Preparación de una suspensión unicelular de arterias carótidas de ratón para la secuenciación de células individuales

Resumen

Aquí describimos un protocolo de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de las arterias carótidas de ratón.

Resumen

Las arterias carótidas son vasos sanguíneos importantes en el cuello que suministran sangre y oxígeno al cerebro, pero la estenosis carotídea ocurre cuando las arterias carótidas están obstruidas por placa. Revelar la composición celular de la arteria carótida a nivel de una sola célula es esencial para tratar la aterosclerosis carotídea. Sin embargo, no existe un protocolo listo para usar para la preparación de suspensiones unicelulares de las arterias carótidas. Para obtener un protocolo adecuado para la disociación de las arterias carótidas normales a nivel unicelular con menos daño a las células, diseñamos un método de digestión en dos pasos mediante la integración del proceso de digestión de colagenasa/DNasa y tripsina. Se utilizó el recuento de doble fluorescencia de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) para detectar la viabilidad y concentración celular, y se encontró que la suspensión de una sola célula cumplía con los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Después del procesamiento de datos de una sola célula, se detectó una mediana de ~ 2500 transcripciones por célula en cada célula de la arteria carótida. En particular, se detectaron simultáneamente una variedad de tipos de células de la arteria carótida normal, incluidas las células del músculo liso vascular (CMV), los fibroblastos, las células endoteliales (CE) y los macrófagos y las células dendríticas (Mφ/DC). Este protocolo se puede aplicar para preparar una suspensión unicelular de vasos sanguíneos de otros tejidos con las modificaciones adecuadas.

Introducción

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica asociada a factores de riesgo como hipertensión arterial, hiperlipidemia y hemodinámica¹. Las bifurcaciones de las arterias carótidas son propensas a cambios hemodinámicos y conducen a la formación de placa carotídea. La presentación clínica de la aterosclerosis carotídea puede ser aguda, como el accidente cerebrovascular y la isquemia cerebral transitoria, o crónica, como la isquemia cerebral transitoria recurrente y la demencia vascular². Mecánicamente, la placa carotídea es el resultado de la interacción entre diferentes células de la pared de los vasos y varias células sanguíneas en condiciones patológicas. Por lo tanto, revelar el atlas unicelular de los vasos carotídeos en condiciones fisiológicas y patológicas es particularmente importante para prevenir y tratar el desarrollo de la placa carotídea.

La secuenciación de ARN unicelular es una de las tecnologías más potentes de la investigación biológica debido a su ultra alta resolución y a la detección de la heterogeneidad celular del mismo tipo de células de organismos ^3,4. Los investigadores han utilizado la secuenciación de ARN de una sola célula para realizar investigaciones en muchos campos, como las enfermedades cardiovasculares⁵ y el cáncer⁶. Sin embargo, separar los tejidos de forma rápida y precisa en células individuales sigue siendo uno de los principales desafíos. La disociación enzimática es un método de uso común que incluye predominantemente colagenasa, papaína, tripsina, DNasa e hialuronidasa. Específicamente, las colagenasas son las principales especies de enzimas para la digestión unicelular, principalmente hidrolizando los componentes de colágeno en los tejidos conectivos. Diferentes tipos de colagenasa son aplicables para la disociación de diferentes tejidos, como la glándula mamaria⁷, el glomérulo⁸, el ángulo iridocorneal⁹, la articulación de la rodilla¹⁰, la aorta 11 y el pulmón¹². Debido a las propiedades fisiológicas únicas de los diferentes tejidos, la disociación utilizando el mismo método puede causar muchos problemas en la adquisición de células individuales, como baja viabilidad celular, bajo número de células y restos celulares grandes. Por lo tanto, la invención de métodos de digestión para diferentes tejidos es esencial para preparar suspensiones unicelulares de alta calidad.

Este protocolo tiene como objetivo desarrollar un método de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje. De acuerdo con las características de la arteria carótida, combinamos colagenasa/DNasa con tripsina para obtener una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida del ratón, ya que la colagenasa puede hidrolizar el colágeno de los tejidos carotídeos, que luego fue digerido por la tripsina en una suspensión unicelular. Se utilizó el recuento de doble fluorescencia de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) para detectar la viabilidad y concentración celular, y se encontró que la suspensión de una sola célula cumplía con los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Después del procesamiento de datos de una sola célula, se identificaron cuatro tipos de células, incluidas las células del músculo liso vascular (VSMC), los fibroblastos, las células endoteliales (CE) y los macrófagos y las células dendríticas (Mφ/DC), en las arterias carótidas normales del ratón después de la digestión. Las ventajas de este protocolo son que: 1) se pueden identificar múltiples tipos de células en la arteria carótida, 2) la viabilidad celular está bien conservada y 3) se puede repetir fácilmente sin equipo especial. Este protocolo es adecuado para investigadores que estén interesados en estudiar la multiómica unicelular de las arterias carótidas de ratón. Este protocolo también puede ser útil en la disociación de otros vasos sanguíneos con las modificaciones adecuadas.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Soochow.

1. Preparación de reactivos y materiales

1. Utilice 1x PBS sin calcio y magnesio y 2.5 U/mL de sal sódica de heparina para preparar la solución de perfusión. Conservar a 4 °C y preenfriar en hielo cuando se utilice.
2. Prepare el reactivo de disociación A que contenga 125 CDU/mL colagenasa II y 60 U/mL de DNasa I diluyendo 1250 CDU/mL de colagenasa II y 3000 U/mL de DNasa I con HBSS. Conservar a 4 °C hasta su uso.
3. Prepare el reactivo de disociación B que contenga una concentración final de tripsina al 0,12 % diluyendo 1 ml de tripsina libre de EDTA al 0,25 % (sin rojo de fenol) en 1 ml de 1x PBS. Conservar a 4 °C hasta su uso.
4. Prepare 10 mL de FBS al 1,5% y 10 mL de FBS al 5% en 1x PBS. Use FBS al 1.5% para agrupar las arterias carótidas y manténgalas en hielo antes de usar. Use 5% de FBS para neutralizar la digestión y almacene a temperatura ambiente (RT).
5. Obtenga los materiales experimentales, incluidas jeringas de 1 ml, jeringas de 20 ml con agujas de 26 g, placas de cultivo celular de seis pocillos, tubos de centrífuga de 1,5 ml, filtros de células estériles de 40 μm y recipientes de hielo.

2. Preparación del equipo

1. Esterilice todo el equipo quirúrgico, incluido un microscopio estereoscópico, tijeras de disección, tijeras de microdisección y pinzas de punta fina.
2. Encienda el contador de celdas automatizado y manténgalo en RT.
3. Abra el baño de agua a 37 °C con anticipación.
4. Enfríe previamente la microcentrífuga a 4 °C antes de su uso.

3. Aislamiento de la arteria carótida del ratón

1. Anestesiar al ratón con tribromoetanol al 1,25% mediante inyección intraperitoneal (0,24 ml por cada 10 g de peso corporal) y voltear el ratón para comprobar si hay un reflejo de enderezamiento después de 3 min. Luego, sacrifica al ratón por dislocación cervical y acuéstate boca arriba. Rocía la piel del ratón con alcohol al 75%.
2. Use tijeras de disección esterilizadas para abrir la piel y exponer la cavidad torácica. Corta el diafragma.
3. Continúe cortando hacia arriba hasta la mandíbula inferior y retire con cuidado el exceso de tejido conectivo y grasa, exponiendo la arteria carótida.
4. Corta la vena cava inferior del ratón para que la sangre fluya fuera de la circulación cerrada.
5. Inyecte 20 ml de solución de perfusión preenfriada en el ventrículo izquierdo con una jeringa lenta y continuamente.
   NOTA: Si la perfusión es exitosa, los órganos ricos en sangre, como el hígado, el bazo y los riñones, se volverán de color blanco grisáceo.
6. Pele toda la grasa y los tejidos conectivos alrededor de la arteria carótida con unas tijeras de microdisección bajo un microscopio estereoscópico.
   NOTA: Este paso debe realizarse lenta y cuidadosamente para evitar daños en la arteria carótida.
7. Aísle la arteria carótida del ratón, lávela con 1x PBS para enjuagar la sangre nuevamente y transfiérala a placas de seis pocillos que contengan 1.5% de FBS en hielo.

4. Digestión de la arteria carótida en suspensión unicelular

1. Utilice unas tijeras de microdisección para diseccionar la arteria carótida longitudinalmente y colóquela plana en otra placa de cultivo celular de 6 pocillos que contenga 1 ml de FBS al 1,5 % en hielo.
2. Enjuague la íntima cuidadosamente con FBS al 1,5% para eliminar la sangre residual.
   NOTA: El enjuague debe ser suave y lento para evitar dañar las células endoteliales.
3. Cortar cada arteria carótida en trozos de tejido de aproximadamente 2^mm2 utilizando tijeras de microdisección en FBS al 1,5%.
4. Transfiera estas piezas de tejido a un tubo de centrífuga de 1,5 ml con puntas de 1 ml de diámetro ancho, centrifugue a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C para hundir los tejidos hasta el fondo.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender los tejidos en 500 μL de reactivo de disociación A.
6. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 1 h. Pipetear suavemente con una pipeta de 1 ml cada 10 min.
7. Añadir 500 μL de FBS al 5% en el tubo y mezclar bien con una pipeta de 1 mL.
8. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular estéril de 40 μm en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en 200 μL de reactivo de disociación B.
10. Colocar al baño maría a 37 °C y digerir durante otros 5 min. Pipetear suavemente cada 2 minutos durante la digestión para disociar completamente en una suspensión unicelular.
11. Utilice 200 μL de FBS al 5% para finalizar la reacción de digestión y centrifugue a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 100 μL de 1x PBS en hielo.

5. Examen de suspensión celular y secuenciación de ARN de una sola célula

1. Añadir 10 μL de solución AO/PI en 10 μL de suspensión unicelular y mezclar suavemente con una pipeta de 20 μL.
2. Pipetear 20 μL de la mezcla en la cámara deslizar y esperar 1 min.
3. Cargue la corredera en el instrumento de contador de celdas automatizado.
4. Seleccione el ensayo de viabilidad AO/PI y, a continuación, espere el informe de calidad.
5. Utilice un kit de reactivos de 3 ° de una sola celda para generar perlas de gel de una sola celda en la emulsión en un controlador de una sola celda y amplifique el ADNc con código de barras en un termociclador siguiendo el protocolo del fabricante.
   NOTA: En este caso, se utilizó Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3.
6. Realice la secuenciación en un secuenciador con una estrategia de lectura de 150 pb (PE150) de extremo emparejado. Utilice una aplicación de software (Cell Ranger) para convertir archivos de llamadas base sin procesar en archivos fastq mediante la canalización mkfastq . A continuación, utilice la canalización de recuento de Cell Ranger para realizar la alineación, el filtrado, el recuento de códigos de barras y el recuento de identificadores moleculares únicos (UMI) para generar matrices de códigos de barras de características¹³.
7. Realice la reducción y visualización de la dimensionalidad de los datos con el paquete R Seurat¹⁴.
   1. En primer lugar, la función Read10X() de Seurat lee la salida de la canalización de Cell Ranger y, a continuación, utiliza la matriz count para crear un objeto Seurat. A continuación, filtre las células con expresión de <200 o >4000 genes o una proporción de genes mitocondriales que fuera superior al 10% por la función subset() de Seurat.
   2. Utilice NormalizeData () y FindVariableFeatures() para normalizar los datos e identificar 2000 entidades muy variables, respectivamente.
   3. Realice un análisis de componentes principales (PCA) en los datos escalados y agrupe las celdas con dims = 30 y resolution = 0,5. Por último, utilice la función RunUMAP () para visualizar los conjuntos de datos de una sola celda y FindAllMarkers() para encontrar cada biomarcador de clúster.

Resultados

Este protocolo describe un método de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de las arterias carótidas de ratón (Figura 1). Este método de digestión celular de dos pasos combina colagenasa/DNasa con tripsina para disociar eficazmente la pared vascular carotídea del ratón y obtener suspensiones unicelulares de alta calidad para la secuenciación de células individuales. Después de la disociación, la concentración celular y la viabilidad celular se c...

Discusión

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje, en el que se construyó un método de digestión de dos pasos que integra el proceso de digestión de colagenasa/DNasa y tripsina. Tras el control de calidad de la suspensión unicelular, comprobamos que cumplía los requisitos para la secuenciación unicelular, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Además, una varie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C