Tek Hücreli Dizileme için Fare Karotis Arterlerinden Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması

Özet

Burada, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim protokolünü açıklıyoruz.

Özet

Karotis arterler, boyundaki beyne kan ve oksijen sağlayan ana kan damarlarıdır, ancak karotis arterleri plak tarafından tıkandığında karotis darlığı meydana gelir. Karotis arterin hücresel bileşiminin tek hücre düzeyinde ortaya çıkarılması, karotis aterosklerozunun tedavisi için esastır. Bununla birlikte, karotis arterlerden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Normal karotis arterlerin tek hücre düzeyinde hücrelere daha az zarar vererek ayrışması için uygun bir protokol elde etmek için, kollajenaz/DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre ederek iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, her karotis arter hücresinde hücre başına ortalama ~ 2500 transkript tespit edildi. Özellikle, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere normal karotis arterin çeşitli hücre tipleri aynı anda tespit edilebilirdi. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer dokulardan kan damarlarının tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için uygulanabilir.

Giriş

Ateroskleroz, yüksek tansiyon, hiperlipidemi ve hemodinamik gibi risk faktörleriyle ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır¹. Karotis arter bifurkasyonları hemodinamik değişikliklere eğilimlidir ve karotis plak oluşumuna yol açar. Karotis aterosklerozunun klinik prezentasyonu inme ve geçici serebral iskemi gibi akut veya tekrarlayan geçici serebral iskemi ve vasküler demans gibi kronik olabilir². Mekanik olarak karotis plak, patolojik koşullar altında farklı damar duvarı hücreleri ve çeşitli kan hücreleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullar altında karotis damarlarının tek h....

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktifler ve malzeme hazırlama

1. Perfüzyon çözeltisini hazırlamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS ve 2.5 U / mL heparin sodyum tuzu kullanın. 4 °C'de saklayın ve kullanıldığında buz üzerinde ön soğutun.
2. 1250 CDU/mL kollajenaz II ve 3000 U/mL DNaz I'i HBSS ile seyrelterek 125 CDU/mL kollajenaz II ve 60 U/mL DNaz I içeren ayrışma reaktifi A'yı hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
3. 1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini (fenol kırmızısı olmadan) 1 m....

Tartışmalar

Burada, kollajenaz / DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre eden iki aşamalı bir sindirim yönteminin oluşturulduğu vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tek hücreli süspansiyonun kalite kontrolünden sonra, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığını gördük. Ayrıca, tek hücreli veri işlemeden sonra VSMC.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C