تحضير معلق أحادي الخلية من الشرايين السباتية للفأر لتسلسل الخلية الواحدة

Summary

نصف هنا بروتوكول هضم الخلايا المكون من خطوتين لإعداد تعليق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر.

Abstract

الشرايين السباتية هي أوعية دموية رئيسية في الرقبة تمد الدماغ بالدم والأكسجين، ولكن يحدث تضيق الشريان السباتي عندما تكون الشرايين السباتية مسدودة باللويحات. يعد الكشف عن التركيب الخلوي للشريان السباتي على مستوى الخلية الواحدة أمرا ضروريا لعلاج تصلب الشرايين السباتي. ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لإعداد معلقات أحادية الخلية من الشرايين السباتية. للحصول على بروتوكول مناسب لتفكك الشرايين السباتية الطبيعية على مستوى الخلية الواحدة مع ضرر أقل للخلايا ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين من خلال دمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتريبسين. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. والجدير بالذكر أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي الطبيعي ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، كانت قابلة للاكتشاف في وقت واحد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإعداد تعليق خلية واحدة للأوعية الدموية من الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.

Introduction

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يرتبط بعوامل الخطر مثل ارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم وديناميكا الدم¹. تشعبات الشريان السباتي عرضة للتغيرات الديناميكية الدموية وتؤدي إلى تكوين اللويحات السباتية. يمكن أن يكون العرض السريري لتصلب الشرايين السباتي حادا مثل السكتة الدماغية ونقص التروية الدماغية العابرة ، أو مزمنا مثل نقص التروية الدماغية العابر المتكرر والخرف الوعائي². ميكانيكيا ، اللويحة السباتية هي نتيجة التفاعل بين خلايا جدار الأوعية الدموية المختلفة وخلايا الدم المختلفة في ظل الظروف المرضية. لذلك ، فإن الكشف عن أطلس الخلية الواحدة للأوعية السباتية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية مهم بشكل خاص لمنع وعلاج تطور البلاك السباتي.

يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أحد أقوى تقنيات البحث البيولوجي بسبب دقته الفائقة والكشف عن عدم تجانس الخلية من نفس نوع الخلية من الكائنات الحية ^3,4. استخدم الباحثون تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء البحوث في العديد من المجالات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية⁵ والسرطان⁶. ومع ذلك ، لا يزال فصل الأنسجة بسرعة ودقة إلى خلايا مفردة أحد التحديات الرئيسية. التفكك الأنزيمي هو طريقة شائعة الاستخدام تشمل في الغالب كولاجيناز ، غراء ، تربسين ، DNase ، وهيالورونيداز. على وجه التحديد ، الكولاجين هي أنواع الإنزيمات الرئيسية لعملية الهضم أحادية الخلية ، وخاصة مكونات الكولاجين المائية في الأنسجة الضامة. أنواع مختلفة من الكولاجين قابلة للتطبيق لتفكك الأنسجة المختلفة ، مثل الغدة الثديية⁷ ، الكبيبة⁸ ، زاوية القزحية^{القرنية 9} ، مفصل الركبة 10 ، الشريان الأورطي¹¹ ، والرئة¹². نظرا للخصائص الفسيولوجية الفريدة للأنسجة المختلفة ، قد يسبب التفكك باستخدام نفس الطريقة العديد من المشاكل في الحصول على خلايا مفردة ، مثل انخفاض صلاحية الخلية ، وانخفاض عدد الخلايا ، وحطام الخلايا الكبيرة. لذلك ، فإن اختراع طرق الهضم للأنسجة المختلفة أمر ضروري لإعداد معلقات أحادية الخلية عالية الجودة.

يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة هضم خلوية من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشريان السباتي للفئران البرية. وفقا لخصائص الشريان السباتي ، قمنا بدمج كولاجيناز / إنزيم مع التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية عالي الجودة للشريان السباتي للفأر لأن كولاجيناز يمكن أن يتحلل الكولاجين في الأنسجة السباتية ، والذي تم هضمه بواسطة التربسين في معلق أحادي الخلية. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم تحديد أربعة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم. مزايا هذا البروتوكول هي: 1) يمكن تحديد أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، 2) يتم الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد ، و 3) يمكن تكرارها بسهولة بدون معدات خاصة. هذا البروتوكول مناسب للباحثين المهتمين بدراسة تعدد الخلايا أحادية الخلية للشرايين السباتية للفأر. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا في تفكك الأوعية الدموية الأخرى مع التعديلات المناسبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.

1. الكواشف وإعداد المواد

1. استخدم 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم و 2.5 وحدة / مل من ملح الصوديوم الهيبارين لتحضير محلول التروية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويبرد مسبقا على الثلج عند استخدامه.
2. تحضير كاشف التفكك A الذي يحتوي على 125 CDU / mL كولاجيناز II و 60 U / mL DNase I عن طريق تخفيف 1250 CDU / mL كولاجيناز II و 3000 U / mL DNase I مع HBSS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تحضير كاشف التفكك B الذي يحتوي على تركيز نهائي قدره 0.12٪ تربسين عن طريق تخفيف 1 مل من التربسين الخالي من EDTA بنسبة 0.25٪ (بدون الفينول الأحمر) إلى 1 مل من 1x PBS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. تحضير 10 مل من 1.5٪ FBS و 10 مل من 5٪ FBS في 1x PBS. استخدم 1.5٪ FBS لتجميع الشرايين السباتية والاحتفاظ بها على الثلج قبل الاستخدام. استخدم 5٪ FBS لتحييد الهضم وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. احصل على المواد التجريبية ، بما في ذلك محاقن 1 مل ، ومحاقن 20 مل مع إبر 26-G ، وألواح زراعة الخلايا الستة ، وأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، ومصافي الخلايا المعقمة 40 ميكرومتر ، وحاويات الثلج.

2. إعداد المعدات

1. تعقيم جميع المعدات الجراحية ، بما في ذلك المجهر المجسم ، ومقص التشريح ، ومقص التشريح الدقيق ، والملقط ذي الأطراف الدقيقة.
2. قم بتشغيل عداد الخلايا الآلي واحتفظ به في RT.
3. قم بتشغيل الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية مقدما.
4. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الدقيق إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

3. عزل الشريان السباتي الفأر

1. تخدير الفأر باستخدام 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول عن طريق الحقن داخل الصفاق (0.24 مل لكل 10 جم من وزن الجسم) واقلب الماوس للتحقق مما إذا كان هناك رد فعل تصحيح بعد 3 دقائق. ثم ، القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 75٪ كحول.
2. استخدم مقص تشريح معقم لفتح الجلد وكشف تجويف الصدر. قطع فتح الحجاب الحاجز.
3. استمر في القطع لأعلى إلى الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون بعناية ، مما يعرض الشريان السباتي.
4. قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة.
5. حقن 20 مل من محلول التروية المبرد مسبقا في البطين الأيسر باستخدام حقنة ببطء وبشكل مستمر.
   ملاحظة: إذا نجح التروية ، فإن الأعضاء الغنية بالدم مثل الكبد والطحال والكلى ستتحول إلى اللون الرمادي والأبيض.
6. انزع جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي بمقص تشريح دقيق تحت مجهر مجسم.
   ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة ببطء وحذر لمنع تلف الشريان السباتي.
7. اعزل الشريان السباتي عن الفأر ، واغسله باستخدام 1x PBS لطرد الدم مرة أخرى ، وانقله إلى ستة ألواح تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.

4. هضم الشريان السباتي في تعليق خلية واحدة

1. استخدم مقص التشريح الدقيق لتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في لوحة أخرى لزراعة الخلايا مكونة من 6 آبار تحتوي على 1 مل من 1.5٪ FBS على الجليد.
2. اغسل البطانة بعناية باستخدام 1.5٪ FBS لإزالة الدم المتبقي.
   ملاحظة: يجب أن يكون التنظيف لطيفا وبطيئا لتجنب إصابة الخلايا البطانية.
3. قطع كل الشريان السباتي إلى ما يقرب من 2 مم² قطعة الأنسجة باستخدام مقص التشريح المجهري في 1.5٪ FBS.
4. انقل قطع الأنسجة هذه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع أطراف تجويف عريضة سعة 1 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع.
5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك A.
6. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ماصة بلطف مع ماصة 1 مل كل 10 دقائق.
7. أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا مع ماصة 1 مل.
8. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
9. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك B.
10. ضعيها في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واخلطيها لمدة 5 دقائق إضافية. ماصة بلطف كل 2 دقيقة أثناء الهضم لتنفصل تماما إلى تعليق خلية واحدة.
11. استخدم 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS على الجليد.

5. فحص تعليق الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

1. أضف 10 ميكرولتر من محلول AO / PI إلى 10 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية واخلطه برفق باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
2. ماصة 20 ميكرولتر من الخليط في شريحة الغرفة وانتظر لمدة 1 دقيقة.
3. قم بتحميل الشريحة في أداة عداد الخلايا الآلية.
4. حدد مقايسة جدوى AO / PI ، ثم انتظر تقرير الجودة.
5. استخدم مجموعة كاشف أحادية الخلية 3 بوصة لتوليد حبات هلام أحادية الخلية في المستحلب على وحدة تحكم أحادية الخلية وتضخيم cDNA المشفر في دورة حرارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجموعات كاشف الكروم أحادي الخلية 3ʹ v3.
6. قم بإجراء التسلسل على جهاز التسلسل باستخدام إستراتيجية قراءة مزدوجة النهاية 150 bp (PE150). استخدم تطبيقا برمجيا (Cell Ranger) لتحويل ملفات المكالمات الأساسية الأولية إلى ملفات fastq باستخدام خط أنابيب mkfastq . بعد ذلك ، استخدم خط أنابيب العد ل Cell Ranger لإجراء المحاذاة والتصفية وعد الباركود وعد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) لإنشاء مصفوفات الباركود للمعالم¹³.
7. قم بإجراء تقليل أبعاد البيانات والتصور باستخدام حزمة R Seurat¹⁴.
   1. أولا ، تقرأ الدالة Read10X () ل Seurat في إخراج خط أنابيب Cell Ranger ثم تستخدم مصفوفة العد لإنشاء كائن Seurat. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا التي تحتوي على تعبير عن <200 أو >4000 جين أو نسبة جين الميتوكوندريا التي كانت أكثر من 10٪ بواسطة وظيفة subset () ل Seurat.
   2. استخدم NormalizeData () و FindVariableFeatures() لتسوية البيانات وتحديد 2000 معلم متغير للغاية، على التوالي.
   3. قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) على البيانات المقاسة ، وقم بتجميع الخلايا ذات الخافتات = 30 والدقة = 0.5. أخيرا ، استخدم الدالة RunUMAP () لتصور مجموعات البيانات أحادية الخلية و FindAllMarkers () للعثور على كل علامة حيوية للمجموعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف هذا البروتوكول طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر (الشكل 1). تجمع طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين بين كولاجيناز / DNase مع التربسين لفصل جدار الأوعية الدموية السباتي للفأر بشكل فعال للحصول على معلقات أحادية الخلية عال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية ، حيث تم إنشاء طريقة هضم من خطوتين تدمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتربسين. بعد فحص جودة التعليق أحادي الخلية ، وجدنا أنه يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C