Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’artères carotides de souris pour le séquençage unicellulaire

Résumé

Nous décrivons ici un protocole de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris.

Résumé

Les artères carotides sont les principaux vaisseaux sanguins du cou qui fournissent du sang et de l’oxygène au cerveau, mais la sténose carotidienne se produit lorsque les artères carotides sont obstruées par la plaque. La mise en évidence de la composition cellulaire de l’artère carotide au niveau unicellulaire est essentielle pour traiter l’athérosclérose carotidienne. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir des artères carotides. Afin d’obtenir un protocole approprié pour la dissociation des artères carotides normales au niveau unicellulaire avec moins de dommages aux cellules, nous avons conçu une méthode de digestion en deux étapes en intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, une médiane de ~2500 transcrits par cellule a été détectée dans chaque cellule de l’artère carotide. Notamment, une variété de types de cellules de l’artère carotide normale, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), étaient détectables simultanément. Ce protocole peut être appliqué pour préparer une suspension unicellulaire de vaisseaux sanguins provenant d’autres tissus avec les modifications appropriées.

Introduction

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique associée à des facteurs de risque tels que l’hypertension artérielle, l’hyperlipidémie et l’hémodynamique¹. Les bifurcations de l’artère carotide sont sujettes à des changements hémodynamiques et entraînent la formation de plaques carotidiennes. La présentation clinique de l’athérosclérose carotidienne peut être aiguë comme un accident vasculaire cérébral et une ischémie cérébrale transitoire, ou chronique comme une ischémie cérébrale transitoire récurrente et une démence vasculaire². Mécaniquement, la plaque carotidienne est le résultat de l’interaction entre diff....

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Soochow.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Utilisez 1x PBS sans calcium ni magnésium et 2,5 U/mL de sel d’héparine sodique pour préparer la solution de perfusion. Conserver à 4 °C et prérefroidir sur glace lorsqu’il est utilisé.
2. Préparer le réactif de dissociation A qui contient 125 CDU/mL de collagénase II et 60 U/mL de DNase I en diluant 1250 CDU/mL de collagénase II et 3000 U/mL de DNase I avec HBSS. Conserver à 4 °C jusqu’à uti....

Discussion

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité à partir de l’artère carotide de souris de type sauvage, dans lequel une méthode de digestion en deux étapes intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine a été construite. Après le contrôle de la qualité de la suspension unicellulaire, nous avons constaté qu’elle répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supéri.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C