Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.

Resumo

As artérias carótidas são os principais vasos sanguíneos do pescoço que fornecem sangue e oxigênio ao cérebro, mas a estenose carotídea ocorre quando as artérias carótidas são obstruídas por placas. Revelar a composição celular da artéria carótida em nível unicelular é essencial para o tratamento da aterosclerose carotídea. No entanto, não há um protocolo pronto para o uso para a preparação de suspensões unicelulares das artérias carótidas. Para obter um protocolo adequado para a dissociação das artérias carótidas normais em nível unicelular com menor dano às células, projetamos um método de digestão em duas etapas, integrando o processo de digestão da colagenase/DNase e tripsina. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após o processamento de dados de célula única, uma mediana de ~2500 transcritos por célula foi detectada em cada célula da artéria carótida. Notavelmente, uma variedade de tipos celulares da artéria carótida normal, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram detectadas simultaneamente. Este protocolo pode ser aplicado para preparar uma suspensão unicelular de vasos sanguíneos de outros tecidos com modificações apropriadas.

Introdução

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada a fatores de risco como hipertensão arterial, hiperlipidemia e^{hemodinâmica1}. As bifurcações da artéria carótida são propensas a alterações hemodinâmicas e levam à formação de placas carotídeas. A apresentação clínica da aterosclerose carotídea pode ser aguda, como acidente vascular cerebral e isquemia cerebral transitória, ou crônica, como isquemia cerebral transitória recorrente e demência^vascular2. Mecanicamente, a placa carotídea é o resultado da interação entre diferentes células da parede do vaso e várias células sanguíneas em condições patológicas. Portanto, revelar o atlas unicelular dos vasos carotídeos em condições fisiológicas e patológicas é particularmente importante para prevenir e tratar o desenvolvimento da placa carotídea.

O sequenciamento de RNA unicelular é uma das mais poderosas tecnologias de pesquisa biológica devido à sua resolução ultra-alta e detecção de heterogeneidade celular a partir de um mesmo tipo celular de organismos ^3,4. Pesquisadores têm usado o sequenciamento de RNA de célula única para conduzir pesquisas em muitos campos, como doenças cardiovasculares⁵ e câncer⁶. No entanto, separar os tecidos em células isoladas de forma rápida e precisa ainda é um dos principais desafios. A dissociação enzimática é um método comumente usado que inclui predominantemente colagenase, papaína, tripsina, DNase e hialuronidase. Especificamente, as colagenases são as principais espécies enzimáticas para digestão unicelular, principalmente hidrolisando componentes do colágeno em tecidos conjuntivos. Diferentes tipos de colagenases são aplicáveis para a dissociação de diferentes tecidos, como glândula^mamária7, glomérulo^{8, ângulo} iridocorneano9, articulação do joelho 10, aorta^{11 e pulmão 12}. Devido às propriedades fisiológicas únicas de diferentes tecidos, a dissociação usando o mesmo método pode causar muitos problemas na aquisição de células únicas, como baixa viabilidade celular, baixo número de células e grandes debris celulares. Portanto, a invenção de métodos de digestão para diferentes tecidos é essencial para a preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade.

Este protocolo visa desenvolver um método de digestão celular em duas etapas para preparar uma suspensão unicelular da artéria carótida de camundongos selvagens. De acordo com as características da artéria carótida, combinamos colagenase/DNase com tripsina para obter uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongo, pois a colagenase pode hidrolisar o colágeno dos tecidos carotídeos, que foi posteriormente digerido pela tripsina em uma suspensão unicelular. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após processamento de dados de célula única, quatro tipos celulares, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram identificados em artérias carótidas normais de camundongos após a digestão. As vantagens desse protocolo são que: 1) múltiplos tipos celulares na artéria carótida podem ser identificados, 2) a viabilidade celular está bem preservada e 3) pode ser facilmente repetida sem equipamento especial. Este protocolo é adequado para pesquisadores interessados em estudar a multiômica unicelular das artérias carótidas de camundongos. Este protocolo também pode ser útil na dissociação de outros vasos sanguíneos com modificações apropriadas.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Soochow.

1. Preparação de reagentes e materiais

1. Utilizar 1x PBS sem cálcio e magnésio e 2,5 U/mL de sal de heparina sódica para preparar a solução de perfusão. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado.
2. Preparar o reagente de dissociação A que contém 125 CDU/mL colagenase II e 60 U/mL DNase I diluindo 1250 CDU/mL colagenase II e 3000 U/mL DNase I com HBSS. Conservar a 4 °C até à utilização.
3. Preparar o reagente de dissociação B que contém uma concentração final de 0,12% de tripsina diluindo 1 mL de tripsina livre de EDTA a 0,25% (sem vermelho de fenol) em 1 mL de 1x PBS. Conservar a 4 °C até à utilização.
4. Preparar 10 mL de FBS a 1,5% e 10 mL de FBS a 5% em 1x PBS. Use 1,5% FBS para agrupar as artérias carótidas e manter no gelo antes de usar. Use 5% FBS para neutralizar a digestão e armazenar à temperatura ambiente (RT).
5. Obter os materiais experimentais, incluindo seringas de 1 mL, seringas de 20 mL com agulhas de 26 G, placas de cultura de células de seis poços, tubos de centrífuga de 1,5 mL, filtros de células estéreis de 40 μm e recipientes de gelo.

2. Preparação do equipamento

1. Esterilizar todo o equipamento cirúrgico, incluindo microscópio estereoscópico, tesoura dissecante, tesoura microdissecante e pinça de ponta fina.
2. Ligue o contador de células automatizado e mantenha-o no RT.
3. Ligue o banho-maria a 37 °C com antecedência.
4. Pré-resfriar a microcentrífuga a 4 °C antes de usar.

3. Isolamento da artéria carótida de camundongos

1. Anestesiar o camundongo com tribromoetanol a 1,25% por injeção intraperitoneal (0,24 mL para cada 10 g de peso corporal) e virar o mouse para verificar se há reflexo de endireitamento após 3 min. Em seguida, eutanasiar o camundongo por deslocamento cervical e deitá-lo em suas costas. Borrife a pele do rato com álcool a 75%.
2. Use tesoura dissecante esterilizada para abrir a pele e expor a cavidade torácica. Abra o diafragma.
3. Continue cortando para cima até a mandíbula inferior e remova cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo e gordura, expondo a artéria carótida.
4. Corte a veia cava inferior do rato para fazer o sangue fluir para fora da circulação fechada.
5. Injetar 20 mL de solução de perfusão pré-resfriada no ventrículo esquerdo com uma seringa lenta e continuamente.
   NOTA: Se a perfusão for bem-sucedida, os órgãos ricos em sangue, como o fígado, o baço e os rins, ficarão branco-acinzentados.
6. Descasque toda a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da artéria carótida com uma tesoura microdissecante sob um microscópio estereoscópico.
   NOTA: Esta etapa deve ser feita de forma lenta e cuidadosa para evitar danos à artéria carótida.
7. Isole a artéria carótida do rato, lave com 1x PBS para lavar o sangue novamente e transfira para placas de seis poços contendo 1,5% de SFB no gelo.

4. Digestão da artéria carótida em suspensão unicelular

1. Use tesoura microdissecante para dissecar a artéria carótida longitudinalmente e deitar plana em outra placa de cultura celular de 6 poços contendo 1 mL de SFB a 1,5% sobre gelo.
2. Lave a íntima cuidadosamente com FBS a 1,5% para remover o sangue residual.
   NOTA: O rubor deve ser suave e lento para evitar lesões nas células endoteliais.
3. Cortar cada artéria carótida em aproximadamente 2 mm² pedaços de tecido usando tesoura microdissecante em SFB a 1,5%.
4. Transfira esses pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 1,5 mL com pontas de 1 mL de diâmetro largo, centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 °C para afundar os tecidos até o fundo.
5. Eliminar o sobrenadante e ressuspender os tecidos em 500 μL do reagente de dissociação A.
6. Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C durante 1 h. Pipetar suavemente com uma pipeta de 1 mL a cada 10 min.
7. Adicione 500 μL de FBS a 5% no tubo e misture bem com uma pipeta de 1 mL.
8. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células estéreis de 40 μm para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C.
9. Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 μL de reagente de dissociação B.
10. Coloque em banho-maria a 37 °C e digerir por mais 5 min. Pipetar suavemente a cada 2 minutos durante a digestão para dissociar totalmente em uma suspensão de célula única.
11. Use 200 μL de FBS a 5% para encerrar a reação de digestão e centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C.
12. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 100 μL de 1x PBS sobre gelo.

5. Exame de suspensão celular e sequenciamento de RNA de célula única

1. Adicionar 10 μL de solução AO/PI em 10 μL de suspensão de célula única e misturar suavemente com uma pipeta de 20 μL.
2. Pipetar 20 μL da mistura para a câmara deslizar e esperar por 1 min.
3. Carregue o slide no instrumento de contador de células automatizado.
4. Selecione o ensaio de viabilidade AO/PI e aguarde o relatório de qualidade.
5. Use um kit de reagente de célula única de 3' para gerar esferas de gel de célula única na emulsão em um controlador de célula única e amplificar o cDNA com código de barras em um termociclador seguindo o protocolo do fabricante.
   NOTA: Aqui, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 foi usado.
6. Execute o sequenciamento em um sequenciador com uma estratégia de leitura de 150 pb (PE150) emparelhada. Use um aplicativo de software (Cell Ranger) para converter arquivos de chamada base brutos em arquivos fastq usando o pipeline mkfastq . Em seguida, use o Pipeline de Contagem do Cell Ranger para executar alinhamento, filtragem, contagem de código de barras e contagem de identificador molecular exclusivo (UMI) para gerar matrizes de código de barras de recurso¹³.
7. Realize a redução e visualização da dimensionalidade dos dados com o pacote R Seurat¹⁴.
   1. Primeiro, a função Read10X() do Seurat lê na saída do pipeline do Cell Ranger e, em seguida, usa a matriz de contagem para criar um objeto Seurat. Em seguida, filtre as células com expressão de <200 ou >4000 genes ou uma razão gênica mitocondrial que foi superior a 10% pela função subset() de Seurat.
   2. Use NormalizeData () e FindVariableFeatures() para normalizar os dados e identificar 2000 recursos altamente variáveis, respectivamente.
   3. Execute a análise de componente principal (PCA) nos dados dimensionados e agrupe as células com dims = 30 e resolução = 0,5. Finalmente, use a função RunUMAP () para visualizar os conjuntos de dados de célula única e FindAllMarkers() para localizar cada biomarcador de cluster.

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Resultados

Este protocolo descreve um método de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular das artérias carótidas de camundongos (Figura 1). Este método de digestão celular em duas etapas combina colagenase/DNase com tripsina para dissociar efetivamente a parede vascular carotídea de camundongos para obter suspensões unicelulares de alta qualidade para sequenciamento de célula única. Após a dissociação, a concentração e a viabilidade celular foram calcula...

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Discussão

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongos selvagens, no qual um método de digestão em duas etapas integrando o processo de digestão de colagenase/DNase e tripsina foi construído. Após a verificação de qualidade da suspensão de célula única, verificamos que ela satisfazia os requisitos para sequenciamento de célula única, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Além disso, ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C