Приготовление одноклеточной суспензии из сонных артерий мыши для секвенирования одноклеточных клеток

Резюме

Здесь мы опишем двухэтапный протокол клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши.

Аннотация

Сонные артерии являются основными кровеносными сосудами в шее, которые снабжают кровью и кислородом мозг, но стеноз сонной артерии возникает, когда сонные артерии закупориваются бляшками. Выявление клеточного состава сонной артерии на одноклеточном уровне имеет важное значение для лечения атеросклероза сонной артерии. Однако готового к применению протокола приготовления одноклеточных суспензий из сонных артерий не существует. Чтобы получить подходящий протокол диссоциации нормальных сонных артерий на уровне одной клетки с меньшим повреждением клеток, мы разработали двухступенчатый метод расщепления путем интеграции процесса расщепления коллагеназы/ДНКазы и трипсина. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных одной клетки в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. Примечательно, что различные типы клеток нормальной сонной артерии, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs), были обнаружены одновременно. Этот протокол может быть применен для приготовления одноклеточной суспензии кровеносных сосудов из других тканей с соответствующими модификациями.

Введение

Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, связанное с такими факторами риска, как высокое кровяное давление, гиперлипидемия и гемодинамика¹. Бифуркации сонных артерий склонны к гемодинамическим изменениям и приводят к образованию сонных бляшек. Клиническая картина атеросклероза сонных артерий может быть острой, такой как инсульт и транзиторная ишемия головного мозга, или хронической, такой как рецидивирующая транзиторная ишемия головного мозга и сосудистая деменция². Механически бляшка на сонной артерии является результатом взаимодействия между клетками стенки различных сосудов и различными клетками крови при патологических состояниях. Поэтому выявление одноклеточного атласа сонных сосудов в физиологических и патологических условиях особенно важно для профилактики и лечения развития каротидных бляшек.

Секвенирование одноклеточной РНК является одной из самых мощных технологий биологических исследований из-за ее сверхвысокого разрешения и обнаружения клеточной гетерогенности от одного и того же типа клеток организмов ^3,4. Исследователи использовали секвенирование одноклеточной РНК для проведения исследований во многих областях, таких как сердечно-сосудистые заболевания⁵ и рак⁶. Тем не менее, быстрое и точное разделение тканей на отдельные клетки по-прежнему остается одной из основных задач. Ферментативная диссоциация является широко используемым методом, который преимущественно включает коллагеназу, папаин, трипсин, ДНКазу и гиалуронидазу. В частности, коллагеназы являются основными видами ферментов для пищеварения отдельных клеток, в основном гидролизующих компоненты коллагена в соединительных тканях. Различные типы коллагеназ применимы для диссоциации различных тканей, таких как молочная железа⁷, клубочек⁸, иридокорнеальный угол⁹, коленный сустав¹⁰, аорта¹¹ и^{легкое 12}. Из-за уникальных физиологических свойств различных тканей диссоциация с использованием одного и того же метода может вызвать множество проблем при получении одиночных клеток, таких как низкая жизнеспособность клеток, низкое количество клеток и крупный клеточный мусор. Поэтому изобретение методов пищеварения для различных тканей имеет важное значение для получения высококачественных одноклеточных суспензий.

Этот протокол направлен на разработку двухэтапного метода клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонной артерии мышей дикого типа. В соответствии с особенностями сонной артерии мы объединили коллагеназу/ДНКазу с трипсином для получения высококачественной одноклеточной суспензии сонной артерии мыши, поскольку коллагеназа может гидролизовать коллаген сонных тканей, который в дальнейшем переваривался трипсином в одноклеточную суспензию. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных отдельных клеток в нормальных сонных артериях мышей после пищеварения были идентифицированы четыре типа клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), а также макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs). Преимущества данного протокола заключаются в том, что: 1) можно идентифицировать несколько типов клеток в сонной артерии, 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется, и 3) его можно легко повторить без специального оборудования. Этот протокол подходит для исследователей, которые заинтересованы в изучении одноклеточной мультиомики сонных артерий мышей. Этот протокол также может быть полезен при диссоциации других кровеносных сосудов с соответствующими модификациями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Сучжоу.

1. Подготовка реагентов и материалов

1. Для приготовления перфузионного раствора используют 1x PBS без кальция и магния и 2,5 ед/мл гепариновой натриевой соли. Хранить при температуре 4 °C, а при использовании охладить на льду.
2. Приготовьте диссоциационный реагент А, содержащий 125 КД/мл коллагеназы II и 60 ЕД/мл ДНКазы I, разбавляя 1250 ЕД/мл коллагеназы II и 3000 ЕД/мл ДНКазы I с HBSS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
3. Приготовьте диссоциационный реагент B, содержащий конечную концентрацию 0,12% трипсина, разбавив 1 мл 0,25% трипсина, не содержащего ЭДТА (без фенолового красного), в 1 мл 1x PBS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
4. Приготовьте 10 мл 1,5% FBS и 10 мл 5% FBS в 1x PBS. Используйте 1,5% FBS для бассейна сонных артерий и держите на льду перед использованием. Используйте 5% FBS для нейтрализации пищеварения и храните при комнатной температуре (RT).
5. Получите экспериментальные материалы, в том числе шприцы объемом 1 мл, шприцы по 20 мл с иглами 26 г, шестилуночные планшеты для клеточных культур, центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, стерильные клеточные фильтры объемом 40 мкм и контейнеры для льда.

2. Подготовка оборудования

1. Стерилизуйте все хирургическое оборудование, включая стереоскопический микроскоп, ножницы для препарирования, ножницы для микропрепарирования и щипцы с тонким наконечником.
2. Включите автоматический счетчик ячеек и поддерживайте его на RT.
3. Заранее включите водяную баню до 37 °C.
4. Перед использованием охладите микроцентрифугу до 4 °C.

3. Изоляция сонной артерии мыши

1. Обезболить мышь 1,25% трибромэтанолом путем внутрибрюшинной инъекции (0,24 мл на каждые 10 г массы тела) и через 3 мин перевернуть мышь, чтобы проверить, есть ли рефлекс выпрямления. Затем усыпьте мышь при вывихе шейки матки и положите ее на спину. Опрыскайте кожу мыши 75% спиртом.
2. Используйте стерилизованные ножницы для препарирования, чтобы вскрыть кожу и обнажить грудную полость. Разрежьте диафрагму.
3. Продолжайте разрез вверх до нижней челюсти и осторожно удаляйте излишки соединительной ткани и жира, обнажая сонную артерию.
4. Перережьте нижнюю полую вену мыши, чтобы кровь вытекла из замкнутого кровообращения.
5. Медленно и непрерывно ввести 20 мл предварительно охлажденного раствора перфузии в левый желудочек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если перфузия проходит успешно, богатые кровью органы, такие как печень, селезенка и почки, становятся серо-белыми.
6. Снимите весь жир и соединительные ткани вокруг сонной артерии микропрепарирующими ножницами под стереоскопическим микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять медленно и осторожно, чтобы предотвратить повреждение сонной артерии.
7. Изолируйте сонную артерию от мыши, промойте 1x PBS, чтобы снова промыть кровь, и переложите на шестилуночные планшеты, содержащие 1,5% FBS на льду.

4. Переваривание сонной артерии в одноклеточную суспензию

1. Используйте ножницы для микропрепарирования, чтобы рассечь сонную артерию в продольном направлении и положить на другую 6-луночную планшет для культивирования клеток, содержащую 1 мл 1,5% FBS на льду.
2. Тщательно промойте интим 1,5% FBS, чтобы удалить остатки крови.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание должно быть мягким и медленным, чтобы не повредить эндотелиальные клетки.
3. Разрежьте каждую сонную артерию примерно на 2^мм2 кусочка ткани с помощью микропрепарирующих ножниц в 1,5% FBS.
4. Переложите эти кусочки ткани в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл с широкими наконечниками диаметром 1 мл, центрифугу при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы ткани опустились на дно.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ткани в 500 мкл диссоциационного реагента А.
6. Поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 °C на 1 час. Осторожно пипетку 1 мл каждые 10 минут.
7. Добавьте в пробирку 500 мкл 5% FBS и хорошо перемешайте пипеткой объемом 1 мл.
8. Отфильтруйте клеточную суспензию через стерильный клеточный фильтр 40 мкм в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
9. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл диссоциационного реагента B.
10. Поставьте на водяную баню с температурой 37 °C и варите еще 5 минут. Осторожно пипетка каждые 2 минуты во время пищеварения полностью диссоциирует в одноклеточную суспензию.
11. Используйте 200 мкл 5% FBS для прекращения реакции разложения и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
12. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1x PBS на льду.

5. Исследование клеточной суспензии и секвенирование одноклеточной РНК

1. Добавьте 10 мкл раствора АО/ПИ в 10 мкл одноклеточной суспензии и аккуратно перемешайте пипеткой объемом 20 мкл.
2. Пипеткой 20 мкл смеси в камеру слайда и подождите 1 мин.
3. Загрузите ползунок в автоматический прибор счетчика клеток.
4. Выберите анализ жизнеспособности AO/PI и дождитесь отчета о качестве.
5. Используйте набор одноклеточных 3ʹ-реагентов для генерации одноклеточных гелевых шариков в эмульсии на одноклеточном контроллере и амплифицируйте кДНК со штрих-кодом в термоамплификаторе в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались наборы реагентов Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3.
6. Выполняйте секвенирование на секвенсоре со стратегией считывания парных 150.н. (PE150). Используйте программное приложение (Cell Ranger) для преобразования необработанных файлов базовых вызовов в файлы fastq с помощью конвейера mkfastq . Затем используйте конвейер Count Pipeline в Cell Ranger для выполнения выравнивания, фильтрации, подсчета штрихкодов и подсчета уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) для создания матриц штрихкодов¹³.
7. Уменьшение размерности данных и визуализация с помощью пакета R Seurat¹⁴.
   1. Во-первых, функция Read10X() Seurat считывает выходные данные конвейера Cell Ranger, а затем использует матрицу счетчика для создания объекта Seurat. Затем отфильтруйте клетки с экспрессией генов <200 или >4000 или соотношением митохондриальных генов, которое составляло более 10% по функции подмножества() Сёра.
   2. Используйте NormalizeData() и FindVariableFeatures() для нормализации данных и определения 2000 сильно изменчивых признаков соответственно.
   3. Выполните анализ главных компонент (PCA) для масштабированных данных и кластеризуйте ячейки с dims = 30 и разрешением = 0,5. Наконец, используйте функцию RunUMAP () для визуализации наборов данных с одной ячейкой и функцию FindAllMarkers() для поиска каждого биомаркера кластера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол описывает двухэтапный метод клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши (рис. 1). Этот двухэтапный метод клеточного пищеварения сочетает коллагеназу/ДНКазу с трипсином для эффективной диссоциации сосудистой сте?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы приводим подробный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа, в котором был сконструирован двухстадийный метод пищеварения, интегрирующий процесс пищеварения коллагеназы/ДНКазы и трипсина. После проверки качеств...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C