Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’artères carotides de souris pour le séquençage unicellulaire

Résumé

Nous décrivons ici un protocole de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris.

Résumé

Les artères carotides sont les principaux vaisseaux sanguins du cou qui fournissent du sang et de l’oxygène au cerveau, mais la sténose carotidienne se produit lorsque les artères carotides sont obstruées par la plaque. La mise en évidence de la composition cellulaire de l’artère carotide au niveau unicellulaire est essentielle pour traiter l’athérosclérose carotidienne. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir des artères carotides. Afin d’obtenir un protocole approprié pour la dissociation des artères carotides normales au niveau unicellulaire avec moins de dommages aux cellules, nous avons conçu une méthode de digestion en deux étapes en intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, une médiane de ~2500 transcrits par cellule a été détectée dans chaque cellule de l’artère carotide. Notamment, une variété de types de cellules de l’artère carotide normale, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), étaient détectables simultanément. Ce protocole peut être appliqué pour préparer une suspension unicellulaire de vaisseaux sanguins provenant d’autres tissus avec les modifications appropriées.

Introduction

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique associée à des facteurs de risque tels que l’hypertension artérielle, l’hyperlipidémie et l’hémodynamique¹. Les bifurcations de l’artère carotide sont sujettes à des changements hémodynamiques et entraînent la formation de plaques carotidiennes. La présentation clinique de l’athérosclérose carotidienne peut être aiguë comme un accident vasculaire cérébral et une ischémie cérébrale transitoire, ou chronique comme une ischémie cérébrale transitoire récurrente et une démence vasculaire². Mécaniquement, la plaque carotidienne est le résultat de l’interaction entre différentes cellules de la paroi des vaisseaux et diverses cellules sanguines dans des conditions pathologiques. Par conséquent, la révélation de l’atlas unicellulaire des vaisseaux carotidiens dans des conditions physiologiques et pathologiques est particulièrement importante pour prévenir et traiter le développement de la plaque carotidienne.

Le séquençage de l’ARN unicellulaire est l’une des technologies les plus puissantes de la recherche biologique en raison de sa très haute résolution et de la détection de l’hétérogénéité cellulaire d’organismes d’un même type de cellule ^3,4. Les chercheurs ont utilisé le séquençage de l’ARN unicellulaire pour mener des recherches dans de nombreux domaines, tels que les maladies cardiovasculaires⁵ et le cancer⁶. Cependant, la séparation rapide et précise des tissus en cellules individuelles reste l’un des principaux défis. La dissociation enzymatique est une méthode couramment utilisée qui comprend principalement la collagénase, la papaïne, la trypsine, la DNase et la hyaluronidase. Plus précisément, les collagénases sont les principales espèces enzymatiques pour la digestion unicellulaire, hydrolysant principalement les composants du collagène dans les tissus conjonctifs. Différents types de collagénase sont applicables pour la dissociation de différents tissus, tels que la glande mammaire⁷, le glomérule⁸, l’angle irido-cornéen⁹, l’articulation du genou¹⁰, l’aorte 11 et le poumon¹². En raison des propriétés physiologiques uniques de différents tissus, la dissociation à l’aide de la même méthode peut causer de nombreux problèmes lors de l’acquisition de cellules individuelles, telles qu’une faible viabilité cellulaire, un faible nombre de cellules et de gros débris cellulaires. Par conséquent, l’invention de méthodes de digestion pour différents tissus est essentielle pour préparer des suspensions unicellulaires de haute qualité.

Ce protocole vise à développer une méthode de digestion cellulaire en deux étapes pour préparer une suspension unicellulaire de l’artère carotide de souris de type sauvage. Selon les caractéristiques de l’artère carotide, nous avons combiné la collagénase/DNase avec de la trypsine pour obtenir une suspension unicellulaire de haute qualité de l’artère carotide de la souris, car la collagénase peut hydrolyser le collagène des tissus carotides, qui a ensuite été digéré par la trypsine en une suspension unicellulaire. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, quatre types de cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), ont été identifiés dans les artères carotides normales de souris après digestion. Les avantages de ce protocole sont les suivants : 1) plusieurs types de cellules dans l’artère carotide peuvent être identifiés, 2) la viabilité cellulaire est bien préservée et 3) il peut être facilement répété sans équipement spécial. Ce protocole convient aux chercheurs qui s’intéressent à l’étude de la multiomique unicellulaire des artères carotides de souris. Ce protocole peut également être utile dans la dissociation d’autres vaisseaux sanguins avec des modifications appropriées.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Soochow.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Utilisez 1x PBS sans calcium ni magnésium et 2,5 U/mL de sel d’héparine sodique pour préparer la solution de perfusion. Conserver à 4 °C et prérefroidir sur glace lorsqu’il est utilisé.
2. Préparer le réactif de dissociation A qui contient 125 CDU/mL de collagénase II et 60 U/mL de DNase I en diluant 1250 CDU/mL de collagénase II et 3000 U/mL de DNase I avec HBSS. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
3. Préparer le réactif de dissociation B qui contient une concentration finale de 0,12 % de trypsine en diluant 1 mL de trypsine sans EDTA à 0,25 % (sans rouge phénolique) dans 1 mL de PBS 1x. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
4. Préparez 10 mL de FBS à 1,5 % et 10 mL de FBS à 5 % dans 1x PBS. Utilisez 1,5 % de FBS pour regrouper les artères carotides et gardez-les sur la glace avant utilisation. Utilisez 5 % de FBS pour neutraliser la digestion et conservez-le à température ambiante (RT).
5. Procurez-vous le matériel expérimental, y compris des seringues de 1 ml, des seringues de 20 ml avec des aiguilles de 26 G, des plaques de culture cellulaire à six puits, des tubes à centrifuger de 1,5 ml, des tamis cellulaires stériles de 40 μm et des récipients à glace.

2. Préparation de l’équipement

1. Stérilisez tout le matériel chirurgical, y compris un microscope stéréoscopique, des ciseaux à dissection, des ciseaux à micro-dissection et des pinces à pointe fine.
2. Allumez le compteur de cellules automatisé et maintenez-le à RT.
3. Allumez le bain-marie à 37 °C à l’avance.
4. Prérefroidir la microcentrifugeuse à 4 °C avant utilisation.

3. Isolement de l’artère carotide de la souris

1. Anesthésier la souris avec du tribromoéthanol à 1,25 % par injection intrapéritonéale (0,24 mL pour 10 g de poids corporel) et retourner la souris pour vérifier s’il y a un réflexe de redressement après 3 min. Ensuite, euthanasiez la souris par luxation cervicale et allongez-la sur le dos. Vaporisez la peau de la souris avec de l’alcool à 75%.
2. Utilisez des ciseaux de dissection stérilisés pour ouvrir la peau et exposer la cavité thoracique. Coupez le diaphragme ouvert.
3. Continuez à couper vers le haut jusqu’à la mâchoire inférieure et retirez soigneusement l’excès de tissus conjonctifs et de graisse, exposant ainsi l’artère carotide.
4. Coupez la veine cave inférieure de la souris pour faire circuler le sang hors de la circulation fermée.
5. Injecter 20 mL de solution de perfusion préréfrigérée dans le ventricule gauche à l’aide d’une seringue lentement et continuellement.
   REMARQUE : Si la perfusion réussit, les organes riches en sang tels que le foie, la rate et les reins deviendront gris-blanc.
6. Décollez toute la graisse et les tissus conjonctifs autour de l’artère carotide avec des ciseaux de micro-dissection sous un microscope stéréoscopique.
   REMARQUE : Cette étape doit être effectuée lentement et soigneusement pour éviter d’endommager l’artère carotide.
7. Isolez l’artère carotide de la souris, lavez-la avec 1x PBS pour rincer à nouveau le sang et transférez-la dans des plaques à six puits contenant 1,5% de FBS sur glace.

4. Digestion de l’artère carotide en suspension unicellulaire

1. Utilisez des ciseaux de micro-dissection pour disséquer l’artère carotide longitudinalement et posez-la à plat dans une autre plaque de culture cellulaire à 6 puits contenant 1 mL de FBS à 1,5 % sur glace.
2. Rincez soigneusement l’intima avec 1,5 % de FBS pour éliminer le sang résiduel.
   REMARQUE : Le rinçage doit être doux et lent pour éviter de blesser les cellules endothéliales.
3. Coupez chaque artère carotide en 2 morceaux de tissu d’environ² mm à l’aide de ciseaux de microdissection dans du FBS à 1,5 %.
4. Transférez ces morceaux de tissu dans un tube à centrifuger de 1,5 mL avec des embouts de 1 mL de large, centrifugez à 400 x g pendant 5 min à 4 °C pour faire couler les tissus au fond.
5. Éliminer le surnageant et remettre les tissus en suspension dans 500 μL de réactif de dissociation A.
6. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h. Pipeter délicatement avec une pipette de 1 ml toutes les 10 minutes.
7. Ajouter 500 μL de FBS à 5 % dans le tube et bien mélanger avec une pipette de 1 mL.
8. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire stérile de 40 μm dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
9. Retirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de réactif de dissociation B.
10. Placer dans un bain-marie à 37 °C et digérer encore 5 min. Pipeter doucement toutes les 2 minutes pendant la digestion pour se dissocier complètement en une suspension unicellulaire.
11. Utiliser 200 μL de FBS à 5 % pour mettre fin à la réaction de digestion et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
12. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de 1x PBS sur glace.

5. Examen de la suspension cellulaire et séquençage de l’ARN unicellulaire

1. Ajouter 10 μL de solution AO/PI dans 10 μL de suspension unicellulaire et mélanger délicatement avec une pipette de 20 μL.
2. Pipeter 20 μL du mélange dans la chambre, glisser et attendre 1 min.
3. Chargez la lame dans l’instrument de comptage automatisé des cellules.
4. Sélectionnez le test de viabilité AO/PI , puis attendez le rapport de qualité.
5. Utilisez un kit de réactifs à 3 cellules uniques pour générer des billes de gel unicellulaires dans l’émulsion sur un contrôleur à cellule unique et amplifiez l’ADNc à code-barres dans un thermocycleur en suivant le protocole du fabricant.
   REMARQUE : Ici, les kits de réactifs Chromium Single Cell 3ʹReactive v3 ont été utilisés.
6. Effectuez le séquençage sur un séquenceur avec une stratégie de lecture appariée de 150 pb (PE150). Utilisez une application logicielle (Cell Ranger) pour convertir les fichiers d’appel de base bruts en fichiers fastq à l’aide du pipeline mkfastq . Ensuite, utilisez le pipeline de comptage de Cell Ranger pour effectuer l’alignement, le filtrage, le comptage de codes-barres et le comptage d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) afin de générer des matrices de codes-barres de caractéristiques¹³.
7. Effectuez la réduction de la dimensionnalité et la visualisation des données avec le package R Seurat¹⁴.
   1. Tout d’abord, la fonction Read10X() de Seurat lit dans la sortie du pipeline Cell Ranger, puis utilise la matrice de comptage pour créer un objet Seurat. Ensuite, filtrez les cellules avec une expression de <200 ou > 4000 gènes ou un rapport de gènes mitochondriaux supérieur à 10% par la fonction subset() de Seurat.
   2. Utilisez NormalizeData () et FindVariableFeatures() pour normaliser les données et identifier 2000 entités hautement variables, respectivement.
   3. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP) sur les données mises à l’échelle et regroupez les cellules avec des gradations = 30 et une résolution = 0,5. Enfin, utilisez la fonction RunUMAP () pour visualiser les jeux de données à cellule unique et FindAllMarkers() pour rechercher chaque biomarqueur de cluster.

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Résultats

Ce protocole décrit une méthode de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris (Figure 1). Cette méthode de digestion cellulaire en deux étapes combine la collagénase/DNase avec la trypsine pour dissocier efficacement la paroi vasculaire carotidienne de la souris afin d’obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité pour le séquençage unicellulaire. Après dissociation, la concentration cellula...

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Discussion

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité à partir de l’artère carotide de souris de type sauvage, dans lequel une méthode de digestion en deux étapes intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine a été construite. Après le contrôle de la qualité de la suspension unicellulaire, nous avons constaté qu’elle répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supéri...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C