小鼠咬肌冻结损伤建立口面部肌肉纤维化模型

摘要

该协议的目标是建立口面部肌肉纤维化模型。冻伤后小鼠咬肌和胫骨前肌组织学比较证实咬肌纤维化。该模型将有助于进一步研究口面部肌纤维化的潜在机制。

摘要

口面部肌是骨骼肌组织的一个子集，具有独特的进化轨迹和发展起点。与体节衍生的肢体肌肉不同，口面部肌肉起源于分支弓，完全来自颅神经嵴。最近的一项研究表明，口面部肌肉群的再生也不同。然而，其底层的监管机制仍有待揭示。目前的骨骼肌再生模型主要集中在肢体和躯干肌肉上。在该方案中，使用干冰诱导小鼠咬肌和胫骨前肌的冻结损伤，以创建口面部肌肉纤维化模型。两种肌肉之间肌肉卫星细胞和纤维脂肪生成祖细胞的时间动力学不同，导致肌纤维再生受损和细胞外基质沉积过多。借助该模型，可以对口面部区域的肌肉再生进行更深入的研究，以开发针对口面部疾病患者的治疗方法。

引言

口面部肌肉在日常生理活动中至关重要，例如咀嚼、言语、呼吸和面部表情¹。然而，在先天性口面部畸形中，这些肌肉表现出萎缩和纤维化的改变，导致身体健康和社会认知受损².面部重建手术仍然是一线治疗方法，但高达 30-70% 的术后患者仍然患有肌肉流失和肌肉功能障碍 ^3,4 口面部肌肉再生的失败归因于内在因素，这些因素无法单独通过手术来纠正。

口面部肌肉的出现是一种进化上的新奇事物，伴随着复杂的脊椎动物头部和腔室心脏 ^5,6。与体节衍生的肢体对应物不同，口面部肌肉起源于分支弓⁷。这些系统发育和个体发育特征可能使它们易感于不同的再生行为⁸.据报道，当胫骨前肌 （TA） 在暴露于相同程度的损伤后完全再生时，咬肌 （MAS） 肌肉发生了严重的纤维化 ^1,9。然而，人们对再生的根本机制仍然知之甚少。

本....

研究方案

本研究所有动物手术均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2020-114）审查通过。雄性C57BL / 6小鼠（5周龄）在湿度控制（53±2%）和温度控制（23±2°C）设施中饲养，并处于12小时光照/黑暗循环中。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1.冻伤

1. 麻醉：用异氟醚浸泡的棉球镇静小鼠，并以50mg / kg的剂量腹膜内注射tiletamine-zolazepam。术前和术后通过腹膜内注射美洛昔康以 1 mg/kg 的剂量提供镇痛。用兽药膏保护他们的眼睛。在整个过程中，将保持在38°C的加热垫放在手术帘下，为动物提供热支持。将小鼠侧放到手术台上后，用胶带固定小鼠（图1）。通过眼睑反射丧失、矫正反射和踏板退出反射来评估麻醉的充分性。
   注意：使用异氟烷麻醉时，一只手握住鼠标，另一只手握住异氟烷浸泡的棉球。确保棉球与动物保持一定距离，以避免不适和皮肤刺激。
2. 术前脱毛：用电动剃须刀剃掉小鼠小腿和面部的毛发，然后用棉签将脱毛膏涂抹在皮肤上，覆盖咬肌和胫骨前肌。1-2分钟后，用乙醇基手术擦拭物洗去糊状物（图2A 和 图2G）。手术部位通过三....

讨论

有多种损伤模型可用于研究骨骼肌再生，包括使用物理、化学和手术刺激 10,11,12,13,14,15,16。心脏毒素和氯化钡是启动肌肉再生的两种最广泛使用的化学物质^10,11，但它们会导致 ~7.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China)	1-ml syringe	/
Acetone	Chron Chemicals	Aceton	/
Adhesion microscope slides	Citotest Scientific	188105	/
Animal depilatory	Phygene Scientific	PH1877	/
BSA (bovine serum albumin)	Solarbio Life Sciences	A8010	/
DAPI	Solarbio Life Sciences	C0065	/
Donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Abcam	ab150129	1:200
donkey serum	Solarbio Life Sciences	SL050	/
Dry Ice	Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)	rice-shaped dry ice	/
IFKine Red Donkey anti-rabbit	Abbkine Scientific Company	A24421	1:200
Insulation barrels (big)	Thermos	D600	/
Insulation barrels (small)	Polar Ware	250B	/
Isoflurane	RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China)	R510-22	/
Isopentane	MACKLIN	M813375	/
Laminin	Sigma-Aldrich	L9393	1:1000
Liquid nitrogen	Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)	/	/
M.O.M kit	Vector Laboratories	BMK-2202
Mice	Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China)	5 weeks old	/
mounting medium	Solarbio Life Sciences	S2100	/
Nertral balsam	Solarbio Life Sciences	G8590	/
Pax7	Developmental Studies Hybridoma Bank	Pax7	1:5
Pdgfra	R&D systems	AF1062	1:40
Sirus Red Staining Kit	Solarbio Life Sciences	G1472	/
Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture)	Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China)	/	/
Tissue-tek OCT	Sakura	4583	/
Triton	Shanghai Scigrace Biotech	ABIO-Biofroxx-0006A	/
Zoletil	Virbac	Zoletil 50	/