シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製

要約

ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。

要約

頸動脈は、脳に血液と酸素を供給する首の主要な血管ですが、頸動脈がプラークで詰まると頸動脈狭窄症が起こります。頸動脈の細胞組成を単一細胞レベルで明らかにすることは、頸動脈アテローム性動脈硬化症の治療に不可欠です。しかし、頸動脈からの単一細胞懸濁液を調製するためのすぐに使用できるプロトコルはありません。細胞へのダメージを抑えながら、単一細胞レベルで正常な頸動脈を解離させるのに適したプロトコルを得るために、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合することにより、2段階の消化法を設計しました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。単一細胞のデータ処理後、各頸動脈細胞で細胞あたり中央値~2500の転写産物が検出されました。特に、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)など、正常な頸動脈のさまざまな細胞タイプが同時に検出可能でした。このプロトコルは適切な修正の他のティッシュからの血管の単一細胞懸濁液を準備するのに適用されてもよい。

概要

アテローム性動脈硬化症は、高血圧、高脂血症、血行動態などの危険因子に関連する慢性炎症性疾患^です1。頸動脈分岐部は血行動態の変化を起こしやすく、頸動脈プラークの形成につながります。頸動脈アテローム性動脈硬化症の臨床症状は、脳卒中や一過性脳虚血などの急性の場合もあれば、再発性一過性脳虚血や血管性認知症などの慢性の場合もある²。機械的には、頸動脈プラークは、病理学的条件下での異なる血管壁細胞と様々な血液細胞との間の相互作用の結果である。したがって、生理学的および病理学的条件下で頸動脈血管の単一細胞アトラスを明らかにすることは、頸動脈プラークの発生を予防および治療するために特に重要です。

シングルセルRNAシーケンシングは、超高分解能で同じ細胞型の生物由来の細胞の不均一性を検出できるため、生物学研究において最も強力な技術の1つです^3,4。研究者は、心血管疾患^5やがん6など、多くの分野で研究を行うためにシングルセルRNAシーケンシングを使用してきました。しかし、組織を迅速かつ正確に単一細胞に分離することは、依然として主要な課題の1つです。酵素解離は、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、DNase、ヒアルロニダーゼを主に含む一般的に使用される方法です。具体的には、コラゲナーゼは単一細胞消化の主要な酵素種であり、主に結合組織のコラーゲン成分を加水分解します。乳腺⁷、糸球体⁸、虹彩角^膜角9、膝関節10、大動脈^11、肺12など、異なる種類のコラゲナーゼが異なる組織の解離に適用可能である。異なる組織の特異な生理学的特性により、同じ方法で解離すると、細胞生存率の低下、細胞数の減少、細胞破片の多大化など、単一細胞の獲得に多くの問題が発生する可能性があります。したがって、異なる組織に対する消化法の発明は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。

このプロトコルは野生型マウスの頸動脈の単一セル懸濁液を準備するために二段階のセル消化力方法を開発することを向ける。コラゲナーゼは頸動脈組織のコラーゲンを加水分解し、さらにトリプシンで消化して単細胞懸濁液となるため、頸動脈の特性に応じて、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせ、マウス頸動脈の高品質な単細胞懸濁液を得ました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。シングルセルデータ解析の結果、消化後の正常なマウス頸動脈において、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)の4種類の細胞が同定されました。このプロトコルの利点は、1)頸動脈の複数の細胞タイプを識別でき、2)細胞生存率がよく維持され、3)特別な機器なしで簡単に繰り返すことができます。このプロトコルは、マウス頸動脈の単一細胞マルチオミクスの研究に関心のある研究者に適しています。このプロトコルは、適切な修正を施すことで他の血管を解離させることにも役立つ可能性があります。

プロトコル

以下に説明するすべての動物手順は、東呉大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 試薬・材料調製

1. カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSと2.5 U/mLのヘパリンナトリウム塩を利用して、灌流溶液を調製します。4°Cで保存し、使用するときは氷上で予冷してください。
2. 1250 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 3000 U/mL の DNase I を HBSS で希釈することにより、125 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 60 U/mL の DNase I を含む解離試薬 A を調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
3. 1 mLの0.25%EDTAフリートリプシン(フェノールレッドなし)を1 mLの1x PBSに希釈して、最終濃度0.12%トリプシンを含む解離試薬Bを調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
4. 1x PBSで10 mLの1.5% FBSと10 mLの5% FBSを調製します。1.5%FBSを使用して頸動脈をプールし、使用前に氷上に保管してください。5%FBSを使用して消化を中和し、室温(RT)で保存します。
5. 1 mL シリンジ、26 G 針付き 20 mL シリンジ、6 ウェル細胞培養プレート、1.5 mL 遠心チューブ、40 μm 滅菌細胞ストレーナー、氷容器などの実験材料を入手してください。

2. 機器の準備

1. 実体顕微鏡、解剖ハサミ、マイクロ解剖ハサミ、先端細い鉗子など、すべての手術器具を滅菌します。
2. 自動セルカウンターをオンにし、RTに維持します。
3. あらかじめ37°Cまで水浴をONにしてください。
4. 使用前に微量遠心分離機を4°Cに予冷してください。

3. マウス頸動脈の単離

1. 腹腔内注射で1.25%トリブロモエタノール(体重10 gごとに0.24 mL)を使用してマウスを麻酔し、マウスを裏返して3分後に正動反射があるかどうかを確認します。.次に、子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、仰向けに寝かせます。マウスの皮膚に75%アルコールをスプレーします。
2. 滅菌された解剖ハサミを使用して皮膚を開き、胸腔を露出させます。ダイヤフラムを切り開きます。
3. 下顎まで上向きに切断を続け、余分な結合組織と脂肪を慎重に取り除き、頸動脈を露出させます。
4. マウスの下大静脈を切開して、閉じた循環から血流を作ります。
5. 20 mLの予冷灌流溶液をシリンジで左心室にゆっくりと連続的に注入します。
   注:灌流が成功すると、肝臓、脾臓、腎臓などの血液が豊富な臓器が灰白色に変わります。
6. 頸動脈周辺の脂肪組織や結合組織を実体顕微鏡下でマイクロ解剖ハサミで剥がします。
   注意: この手順は、頸動脈の損傷を防ぐために、ゆっくりと慎重に行う必要があります。
7. マウスから頸動脈を単離し、1x PBSで洗浄して血液を再度洗い流し、氷上で1.5%FBSを含む6ウェルプレートに移します。

4. 頸動脈の単一細胞懸濁液への消化

1. マイクロ解剖ハサミを使用して頸動脈を縦方向に解剖し、氷上に1.5%FBS1 mLを含む別の6ウェル細胞培養プレートに平らに置きます。
2. 内膜を1.5%FBSで注意深く洗い流して、残留血液を取り除きます。
   注:フラッシングは、内皮細胞を傷つけないように、穏やかでゆっくりと行う必要があります。
3. 1.5%FBSのマイクロダイセクションハサミを使用して、各頸動脈を約^2mm2 の組織片に切断します。
4. これらの組織片を、1 mLのボアチップが付いた1.5 mLの遠心チューブに移し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、組織を底に沈めます。
5. 上清を廃棄し、組織を500μLの解離試薬Aに再懸濁します。
6. チューブを37°Cのウォーターバスに1時間入れます。10分ごとに1 mLのピペットで静かにピペットします。
7. 500 μL の 5% FBS をチューブに加え、1 mL のピペットでよく混ぜます。
8. 細胞懸濁液を40 μmの滅菌セルストレーナーでろ過し、新しい1.5 mL遠心チューブに入れ、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
9. 上清を慎重に除去し、細胞ペレットを200 μLの解離試薬Bに再懸濁します。
10. 37°Cのウォーターバスに入れ、さらに5分間消化します。消化中は2分ごとに静かにピペットで移し、完全に解離して単一細胞懸濁液にします。
11. 200 μL の 5% FBS を使用して消化反応を終了し、400 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
12. 上清を廃棄し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに氷上に再懸濁します。

5. 細胞懸濁試験とシングルセルRNAシーケンシング

1. 10 μLのシングルセル懸濁液に10 μLのAO/PI溶液を加え、20 μLのピペットで穏やかに混合します。
2. 混合物20μLをチャンバースライドにピペットで移し、1分間待ちます。
3. スライドを自動セルカウンター装置にロードします。
4. AO/PI Viability assay を選択し、品質レポートを待ちます。
5. シングルセル 3 インチ試薬キットを使用して、シングルセルコントローラー上のエマルジョン中にシングルセルゲルビーズを生成し、メーカーのプロトコルに従ってサーマルサイクラーでバーコード化された cDNA を増幅します。
   注:ここでは、Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3を使用しました。
6. ペアエンド 150 bp (PE150) 読み取りストラテジーを使用してシーケンサーでシーケンシングを実行します。ソフトウェアアプリケーション(Cell Ranger)を使用して、 mkfastq パイプラインを使用して生のベースコールファイルをfastqファイルに変換します。次に、Cell Ranger のカウント パイプラインを使用して、アライメント、フィルタリング、バーコード カウント、および一意の分子識別子 (UMI) カウント を実行し、特徴バーコード マトリックスを生成します¹³。
7. R パッケージ Seurat¹⁴ を使用して、データの次元削減と視覚化を実行します。
   1. まず、Seurat の Read10X() 関数が Cell Ranger パイプラインの出力を読み取り、カウント行列を使用して Seurat オブジェクトを作成します。次に、<200または>4000の遺伝子の発現、またはミトコンドリア遺伝子比が10%を超える細胞をSeuratの subset() 関数でフィルタリングします。
   2. NormalizeData() と FindVariableFeatures() を使用してデータを正規化し、それぞれ 2000 個の変動の大きい特徴を識別します。
   3. スケーリングされたデータに対して主成分分析 (PCA) を実行し、dims = 30、resolution = 0.5 でセルをクラスター化します。最後に、 RunUMAP () 関数を使用して単一セルのデータセットを可視化し、 FindAllMarkers() を使用して各クラスター バイオマーカーを見つけます。

結果

このプロトコルはマウス頸動脈(図1)の単一セル懸濁液を準備するための2段階のセル消化力方法を記述する。この2段階の細胞消化法は、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせて、マウス頸動脈血管壁を効果的に解離させ、シングルセルシーケンシング用の高品質のシングルセル懸濁液を取得します。解離後、細胞濃度および細胞生存率を自動セルカウンターで計?...

ディスカッション

ここでは、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための詳細なプロトコルを提供し、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合した2段階の消化法を構築しました。シングルセル懸濁液の品質チェックの結果、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、シングルセルシーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。さらに、頸動脈のVSMC、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C