل وبعد الجراحة عن طريق حقن ميلوكسيكام داخل الصفاق بجرعة 1 ملغ/كغ. حماية عيونهم مع مرهم الطبيب البيطري. تم وضع وسادة تدفئة عند 38 درجة مئوية تحت الستارة الجراحية أثناء الإجراء بأكمله لتوفير الدعم الحراري للحيوان. ثبت الفئران بشريط لاصق بعد وضعها على جانبها على طاولة جراحية (الشكل 1). تقييم كفاية التخدير عن طريق فقدان منعكس الجفن ، منعكس التصحيح ، ومنعكس سحب الدواسة.
    ملاحظة: عند تطبيق تخدير الأيزوفلوران ، أمسك الماوس بيد واحدة وكرة القطن المنقوعة بالإيزوفلوران في يد أخرى. تأكد من إبقاء كرة القطن على مسافة من لتجنب الانزعاج وتهيج الجلد.
  2. إزالة الشعر قبل الجراحة: استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الشعر على ربلة الساق ووجه الفأر وتطبيق معجون إزالة الشعر بقطعة قطن على الجلد ، وتغطي عضلة العضل وعضلة الظنبوب الأمامية. بعد 1-2 دقيقة ، اغسل العجينة بمناديل جراحية أساسها الإيثانول (الشكل 2 أ والشكل 2 جي). تم تطهير المواقع الجراحية بثلاث جولات من فرك اليود و 75٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: لم تكن ماكينة الحلاقة الكهربائية وحدها كافية لإزالة الشعر ، خاصة في منطقة الماستر. عند تطبيق معجون مزيل الشعر ، من المهم عدم استخدام معجون مفرط. امسح الجلد برفق عند غسل العجينة لتجنب حروق الجلد.
  3. التعرض للمجال الجراحي: قم بتغطيتها بالستائر الجراحية قبل العملية الجراحية. بالنسبة لعضلة MAS ، جس أولا على طول الحافة السفلية للفك السفلي. على بعد 5 مم من الحافة ، قم بعمل شق 7 مم على طول الخط الذي يربط المفصل الفموي بالزنمة (يشير الخط المتقطع إلى موقع الشق في الشكل 2 ب).
  4. بالنسبة لعضلة TA ، جس أولا على طول ربلة الساق لتحديد الحافة الأمامية لعظم الظنبوب. قطع 2 مم إلى الخلف إلى الحافة من خلال الجلد بمشرط ، بدءا من الركبة وينتهي عند الكاحل (يشير الخط المتقطع إلى موقع الشق في الشكل 2H). لكل ماوس ، إذا أصيبت عضلة MAS و TA على الجانب الأيسر ، فاستخدم العضلة الأخرى على الجانب المقابل كعنصر تحكم.
    ملاحظة: هذا القطع سطحي للغاية لضمان عدم إصابة العضلات أثناء الشق. لا ينبغي أن يكون شق الوجه قريبا جدا من الزنمة. خلاف ذلك ، سوف تتعرض الغدة النكفية ، مما يؤدي إلى نزيف مفرط أثناء عملية التجميد التالية.
  5. تجميد الثلج الجاف: امسك قطعة واحدة من الثلج الجاف بالملقط المبرد مسبقا على طول المحاور الطويلة لعضلات MAS و TA (الشكل 2C والشكل 2I ، على التوالي). ضع الثلج الجاف مباشرة على سطح العضلات لمدة 5 ثوان. تأكد من أن العضلات تبدو متيبسة وشاحبة بيضاء مباشرة بعد إزالة الثلج الجاف (الشكل 2D والشكل 2J) لكنها تعود إلى لونها وملمسها الطبيعي في غضون 22-25 ثانية ، على غرار العضلات المجاورة غير المصابة (الشكل 2E والشكل 2K).
    ملاحظة: يجب تبريد الملقط الذي يحمل الثلج الجاف مسبقا لتجنب التسامي السريع للثلج الجاف. المؤقت إلزامي في إجراء إصابة التجميد لمدة 5 ثوان وحساب وقت التعافي 22-25 ثانية للعضلة. يجب التخلي عن أي عضلة ذات وقت تعافي أقصر من 22 ثانية أو أطول من 25 ثانية. هذه الخطوة تتطلب الممارسة.
  6. إغلاق الجرح: بعد الشفاء التام للعضلة ، أغلق جرح الجلد بثلاث خيوط على الأقل 7-0 (الشكل 2F والشكل 2L).
  7. الإنعاش: عند اكتمال الخيط ، ضع الفئران في القفص مع الدعم الحراري وراقبها باستمرار حتى يتم استعادة جميع ردود الفعل الصحيحة.

2. جمع العضلات

  1. القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من الأيزوفلوران ، يليه خلع عنق الرحم. حصاد عضلات MAS و TA على كلا الجانبين للتحليل النسيجي.
  2. تشريح العضلات MAS: قطع الجلد على وجه الفأر وإزالة الغدة النكفية لكشف الجزء الخلفي من عضلة MAS. تشريح MAS من ملحقه الأمامي وصولا إلى ملحقه الخلفي على الفك السفلي. تشير المنطقة المنقطة البيضاء إلى الجزء المكشوف من MAS (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: تتكون عضلة MAS من مقصورات عميقة وسطحية ، وكلاهما مرتبط ارتباطا وثيقا بسطح الفك السفلي. تأكد من الضغط على المقص إلى الفك السفلي أثناء التشريح لضمان العزل التام ل MAS. كن حذرا لتمييز الفك السفلي الوجني عن MAS من خلال حدوده بين الوجني والفك السفلي.
  3. تشريح العضلات TA: قطع الجلد من الكاحل إلى الركبة وإزالة اللفافة لكشف عضلة TA. استخدم طرف ملقط التشريح الدقيق لعزل وتر TA وحركه بالكامل حتى الركبة لكسر الألياف المرتبطة بالساق. ثم قطع الوتر على الكاحل (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: بالنسبة لعضلة TA ، هناك عدد قليل من أوتار العضلات حول كاحل الفأر. سيتطلب الأمر ممارسة لتمييز وتر TA ، وهو الأكبر والأقرب إلى الظنبوب.
  4. التبريد المسبق للأيزوبنتان: تحضير برميلين عازلين ؛ املأ البرميل الصغير بالإيزوبنتان والبرميل الكبير بالنيتروجين السائل. ضع البرميل الصغير داخل البرميل الكبير قبل 10 دقائق من تشريح العضلات (الشكل 3 د).
  5. تحضير قالب التضمين: اصنع قالب رقائق قصدير أسطواني لكل عينة واملأها بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
  6. مجمدة طازجة: اغمر العضلات في OCT ، مع الاحتفاظ بها بشكل عمودي على مركب OCT (الشكل 3C). استخدم حامل إبرة لنقل القالب إلى الأيزوبنتان المبرد مسبقا. انتظر 40 ثانية حتى يصبح OCT أبيض وصلب (الشكل 3D).
    ملاحظة: تأكد من أن موضع القالب ليس منخفضا جدا. خلاف ذلك ، سوف يختلط الأيزوبنتان مع OCT ويضعف عملية تجميد العضلات. يجب أن يكون مستوى OCT في القالب مشابها لارتفاع عينة العضلات. تجنب كمية زائدة من OCT لضمان التجميد السريع والفعال.
  7. تخزين العينات: قم بتخزين عينات العضلات المجمدة الطازجة في لوحات 24 بئر تحمل علامات واضحة. قسم العينات على الفور أو خزنها في -80 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل.

3. التحليل النسيجي

  1. استخدم جهاز التبريد لقطع مقاطع بسمك 10 ميكرومتر من عينة العضلات على شرائح معالجة سطحيا.
  2. ضع الشرائح في الأسيتون المثلج لمدة 20 دقيقة وجففها في الهواء في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.
  3. اغسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تم الاحتفاظ بالشرائح في غرفة الرطوبة لتجنب الجفاف.
  4. سيريوس تلطيخ أحمر
    1. تحضير محلول عمل Sirius Red عن طريق إذابة 0.5 غرام من مسحوق Sirius Red في 500 مل من حمض البكريك المشبع.
    2. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام حل عمل Sirius Red لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق بحمض الخليك 0.5٪.
    4. بعد عملية التلوين ، يجب تجفيف العينات أولا في 95٪ إيثانول لمدة 15 ثانية ، يليه الجفاف في الإيثانول اللامائي لمدة 1 دقيقة. تتضمن الخطوة الأخيرة تركيب الشريحة باستخدام بلسم محايد.
  5. تلطيخ الأنسجة المناعية
    1. قم بتخلل الأقسام بنسبة 0.3٪ Triton في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسل PBS.
    2. بالنسبة لتلطيخ Pax7 ، قم بسد الأقسام باستخدام الكاشف المزود بالمجموعة المشار إليها ؛ لتلطيخ laminin و Pdgfrα ، كتلة مع 5 ٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 5 ٪ مصل الحمير في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الأولية ضد Pax7 و laminin و Pdgfrα طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
    4. احتضان الأقسام بأجسام مضادة ثانوية مترافقة صبغة الفلورسنت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تليها الغسيل باستخدام PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
    5. احتضان مع 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
    6. ضع وسيط التثبيت على القسم ، ضع غطاء الغطاء في الأعلى ، واستخدم طلاء الأظافر لإغلاق غطاء الغطاء.

النتائج

كشف تلطيخ HE و Sirius Red (الشكل 4 والشكل التكميلي S1) عن تجديد كامل لعضلات TA في نموذج إصابة التجمد هذا. في المقابل ، أظهر MAS ضعف تجديد الألياف العضلية وترسب المصفوفة خارج الخلية المفرط. تظهر أنسجة عضلة MAS و TA السليمة في الشكل 4A ، B ، حيث تكو?...

Discussion

هناك مجموعة متنوعة من نماذج الإصابة لدراسة تجديد العضلات والهيكل العظمي ، بما في ذلك استخدام المحفزات الفيزيائية والكيميائية والجراحية10،11،12،13،14،15،16. السموم ا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بمنح من لجنة الصحة والعافية في مقاطعة سيتشوان (رقم المنحة: 21PJ063) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة: 82001031).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeShifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China)1-ml syringe/
AcetoneChron ChemicalsAceton/
Adhesion microscope slidesCitotest Scientific188105/
Animal depilatoryPhygene ScientificPH1877/
BSA (bovine serum albumin)Solarbio Life SciencesA8010/
DAPISolarbio Life SciencesC0065/
Donkey anti-goat Alexa Fluor 488Abcamab1501291:200
donkey serumSolarbio Life SciencesSL050/
Dry IceSinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)rice-shaped dry ice/
IFKine Red Donkey anti-rabbitAbbkine Scientific CompanyA244211:200
Insulation barrels (big)ThermosD600/
Insulation barrels (small)Polar Ware250B/
IsofluraneRWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China)R510-22/
IsopentaneMACKLINM813375/
LamininSigma-AldrichL93931:1000
Liquid nitrogenSinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)//
M.O.M kitVector LaboratoriesBMK-2202
Mice  Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China)5 weeks old/
mounting mediumSolarbio Life SciencesS2100/
Nertral balsamSolarbio Life SciencesG8590/
Pax7Developmental Studies Hybridoma Bank Pax71:5
PdgfraR&D systemsAF10621:40
Sirus Red Staining KitSolarbio Life SciencesG1472/
Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture)Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China)//
Tissue-tek OCTSakura4583/
TritonShanghai Scigrace BiotechABIO-Biofroxx-0006A/
ZoletilVirbacZoletil 50/

References

  1. Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy. Acta Physiologica. 231 (1), e13553 (2021).
  2. Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. Cleft lip and palate. Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).
  3. Pai, B. C. J., Hung, Y. -. T., Wang, R. S. H., Lo, L. -. J. Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).
  4. Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).
  5. Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. To roll the eyes and snap a bite - function, development and evolution of craniofacial muscles. Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).
  6. Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).
  7. Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles. Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).
  8. Cheng, X., et al. Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).
  9. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).
  10. Camacho-Alonso, F., et al. Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix. Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).
  11. LeBoff, M. S., et al. The clinician's guide to prevention and treatment of osteoporosis. Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).
  12. Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nature Communications. 12 (1), 2860 (2021).
  13. Mahdy, M. A. A. Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration. Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).
  14. Guardiola, O., et al. Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515 (2017).
  15. Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss. JCI Insight. 8 (7), e162835 (2023).
  16. Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
  17. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).
  18. Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease. Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).
  19. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  20. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  21. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network. Frontiers In Physiology. 10, 1074 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved