Приготовление одноклеточной суспензии из сонных артерий мыши для секвенирования одноклеточных клеток

Резюме

Здесь мы опишем двухэтапный протокол клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши.

Аннотация

Сонные артерии являются основными кровеносными сосудами в шее, которые снабжают кровью и кислородом мозг, но стеноз сонной артерии возникает, когда сонные артерии закупориваются бляшками. Выявление клеточного состава сонной артерии на одноклеточном уровне имеет важное значение для лечения атеросклероза сонной артерии. Однако готового к применению протокола приготовления одноклеточных суспензий из сонных артерий не существует. Чтобы получить подходящий протокол диссоциации нормальных сонных артерий на уровне одной клетки с меньшим повреждением клеток, мы разработали двухступенчатый метод расщепления путем интеграции процесса расщепления коллагеназы/ДНКазы и трипсина. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных одной клетки в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. Примечательно, что различные типы клеток нормальной сонной артерии, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs), были обнаружены одновременно. Этот протокол может быть применен для приготовления одноклеточной суспензии кровеносных сосудов из других тканей с соответствующими модификациями.

Введение

Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, связанное с такими факторами риска, как высокое кровяное давление, гиперлипидемия и гемодинамика¹. Бифуркации сонных артерий склонны к гемодинамическим изменениям и приводят к образованию сонных бляшек. Клиническая картина атеросклероза сонных артерий может быть острой, такой как инсульт и транзиторная ишемия головного мозга, или хронической, такой как рецидивирующая транзиторная ишемия головного мозга и сосудистая деменция². Механически бляшка на сонной артерии является результатом взаимодействия между клетками стенки различных сосудов и различными клетками кров....

протокол

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Сучжоу.

1. Подготовка реагентов и материалов

1. Для приготовления перфузионного раствора используют 1x PBS без кальция и магния и 2,5 ед/мл гепариновой натриевой соли. Хранить при температуре 4 °C, а при использовании охладить на льду.
2. Приготовьте диссоциационный реагент А, содержащий 125 КД/мл коллагеназы II и 60 ЕД/мл ДНКазы I, разбавляя 1250 ЕД/мл коллагеназы II и 3000 ЕД/мл ДНКазы I с HBSS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
3. Приготовьте диссоциационный реагент B, содержащий ....

Результаты

Этот протокол описывает двухэтапный метод клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши (рис. 1). Этот двухэтапный метод клеточного пищеварения сочетает коллагеназу/ДНКазу с трипсином для эффективной диссоциации сосудистой сте?.......

Обсуждение

Здесь мы приводим подробный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа, в котором был сконструирован двухстадийный метод пищеварения, интегрирующий процесс пищеварения коллагеназы/ДНКазы и трипсина. После проверки качеств.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C