Preparazione di una sospensione unicellulare da arterie carotidi di topo per il sequenziamento di singole cellule

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare delle arterie carotidi di topo.

Abstract

Le arterie carotidi sono i principali vasi sanguigni del collo che forniscono sangue e ossigeno al cervello, ma la stenosi carotidea si verifica quando le arterie carotidi sono ostruite dalla placca. Rivelare la composizione cellulare dell'arteria carotide a livello di singola cellula è essenziale per il trattamento dell'aterosclerosi carotidea. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per la preparazione di sospensioni unicellulari da arterie carotidi. Per ottenere un protocollo adatto per la dissociazione delle arterie carotidi normali a livello di singola cellula con meno danni alle cellule, abbiamo progettato un metodo di digestione in due fasi integrando il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati di una singola cellula, è stata rilevata una mediana di ~2500 trascritti per cellula in ciascuna cellula dell'arteria carotide. In particolare, una varietà di tipi di cellule della normale arteria carotide, tra cui le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), i fibroblasti, le cellule endoteliali (EC) e i macrofagi e le cellule dendritiche (Mφ/DC), erano rilevabili contemporaneamente. Questo protocollo può essere applicato per preparare una sospensione unicellulare di vasi sanguigni di altri tessuti con opportune modifiche.

Introduzione

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica associata a fattori di rischio come l'ipertensione, l'iperlipidemia e l'emodinamica¹. Le biforcazioni dell'arteria carotide sono soggette a cambiamenti emodinamici e portano alla formazione di placche carotidi. La presentazione clinica dell'aterosclerosi carotidea può essere acuta, come ictus e ischemia cerebrale transitoria, o cronica, come ischemia cerebrale transitoria ricorrente e demenza vascolare². Meccanicamente, la placca carotidea è il risultato dell'interazione tra diverse cellule della parete dei vasi e varie cellule del sangue in condizioni patologiche. Pertanto, rivelare l'atlante unicellulare dei vasi carotidei in condizioni fisiologiche e patologiche è particolarmente importante per prevenire e trattare lo sviluppo della placca carotidea.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è una delle tecnologie più potenti della ricerca biologica grazie alla sua altissima risoluzione e al rilevamento dell'eterogeneità cellulare dallo stesso tipo di cellule di organismi ^3,4. I ricercatori hanno utilizzato il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per condurre ricerche in molti campi, come le malattie cardiovascolari⁵ e il cancro⁶. Tuttavia, separare in modo rapido e accurato i tessuti in singole cellule è ancora una delle sfide principali. La dissociazione enzimatica è un metodo comunemente usato che include prevalentemente collagenasi, papaina, tripsina, DNasi e ialuronidasi. In particolare, le collagenasi sono le principali specie enzimatiche per la digestione unicellulare, principalmente idrolizzando i componenti del collagene nei tessuti connettivi. Diversi tipi di collagenasi sono applicabili per la dissociazione di diversi tessuti, come la ghiandola mammaria⁷, il glomerulo⁸, l'angolo iridocorneale⁹, l'articolazione del ginocchio¹⁰, l'aorta 11 e il polmone¹². A causa delle proprietà fisiologiche uniche dei diversi tessuti, la dissociazione con lo stesso metodo può causare molti problemi nell'acquisizione di singole cellule, come bassa vitalità cellulare, basso numero di cellule e detriti cellulari di grandi dimensioni. Pertanto, l'invenzione di metodi di digestione per diversi tessuti è essenziale per preparare sospensioni unicellulari di alta qualità.

Questo protocollo mira a sviluppare un metodo di digestione cellulare in due fasi per preparare una sospensione unicellulare dell'arteria carotide di topi wild-type. In base alle caratteristiche dell'arteria carotide, abbiamo combinato la collagenasi/DNasi con la tripsina per ottenere una sospensione unicellulare di alta qualità dell'arteria carotide del topo perché la collagenasi può idrolizzare il collagene dei tessuti carotidi, che è stato ulteriormente digerito dalla tripsina in una sospensione unicellulare. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati a singola cellula, quattro tipi di cellule, tra cui cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), fibroblasti, cellule endoteliali (EC) e macrofagi e cellule dendritiche (Mφ/DC), sono stati identificati nelle arterie carotidi di topo normali dopo la digestione. I vantaggi di questo protocollo sono che: 1) è possibile identificare più tipi di cellule nell'arteria carotide, 2) la vitalità cellulare è ben preservata e 3) può essere facilmente ripetuto senza apparecchiature speciali. Questo protocollo è adatto ai ricercatori interessati a studiare la multiomica a singola cellula delle arterie carotidi di topo. Questo protocollo può anche essere utile nella dissociazione di altri vasi sanguigni con opportune modifiche.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Soochow.

1. Preparazione di reagenti e materiali

1. Utilizzare 1x PBS senza calcio e magnesio e 2,5 U/mL di sale sodico di eparina per preparare la soluzione di perfusione. Conservare a 4 °C e preraffreddare su ghiaccio al momento dell'uso.
2. Preparare il reagente di dissociazione A che contenga 125 CDU/mL collagenasi II e 60 U/mL DNasi I diluendo 1250 CDU/mL collagenasi II e 3000 U/mL DNasi I con HBSS. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
3. Preparare il reagente di dissociazione B che contenga una concentrazione finale di tripsina dello 0,12% diluendo 1 mL di tripsina senza EDTA allo 0,25% (senza rosso fenolo) in 1 mL di PBS 1x. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
4. Preparare 10 mL di FBS all'1,5% e 10 mL di FBS al 5% in 1x PBS. Utilizzare l'1,5% di FBS per raggruppare le arterie carotidi e mantenere il ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare FBS al 5% per neutralizzare la digestione e conservare a temperatura ambiente (RT).
5. Procuratevi i materiali sperimentali, tra cui siringhe da 1 mL, siringhe da 20 mL con aghi da 26 G, piastre per colture cellulari a sei pozzetti, provette da centrifuga da 1,5 mL, filtri per cellule sterili da 40 μm e contenitori per il ghiaccio.

2. Preparazione dell'attrezzatura

1. Sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche, tra cui un microscopio stereoscopico, forbici da dissezione, forbici da micro-dissezione e pinze a punta fine.
2. Attivare il contatore automatico di cellule e mantenerlo a RT.
3. Accendere il bagnomaria a 37 °C in anticipo.
4. Preraffreddare la microcentrifuga a 4 °C prima dell'uso.

3. Isolamento dell'arteria carotide del topo

1. Anestetizzare il topo utilizzando tribromoetanolo all'1,25% mediante iniezione intraperitoneale (0,24 ml per ogni 10 g di peso corporeo) e capovolgere il topo per verificare se c'è un riflesso di raddrizzamento dopo 3 minuti. Quindi, sopprimere il topo con lussazione cervicale e adagiarlo sulla schiena. Spruzzare la pelle del topo con alcol al 75%.
2. Usa forbici da dissezione sterilizzate per aprire la pelle ed esporre la cavità toracica. Aprire il diaframma.
3. Continuare a tagliare verso l'alto fino alla mascella inferiore e rimuovere con cura i tessuti connettivi e il grasso in eccesso, esponendo l'arteria carotide.
4. Taglia la vena cava inferiore del topo per far defluire il sangue dalla circolazione chiusa.
5. Iniettare 20 mL di soluzione di perfusione preraffreddata nel ventricolo sinistro con una siringa lentamente e continuamente.
   NOTA: Se la perfusione ha successo, gli organi ricchi di sangue come il fegato, la milza e i reni diventeranno grigio-bianchi.
6. Staccare tutti i tessuti adiposi e connettivi intorno all'arteria carotide con forbici da micro-dissezione al microscopio stereoscopico.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito lentamente e con attenzione per evitare danni all'arteria carotide.
7. Isolare l'arteria carotide dal topo, lavare con 1x PBS per lavare nuovamente il sangue e trasferire in piastre a sei pozzetti contenenti l'1,5% di FBS su ghiaccio.

4. Digestione dell'arteria carotide in sospensione unicellulare

1. Utilizzare forbici da micro-dissezione per sezionare longitudinalmente l'arteria carotide e distenderla in un'altra piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti contenente 1 ml di FBS all'1,5% su ghiaccio.
2. Sciacquare accuratamente l'intima con FBS all'1,5% per rimuovere il sangue residuo.
   NOTA: Il lavaggio deve essere delicato e lento per evitare di danneggiare le cellule endoteliali.
3. Tagliare ciascuna arteria carotide in circa 2 mm² pezzi di tessuto utilizzando forbici da microdissezione in FBS all'1,5%.
4. Trasferire questi pezzi di tessuto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL con punte larghe da 1 mL, centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C per affondare i tessuti sul fondo.
5. Scartare il surnatante e risospendere i tessuti in 500 μL di reagente di dissociazione A.
6. Mettere il tubo a bagnomaria a 37 °C per 1 h. Pipettare delicatamente con una pipetta da 1 mL ogni 10 min.
7. Aggiungere 500 μL di FBS al 5% nella provetta e mescolare bene con una pipetta da 1 mL.
8. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare sterile da 40 μm in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
9. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di reagente di dissociazione B.
10. Mettere a bagnomaria a 37 °C e digerire per altri 5 minuti. Pipettare delicatamente ogni 2 minuti durante la digestione per dissociarsi completamente in una sospensione unicellulare.
11. Utilizzare 200 μL di FBS al 5% per terminare la reazione di digestione e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
12. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μL di 1x PBS su ghiaccio.

5. Esame della sospensione cellulare e sequenziamento dell'RNA a singola cellula

1. Aggiungere 10 μL di soluzione AO/PI in 10 μL di sospensione unicellulare e miscelare delicatamente con una pipetta da 20 μL.
2. Pipettare 20 μL di miscela nel vetrino della camera e attendere 1 minuto.
3. Caricare il vetrino nello strumento contatore automatico di cellule.
4. Selezionare il test di vitalità AO/PI , quindi attendere il rapporto di qualità.
5. Utilizzare un kit di reagenti 3ʹ a cellula singola per generare perle di gel unicellulare nell'emulsione su un controller a cellula singola e amplificare il cDNA con codice a barre in un termociclatore seguendo il protocollo del produttore.
   NOTA: In questo caso è stato utilizzato il kit di reagenti 3 a cella singola di cromo v3.
6. Eseguire il sequenziamento su un sequencer con una strategia di lettura a 150 bp (PE150) a due estremità. Utilizzare un'applicazione software (Cell Ranger) per convertire i file di chiamata di base non elaborati in file fastq utilizzando la pipeline mkfastq . Quindi, utilizzare la pipeline di conteggio di Cell Ranger per eseguire l'allineamento, il filtraggio, il conteggio dei codici a barre e il conteggio degli identificatori molecolari univoci (UMI) per generare matrici di codici a barre feature¹³.
7. Esegui la riduzione e la visualizzazione della dimensionalità dei dati con il pacchetto R Seurat¹⁴.
   1. Innanzitutto, la funzione Read10X() di Seurat legge l'output della pipeline Cell Ranger e quindi utilizza la matrice di conteggio per creare un oggetto Seurat. Quindi, filtrare le cellule con l'espressione di <200 o >4000 geni o un rapporto genico mitocondriale superiore al 10% dalla funzione subset() di Seurat.
   2. Utilizzare NormalizeData () e FindVariableFeatures() per normalizzare i dati e identificare rispettivamente 2000 feature altamente variabili.
   3. Eseguire l'analisi delle componenti principali (PCA) sui dati scalati e raggruppare le celle con dims = 30 e risoluzione = 0,5. Infine, utilizzare la funzione RunUMAP () per visualizzare i set di dati a cella singola e FindAllMarkers() per trovare ogni biomarcatore del cluster.

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare di arterie carotidi di topo (Figura 1). Questo metodo di digestione cellulare in due fasi combina la collagenasi/DNasi con la tripsina per dissociare efficacemente la parete vascolare carotide del topo per ottenere sospensioni unicellulari di alta qualità per il sequenziamento di singole cellule. Dopo la dissociazione, la concentrazione cellulare e la vitalità cellul...

Discussione

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'arteria carotide di topi wild-type, in cui è stato costruito un metodo di digestione in due fasi che integra il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Dopo il controllo di qualità della sospensione a singola cellula, abbiamo scoperto che soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C