Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем двухэтапный протокол клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши.

Аннотация

Сонные артерии являются основными кровеносными сосудами в шее, которые снабжают кровью и кислородом мозг, но стеноз сонной артерии возникает, когда сонные артерии закупориваются бляшками. Выявление клеточного состава сонной артерии на одноклеточном уровне имеет важное значение для лечения атеросклероза сонной артерии. Однако готового к применению протокола приготовления одноклеточных суспензий из сонных артерий не существует. Чтобы получить подходящий протокол диссоциации нормальных сонных артерий на уровне одной клетки с меньшим повреждением клеток, мы разработали двухступенчатый метод расщепления путем интеграции процесса расщепления коллагеназы/ДНКазы и трипсина. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных одной клетки в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. Примечательно, что различные типы клеток нормальной сонной артерии, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs), были обнаружены одновременно. Этот протокол может быть применен для приготовления одноклеточной суспензии кровеносных сосудов из других тканей с соответствующими модификациями.

Введение

Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, связанное с такими факторами риска, как высокое кровяное давление, гиперлипидемия и гемодинамика1. Бифуркации сонных артерий склонны к гемодинамическим изменениям и приводят к образованию сонных бляшек. Клиническая картина атеросклероза сонных артерий может быть острой, такой как инсульт и транзиторная ишемия головного мозга, или хронической, такой как рецидивирующая транзиторная ишемия головного мозга и сосудистая деменция2. Механически бляшка на сонной артерии является результатом взаимодействия между клетками стенки различных сосудов и различными клетками кров....

протокол

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Сучжоу.

1. Подготовка реагентов и материалов

  1. Для приготовления перфузионного раствора используют 1x PBS без кальция и магния и 2,5 ед/мл гепариновой натриевой соли. Хранить при температуре 4 °C, а при использовании охладить на льду.
  2. Приготовьте диссоциационный реагент А, содержащий 125 КД/мл коллагеназы II и 60 ЕД/мл ДНКазы I, разбавляя 1250 ЕД/мл коллагеназы II и 3000 ЕД/мл ДНКазы I с HBSS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  3. Приготовьте диссоциационный реагент B, содержащий ....

Результаты

Этот протокол описывает двухэтапный метод клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши (рис. 1). Этот двухэтапный метод клеточного пищеварения сочетает коллагеназу/ДНКазу с трипсином для эффективной диссоциации сосудистой сте?.......

Обсуждение

Здесь мы приводим подробный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа, в котором был сконструирован двухстадийный метод пищеварения, интегрирующий процесс пищеварения коллагеназы/ДНКазы и трипсина. После проверки качеств.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук Китая (82070450 для К.Т. и 82170466 для Л.З.) и стипендией Китайского фонда постдокторантуры (7121102223 для Ф.Л.).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% EDTA-free trypsinBeyotimeC0205Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solutionBeyotimeST341Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes SKJYLEANsk-r009To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubesKIRGENKG2211WTo centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringesSKJYLEANsk-r013To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainerJETBIOFILcss010040To filter undigested tissue fragments
AO/PI kitHengrui BiologicalRE010212To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counterCountstarMira FLTo analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software10× Genomics3.0.2To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v310× Genomics1000075To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase IISigma-AldrichC6885Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease IWorthingtonLS002140Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum HyCloneSH30088.03Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution Gibco14175095Store at the room temperture
Heparin sodium saltSolarbio Life ScienceH8060Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002560Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000 IlluminaN/ASequencer
Phosphate-buffered salineSolarbio Life ScienceP1000Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- RSatija Lab3.1.2To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture platesNEST703002Place the vascular tissue
Water bathJinghongDK-S22Keep the digestion temperature at 37 °C

Ссылки

  1. Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
  2. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease P....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены