シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製

要約

ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。

要約

頸動脈は、脳に血液と酸素を供給する首の主要な血管ですが、頸動脈がプラークで詰まると頸動脈狭窄症が起こります。頸動脈の細胞組成を単一細胞レベルで明らかにすることは、頸動脈アテローム性動脈硬化症の治療に不可欠です。しかし、頸動脈からの単一細胞懸濁液を調製するためのすぐに使用できるプロトコルはありません。細胞へのダメージを抑えながら、単一細胞レベルで正常な頸動脈を解離させるのに適したプロトコルを得るために、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合することにより、2段階の消化法を設計しました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。単一細胞のデータ処理後、各頸動脈細胞で細胞あたり中央値~2500の転写産物が検出されました。特に、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)など、正常な頸動脈のさまざまな細胞タイプが同時に検出可能でした。このプロトコルは適切な修正の他のティッシュからの血管の単一細胞懸濁液を準備するのに適用されてもよい。

概要

アテローム性動脈硬化症は、高血圧、高脂血症、血行動態などの危険因子に関連する慢性炎症性疾患^です1。頸動脈分岐部は血行動態の変化を起こしやすく、頸動脈プラークの形成につながります。頸動脈アテローム性動脈硬化症の臨床症状は、脳卒中や一過性脳虚血などの急性の場合もあれば、再発性一過性脳虚血や血管性認知症などの慢性の場合もある²。機械的には、頸動脈プラークは、病理学的条件下での異なる血管壁細胞と様々な血液細胞との間の相互作用の結果である。したがって、生理学的および病理学的条件下で頸動脈血管の単一細胞アトラスを明らかにすることは、頸動脈プラークの発生を予防および治療するために特に重要です。

シングルセルRNAシーケンシングは、超高分解能で同じ細胞型の生物由来の細胞の不均一性を検出できるため、生物学研究において最も強力な技術の1つです^3,4。研究者は、心血管疾患^5やがん6など、多くの分野で研究を行うためにシングルセルRNAシーケンシングを使用してきました。しかし、組織を迅速かつ正確に単一細胞に分離することは、依然として主要な課題の1つです。酵素解離は、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシ....

プロトコル

以下に説明するすべての動物手順は、東呉大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 試薬・材料調製

1. カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSと2.5 U/mLのヘパリンナトリウム塩を利用して、灌流溶液を調製します。4°Cで保存し、使用するときは氷上で予冷してください。
2. 1250 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 3000 U/mL の DNase I を HBSS で希釈することにより、125 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 60 U/mL の DNase I を含む解離試薬 A を調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
3. 1 mLの0.25%EDTAフリートリプシン(フェノールレッドなし)を1 mLの1x PBSに希釈して、最終濃度0.12%トリプシンを含む解離試薬Bを調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
4. 1x PBSで10 mLの1.5% FBSと10 mLの5% FBSを調製します。1.5%FBSを使用して頸動脈をプールし、使用前に氷上に保管してください。5%FBSを使用して消化を中和し、室温(RT)で保存します。
5. 1 mL シリンジ、26 G 針付き 20 mL シリンジ、6 ウェル細胞培養プレート、1.5 mL 遠心チューブ、40 μm 滅菌細胞ストレーナー、氷容器などの実験....

結果

このプロトコルはマウス頸動脈(図1)の単一セル懸濁液を準備するための2段階のセル消化力方法を記述する。この2段階の細胞消化法は、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせて、マウス頸動脈血管壁を効果的に解離させ、シングルセルシーケンシング用の高品質のシングルセル懸濁液を取得します。解離後、細胞濃度および細胞生存率を自動セルカウンターで計?.......

ディスカッション

ここでは、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための詳細なプロトコルを提供し、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合した2段階の消化法を構築しました。シングルセル懸濁液の品質チェックの結果、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、シングルセルシーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。さらに、頸動脈のVSMC、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C