Preparazione di una sospensione unicellulare da arterie carotidi di topo per il sequenziamento di singole cellule

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare delle arterie carotidi di topo.

Abstract

Le arterie carotidi sono i principali vasi sanguigni del collo che forniscono sangue e ossigeno al cervello, ma la stenosi carotidea si verifica quando le arterie carotidi sono ostruite dalla placca. Rivelare la composizione cellulare dell'arteria carotide a livello di singola cellula è essenziale per il trattamento dell'aterosclerosi carotidea. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per la preparazione di sospensioni unicellulari da arterie carotidi. Per ottenere un protocollo adatto per la dissociazione delle arterie carotidi normali a livello di singola cellula con meno danni alle cellule, abbiamo progettato un metodo di digestione in due fasi integrando il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati di una singola cellula, è stata rilevata una mediana di ~2500 trascritti per cellula in ciascuna cellula dell'arteria carotide. In particolare, una varietà di tipi di cellule della normale arteria carotide, tra cui le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), i fibroblasti, le cellule endoteliali (EC) e i macrofagi e le cellule dendritiche (Mφ/DC), erano rilevabili contemporaneamente. Questo protocollo può essere applicato per preparare una sospensione unicellulare di vasi sanguigni di altri tessuti con opportune modifiche.

Introduzione

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica associata a fattori di rischio come l'ipertensione, l'iperlipidemia e l'emodinamica¹. Le biforcazioni dell'arteria carotide sono soggette a cambiamenti emodinamici e portano alla formazione di placche carotidi. La presentazione clinica dell'aterosclerosi carotidea può essere acuta, come ictus e ischemia cerebrale transitoria, o cronica, come ischemia cerebrale transitoria ricorrente e demenza vascolare². Meccanicamente, la placca carotidea è il risultato dell'interazione tra diverse cellule della parete dei vasi e varie cellule del sangue in condizioni patologiche. Per....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Soochow.

1. Preparazione di reagenti e materiali

1. Utilizzare 1x PBS senza calcio e magnesio e 2,5 U/mL di sale sodico di eparina per preparare la soluzione di perfusione. Conservare a 4 °C e preraffreddare su ghiaccio al momento dell'uso.
2. Preparare il reagente di dissociazione A che contenga 125 CDU/mL collagenasi II e 60 U/mL DNasi I diluendo 1250 CDU/mL collagenasi II e 3000 U/mL DNasi I con HBSS. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
....

Discussione

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'arteria carotide di topi wild-type, in cui è stato costruito un metodo di digestione in due fasi che integra il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Dopo il controllo di qualità della sospensione a singola cellula, abbiamo scoperto che soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cel.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C