JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف البروتوكولات الحالية تصويرا جديدا كاملا لتصور الهياكل المحيطية في عدسة العين مع طرق لتحديد كمية الصورة. يمكن استخدام هذه البروتوكولات في الدراسات لفهم العلاقة بين الهياكل المجهرية للعدسة بشكل أفضل وتطوير / وظيفة العدسة.

Abstract

عدسة العين عبارة عن نسيج مرن شفاف يغير شكله لتركيز الضوء من مسافات مختلفة على شبكية العين. بصرف النظر عن الغشاء القاعدي المحيط بالعضو، والذي يسمى الكبسولة، فإن العدسة خلوية بالكامل وتتكون من طبقة أحادية من الخلايا الطلائية في نصف الكرة الأمامي وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الطلائية في المنطقة الإنباتية عند خط استواء العدسة ، وتهاجر الخلايا الطلائية الاستوائية وتستطيل وتتمايز إلى خلايا ليفية مكونة حديثا. تغير الخلايا الظهارية الاستوائية بشكل كبير التشكل من خلايا معبأة عشوائيا على شكل حجر مرصوف بالحصى إلى خلايا سداسية الشكل تشكل صفوفا زوالية. تحتفظ خلايا ألياف العدسة المشكلة حديثا بشكل الخلية السداسية وتستطيل نحو القطبين الأمامي والخلفي ، وتشكل غلافا جديدا من الخلايا المتراكبة على الأجيال السابقة من الألياف. لا يعرف سوى القليل عن الآليات التي تدفع التشكل الملحوظ للخلايا الظهارية للعدسة إلى خلايا الألياف. لفهم بنية العدسة وتطورها ووظيفتها بشكل أفضل ، تم تطوير بروتوكولات تصوير جديدة لتصوير الهياكل الطرفية باستخدام حوامل كاملة من عدسات العين. هنا ، يتم عرض طرق تحديد سمك الكبسولة ، ومنطقة الخلية الظهارية ، والمنطقة النووية للخلية وشكلها ، وترتيب خلية الصف الزوالي والتعبئة ، وعرض الخلايا الليفية. هذه القياسات ضرورية لتوضيح التغيرات الخلوية التي تحدث أثناء نمو العدسة مدى الحياة وفهم التغييرات التي تحدث مع تقدم العمر أو علم الأمراض.

Introduction

عدسة العين هي نسيج مرن وشفاف يقع في المنطقة الأمامية من العين يعمل على تركيز الضوء بدقة على شبكية العين. يمكن أن تعزى قدرة العدسة على العمل ، جزئيا ، إلى بنيتها المعقدة وتنظيمها1،2،3،4،5،6. تحيط بالكبسولة أنسجة العدسة ، وهي غشاء قاعدي ضروري للحفاظ على بنية العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية7،8،9. العدسة نفسها خلوية بالكامل ، وتتكون من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية والليفية. تتكون الطبقة الظهارية من طبقة أحادية من الخلايا المكعبة التي تغطي نصف الكرة الأمامي للعدسة10. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الظهارية وتهاجر على طول كبسولة العدسة نحو خط استواء العدسة. الخلايا الظهارية الأمامية هادئة وحجرية مرصوفة بالحصى في المقطع العرضي ، وبالقرب من خط الاستواء للعدسة ، تتكاثر الخلايا الظهارية وتبدأ في الخضوع لعملية التمايز إلى خلايا ليفية جديدة11,12. تتحول الخلايا الطلائية الاستوائية من خلايا معبأة عشوائيا إلى صفوف خط الطول المنظمة مع خلايا سداسية الشكل. يتم الحفاظ على شكل الخلية السداسية على الجانب القاعدي من هذه الخلايا المتمايزة بينما ينقبض الجانب القمي ويثبت عند نقطة ارتكاز العدسة أو modiolus4،13،14،15. عندما تبدأ الخلايا الطلائية الاستوائية في الاستطالة إلى خلايا ليفية مكونة حديثا، تهاجر الأطراف القمية للخلايا على طول السطح القمي للخلايا الطلائية الأمامية باتجاه القطب الأمامي، بينما تتحرك الأطراف القاعدية على طول كبسولة العدسة في اتجاه القطب الخلفي. تتراكب الأجيال الجديدة من الخلايا الليفية مع الأجيال السابقة من الخلايا ، مما يخلق قذائف كروية من الألياف. أثناء عملية استطالة الخلايا ونضجها ، تغير الخلايا الليفية بشكل كبير مورفولوجيتها11،12،16. تشكل هذه الخلايا الليفية الجزء الأكبر من كتلة العدسة11،12،16،17،18.

الآليات الجزيئية التي تساهم في إنشاء الهياكل المجهرية المعقدة للعدسة ، ومورفولوجيا الخلية ، والتنظيم الخلوي الفريد ليست معروفة تماما. علاوة على ذلك ، فإن مساهمة كبسولة العدسة وبنية الخلية في وظيفة العدسة الكلية (الشفافية ، تغيير شكل العدسة) غير واضحة. ومع ذلك ، يتم توضيح هذه العلاقات باستخدام منهجية تصوير جديدة وتقييمات كمية للخصائص الهيكلية والخلويةللعدسة 2،4،19،20،21،22. تم تطوير بروتوكولات جديدة لتصوير العدسات الكاملة التي تسمح بتصور عالي الدقة المكانية لكبسولة العدسة والخلايا الظهارية وخلايا الألياف المحيطية. يتضمن ذلك منهجية لتحديد سمك الكبسولة ، وحجم الخلية ، وحجم نواة الخلية ودائريتها ، وترتيب صف الزوال ، وتعبئة الخلايا الليفية ، وعرض خلايا الألياف. تسمح طرق التصور والقياس الكمي للصور هذه بالفحص المورفومتري المتعمق ولها مزايا على طرق التصور الأخرى (تصوير الحوامل المسطحة أو أقسام الأنسجة) من خلال الحفاظ على بنية الأنسجة 3D الشاملة. وقد سمحت هذه الأساليب باختبار فرضيات جديدة وستمكن من التقدم المستمر في فهم تطور نمط خلية العدسة ووظيفتها.

بالنسبة للتجارب التالية ، نستخدم فئران من النوع البري و Rosa26-tdTomato جنبا إلى جنب dimer-Tomato (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) (tdTomato) 23 (مختبرات جاكسون) في خلفية C57BL / 6J بين سن 6 و 10 أسابيع ، من كلا الجنسين. تسمح فئران tdTomato بتصور أغشية البلازما الخلوية في العدسات الحية عن طريق التعبير عن بروتين tdTomato المنصهر في الأحماض الأمينية N-terminal 8 لبروتين MARCKS المتحور الذي يستهدف غشاء البلازما عبر myristylation N-terminal ومواقع السيستين بالميتويل الداخلية23. نستخدم أيضا الفئران NMIIAE1841K / E1841K 24 التي تم الحصول عليها في الأصل من الدكتور روبرت أدلشتاين (المعهد الوطني للقلب والرئة والدم ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب). كما هو موضح سابقا20 ، الفئران NMIIAE1841K / E1841K في خلفية FvBN / 129SvEv / C57Bl6 التي فقدت بروتين خيوط وسيطة من الخرز CP49 (يحافظ على مورفولوجيا خلايا الألياف الناضجة والميكانيكا الحيوية للعدسة الكاملة) ، يتم تهجينها مع الفئران من النوع البري C57BL6 / J. فحصنا النسل بحثا عن وجود أليل CP49 من النوع البري.

تم إجراء التصوير البؤري على مجهر مضان متحد البؤر للمسح بالليزر مع تكبير 20x (NA = 0.8 ، مسافة العمل = 0.55 مم ، تكبير 1x) ، 40x (NA = 1.3 هدف زيت ، مسافة العمل = 0.2 مم ، تكبير 1x) ، أو تكبير 63x (NA = 1.4 هدف زيت ، مسافة العمل = 0.19 مم ، تكبير 1x). تم الحصول على جميع الصور باستخدام حجم الثقب ، وهو محدد لسمك المقطع البصري ، إلى 1 وحدة Airy (يتم ذكر السماكات البصرية الناتجة في وسائل إيضاح الشكل). تمت معالجة الصور على برنامج Zen. تم تصدير الصور إلى تنسيق .tif ثم تم استيرادها إلى برنامج FIJI ImageJ (imageJ.net).

Protocol

يتم إيواء الفئران في منشأة بجامعة ديلاوير ، ويتم الاحتفاظ بها في بيئة خالية من مسببات الأمراض. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك القتل الرحيم عن طريق استنشاق CO2 ، وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ديلاوير (IACUC).

1. إعداد عدسة كاملة جبل والتصوير

  1. تثبيت العدسات للتصوير الكامل
    1. بعد القتل الرحيم ، قم باستئصال العينين وتشريح العدسات كما هو موضح سابقا25. بعد التشريح، انقل العدسات على الفور إلى محلول ملحي جديد 1x فوسفات مخزن (PBS؛ 1.1 mM KH2PO4، 155 mM، NaCl، 3.0 mMNa 2HPO 4-7H2O؛ pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قد يتم تغيير التشكل الخلوي إذا تم تخزين العدسات في برنامج تلفزيوني لفترة طويلة من الزمن، لذلك، فمن المستحسن لإصلاح على الفور في غضون ~ 10 دقيقة من تشريح.
    2. للتصوير الكامل للمنطقة الأمامية للعدسة ، قم بتثبيت العدسات بالكامل عن طريق غمر 0.5 مل من بارافورمالدهايد (PFA) المصنوع حديثا بنسبة 4٪ في 1x PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، اغسل العدسات 3x (5 دقائق لكل غسلة) باستخدام 1x PBS. انتقل إلى الخطوة 1.2 أو خزن في 1x PBS عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العدسات الثابتة لمدة تصل إلى 5 أيام.
    3. للتصوير الكامل للمنطقة الاستوائية للعدسة ، قم بإصلاح العدسات بأكملها عن طريق غمر 0.5 مل من 4٪ PFA المصنوع حديثا في 1x PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة. بعد 1 ساعة ، اغسل العدسات 3x (5 دقائق لكل غسلة) مع 1x PBS. انتقل إلى الخطوة 1.3 أو خزن في 1x PBS عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العدسات الثابتة لمدة تصل إلى 5 أيام.
  2. حامل كامل لمنطقة العدسة الأمامية (ثابت أو حي)
    1. للتصوير الكامل للعدسات الثابتة، انتقل إلى الخطوة 1.2.3.
    2. للتصوير الكامل للعدسات الحية ، انقل العدسات إلى بئر من لوحة 48 بئرا تحتوي على 1 مل من Medium 199 (خال من الفينول الأحمر) يحتوي على 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات. احتضان العدسات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى التصوير. قبل التصوير ، احتضن العدسات في محلول يحتوي على Wheat Germ Agglutinin المسمى بالفلورسنت (WGA-640 ، 1: 500) و Hoechst 33342 (1: 500) في Medium 199 لمدة 10 دقائق على الأقل. انتقل إلى الخطوة 1.5.
    3. لتلطيخ كبسولة العدسة ، F-actin ، ونوى العدسات الثابتة ، ضع العدسات في محلول 500 ميكرولتر يحتوي على WGA-640 (1: 500) ، رودامين فالويدين (1:50) ، و Hoechst 33342 (1: 500) في المخزن المؤقت للنفاذية / الحجب (1x PBS يحتوي على 0.3٪ Triton و 0.3٪ ألبومين مصل بقري (Fraction V) و 3٪ مصل الماعز) في أنبوب طرد مركزي دقيق. تلطخ العدسات عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    4. بعد الحضانة طوال الليل ، اغسل العدسات 3x (5 دقائق لكل غسلة) مع 1 مل من 1x PBS. انتقل إلى عدسات التصوير.
    5. لتثبيت العدسة الثابتة للتصوير متحد البؤر ، قم بإنشاء divots تثبيت العدسة في الأغاروز على طبق التصوير كما هو موضح سابقا21 (الشكل 1).
      1. سخني واخلطي 2٪ أغاروز برفق في برنامج تلفزيوني باستخدام الميكروويف حتى يتم تسييل المحلول. ماصة 250 ميكرولتر من الأغاروز المسال 2٪ في طبق زجاجي سفلي (الشكل 1 أ) وقم بتسطيح الأغاروز عبر الطبق باستخدام غطاء بلاستيكي مرن (الشكل 1 ب). بمجرد تبريد الأغاروز وتصلبه بالكامل ، قم بإزالة غطاء الغطاء باستخدام ملقط رفيع الطرف (الشكل 1 ج) واستخدم لكمة خزعة 3 مم لإنشاء ثقب في الأغاروز في وسط الطبق (الشكل 1 د).
      2. قم بإزالة الأغاروز الزائد باستخدام مسح المهام الدقيقة (الشكل 1E). حافظ على ترطيب قالب الأغاروز باستخدام 1x PBS واحتفظ به عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تم تخزين قوالب الأغاروز بنجاح لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    6. باستخدام ملقط الجنين ، انقل العدسة الحية أو الثابتة برفق إلى divot في الأغاروز (الشكل 1F) ، الذي يحتوي على ~ 2 مل من 1x PBS (عدسة ثابتة) أو Medium 199 الخالي من الفينول الأحمر (عدسة حية) ، ثم ضع الطبق على مرحلة مجهر مقلوبة. للتأكد من أن العدسة تقع مع المنطقة الأمامية التي تواجه الهدف ، تصور تلطيخ النوى. إذا لم يتم ملاحظة أي نوى ، فقد تواجه المنطقة الخلفية الهدف.
    7. لعكس العدسة ، استخدم ملقط منحني وقم بتدوير العدسة برفق ~ 180 درجة بحيث تواجه المنطقة الأمامية الهدف. الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر.
    8. لتصور كبسولات العدسة ، احصل على صور z-stack باستخدام هدف 40x بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر. احصل على الصورة الأولى قبل سطح كبسولة العدسة (المشار إليها بواسطة تلطيخ WGA) والصورة الأخيرة بعد السطح القمي للخلايا الظهارية. لتصور الخلايا الظهارية ، احصل على صور z-stack باستخدام هدف 63x بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر لتصور الخلايا الظهارية للعدسة.
      ملاحظة: تسمح معلمات المجهر هذه بإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد (3D) وهو أمر ضروري لتحديد كمية الصورة لسمك الكبسولة أو منطقة الخلية الظهارية. من الممكن أيضا تصوير الغرز في عدسات tdTomato ذات العدسة الحية عن طريق التصوير بعد الطبقة الأحادية للخلية الظهارية كما هو موضح سابقا4.
  3. تلطيخ العدسة الاستوائية الظهارية والخلايا الليفية
    1. ضع العدسات الثابتة في محلول 0.5 مل من رودامين فالويدين (1: 300) ، WGA-640 (1: 250) ، و Hoechst 33342 (1: 500) في محلول النفاذية / الحجب (3٪ BSA ، 3٪ مصل الماعز و 0.3٪ Triton) داخل أنبوب طرد مركزي دقيق. يحفظ عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    2. بعد الحضانة طوال الليل ، اغسل العدسات 3 مرات في 1 مل 1x PBS (5 دقائق لكل غسلة).
    3. إنشاء أسافين الأغاروز تجميد العدسة كما هو موضح سابقا 4,10.
      1. باختصار ، قم بإنشاء أسافين الأغاروز في أطباق ذات قاع زجاجي (FD35-100 ، WPI) عن طريق سكب ~ 5-6 مل من الأغاروز المنصهر 2٪ في 1x PBS في الأطباق (الشكل 2 أ). بمجرد أن يصلب الأغاروز (الشكل 2 ب) ، قم بإنشاء ديفوت مثلث بشفرة حادة (الشكل 2 ج). قم بإزالة إسفين الأغاروز وضع 1 مل من 1x PBS في طبق الأغاروز (الشكل 2 د).
      2. نضح أي أغاروز متبقي قد يتبقى من قطع الأغاروز. يمكن إنشاء أسافين متعددة لكل طبق لتناسب أحجام مختلفة متعددة من العدسات (غير معروضة). لتخزين قالب الأغاروز ، ضع 1 مل من 1x PBS على قالب الأغاروز واحفظه عند 4 درجات مئوية. يمكن الاحتفاظ بالأوتاد لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    4. باستخدام ملاقط منحنية ، ضع العدسة داخل إسفين أغاروز يحتوي على 1 مل من 1x PBS واضبطه بحيث تكون المنطقة الاستوائية للعدسة متجهة لأسفل على زجاج المجهر فوق الهدف متحد البؤر (الشكل 2E-F). للتأكد من أن المنطقة الاستوائية في بؤرة التركيز ، تصور النوى وتأكد من محاذاة النوى في صفوف عند خط الاستواء. يمكن أيضا تحديد الخلايا الطلائية الاستوائية لأنها معبأة وتتشكل بشكل غير منتظم. كذلك ، يتم محاذاة خلايا الصف الزوالي بدقة وشكل سداسي ، يشار إليها بتلطيخ F-actin في أغشية الخلايا.
    5. إذا كانت النوى في مجال الرؤية معبأة بشكل عشوائي ، فإن الجانب الأمامي من العدسة يواجه الهدف. إذا تعذر ملاحظة النوى، فمن المرجح أن يكون الجانب الخلفي من العدسة مواجها للهدف. إذا لم تكن العدسة موجودة على خط الاستواء ، فأعد توجيه العدسة ، واستخدم الملقط المنحني لتدوير العدسة حتى يتم ملاحظة النوى المحاذية بدقة عند خط استواء العدسة.
    6. تخيل الخلايا الظهارية والألياف الاستوائية للعدسة باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (هدف 20x ، NA = 0.8 ، حجم الخطوة 0.5 ميكرومتر و / أو هدف زيت 40x ، NA = 1.3 ، حجم الخطوة 0.4 ميكرومتر). قم بتدوير الصور قبل مجموعة z-stack ، حيث توجد الخلايا الظهارية الاستوائية في الأعلى ، متبوعة بصف الزوال وخلايا الألياف أدناه مباشرة.

2. منهجية تحليل الصور

  1. قياس سمك كبسولة العدسة
    1. باستخدام صور z-stack التي تم الحصول عليها بهدف 40x (حجم خطوة 0.3 ميكرومتر) إما من عدسات tdTomato الحية الموسومة ب WGA أو العدسات الثابتة الموسومة ب WGA و rho-phalloidin ، احصل على إسقاط بصري ثنائي الأبعاد في عرض XZ لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد وحفظه بتنسيق .tif. معالجة الصور باستخدام برنامج Zen.
    2. افتح صور شرائح XZ (.tif) في برنامج FIJI ImageJ.
    3. لقياس سمك كبسولة العدسة ، استخدم وظيفة الخط المستقيم (الموضحة في الشكل 3A ، B). اضبط عرض الخط على 50 بكسل عن طريق تحديد تحرير خيارات > > عرض الخط. تم تحديد عرض الخط هذا تجريبيا لتوفير نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية مع إعدادات المجهر. قد يختلف عرض الخط الأمثل في إعدادات المجاهر / المجهر الأخرى أو عند استخدام عدسات من أنواع أخرى. بعد ذلك، ارسم خطا من السطح العلوي للكبسولة إلى أسفل المنطقة القاعدية للخلايا الطلائية.
    4. احفظ السطر كمنطقة اهتمام بالضغط على Ctrl + T.
    5. افصل القنوات إلى علامات تبويب للصور واللون والقنوات المقسمة.
    6. قم بقياس الشدة على طول الخط لقناة الكبسولة بالضغط على Ctrl + K.
    7. في جدول البيانات ، ارسم قيم الشدة كدالة للمسافة وحدد قمم الشدة للكبسولة و F-actin ، والتي تمثل سطح الكبسولة والمنطقة القاعدية للخلايا الظهارية ، على التوالي. على المحور السيني هي مسافة الخط.
    8. بعد ذلك ، احسب سمك الكبسولة عن طريق تحديد المسافة بين قمم شدة الفلورسنت الظهارية والكبسولة (الشكل 3C ، D).
  2. تحليل منطقة الخلية
    1. باستخدام صور z-stack التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة موضوعية 63x (NA = 1.4 ؛ حجم خطوة 0.3 ميكرومتر) على عدسات tdTomato الحية أو العدسات الثابتة الموسومة بالقضيبيدين ، قم بتحليل شريحة عرض XY من صورة متحدة البؤر z-stack المقابلة لمكان تركيز المنطقة الوسطى (الجانبية) للخلايا الظهارية. لاحظ أن الأغشية الجانبية مرئية باستخدام صبغة غشاء tdTomato أو عن طريق تصور phalloidin الموجود في أغشية الخلايا الجانبية.
      ملاحظة: نظرا لانحناء العدسة (كما هو موضح في منظر XZ; الشكل 4A-C) ، لن يتم التركيز على جميع الخلايا الطلائية في الصورة. تتوافق المنطقة الوسطى من الظهارة مع المنطقة التي يتم فيها التركيز على كل من الأغشية الجانبية للخلية (الشكل 4D-E) والنوى (الشكل 4G-I).
    2. تصدير الصورة ك.tif وافتحها في FIJI ImageJ.
    3. لضبط المقياس في FIJI ImageJ للتحليل، استخدم أداة الخط لإنشاء خط بطول شريط مقياس من الصورة متحدة البؤر.
    4. سجل طول البيكسل للخط وطول شريط المقياس. انتقل إلى تحليل في قائمة شريط الأدوات وحدد تعيين المقياس. أدخل عدد وحدات البكسل التي تمثل طول الخط في المسافة بالبكسل وفي أدخل المسافة المعروفة الطول المعروف لشريط المقياس.
    5. باستخدام تلطيخ tdTomato أو rhodamine-phalloidin كمؤشر على حدود الخلايا ، حدد يدويا مجموعة من الخلايا التي يتم التركيز عليها داخل الصورة باستخدام الأداة متعددة الأضلاع. فقط تتبع الخلايا التي تكون فيها الأغشية الجانبية مرئية (الشكل 4E) وتجنب تتبع الخلايا المرئية جزئيا (أي على حافة الصور). احفظ عائد الاستثمار بالضغط على Ctrl+T. انتقل إلى تحرير في قائمة شريط الأدوات وحدد مسح من الخارج. الآن قم بقياس إجمالي مساحة الخلية (ROI) بالضغط على Ctrl + M في FIJI ImageJ.
    6. احسب متوسط مساحة الخلية بقسمة منطقة عائد الاستثمار على إجمالي عدد الخلايا. هناك طريقة بسيطة لتحديد عدد الخلايا وهي حساب عدد النوى. انتقل إلى قناة النوى (الأزرق). في قائمة عائد الاستثمار ، حدد مخطط عائد الاستثمار المحفوظ للخلايا (الشكل 4G). امسح خارج عائد الاستثمار بالانتقال إلى تحرير ثم النقر فوق مسح للخارج (الشكل 4H). باستخدام أداة النقاط المتعددة ، عد النوى بالنقر فوق النوى الفردية.
  3. تحليل المنطقة النووية الخلوية والشكل
    1. لتحليل مساحة النوى والشكل ، قم بتحليل مقطع بصري لعرض المستوى XY من صورة متحدة البؤر z-stack تتوافق مع المكان الذي يتم فيه التركيز على المنطقة الوسطى (الجانبية) من الخلايا الظهارية tdTomato . تحليل شريحة z-stack من صورة متحدة البؤر حيث تكون المنطقة النووية هي الأكبر (الشكل 5A) ؛ وهذا يمثل الجزء الأوسط من النوى.
      ملاحظة: لاحظ أنه نظرا لانحناء العدسة ، لن يتم التركيز على جميع النوى ، كما يمكن رؤيته في عرض XZ (الشكل 4G والشكل 5A).
    2. حدد مجموعة فرعية من النوى قيد التركيز واحفظ عائد الاستثمار.
    3. استخدم وظيفة مسح الخارج . ضمن عائد الاستثمار ، باستخدام أداة التحديد اليدوي (زر القائمة الرابعة من اليسار) ، تتبع بعناية حدود النوى (الشكل 5 ب). احفظ كل تتبع نووي في نافذة عائد الاستثمار بالضغط على Ctrl+T. حدد فقط النوى حيث يمكن رؤية النوى الكاملة ، والنوى لا تلامس بعضها البعض.
    4. بمجرد تحديد جميع النوى ، قم بقياس المنطقة النووية للخلايا الفردية وشكلها (أي دائرية) بالضغط على Ctrl + M.
    5. انسخ البيانات والصقها في جدول بيانات واحسب متوسط المساحة النووية والدائرية (الشكل 5C).
  4. صف الزوال التعبئة الظهارية
    1. لقياس اضطراب صف الزوال ، احصل على صور باستخدام هدف 20x (حجم خطوة 0.5 ميكرومتر).
    2. تحديد نقطة ارتكاز العدسة / modiolus على الصور. نقطة الارتكاز هي المنطقة التي تنقبض فيها الأطراف القمية للخلايا الطلائية المستطيلة لتكوين نقطة ارتكاز أثناء تمايز الخلايا الليفية الأولية واستطالتها عند خط الاستواء. حدد نقطة الارتكاز بناء على شدة F-actin الساطعة (المشار إليها برأس السهم في عرض XZ في الشكل 6A ؛ المشار إليها بخط أحمر متقطع في الشكل 6B) والتغيير في التنظيم الخلوي في قسم بصري واحد عند عرض XY.
      ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، فإن تلطيخ F-actin لكل من المناطق القاعدية والقمية للخلايا الظهارية واضح فوق نقطة الارتكاز ، في حين أن المنطقة القاعدية فقط للخلايا المستطالة تظهر أسفل نقطة الارتكاز (الشكل 6A). الخلايا الظهارية فوق خط الارتكاز معبأة بشكل غير منتظم وتميل إلى تكوين ريدات ، في حين أن الخلايا الليفية الموجودة أسفل نقطة الارتكاز مرتبة في صفوف متوازية ، يشار إليها بتلطيخ F-actin اللامع في الغشاء (الشكل 6B).
    3. بمجرد تحديد نقطة الارتكاز في الفئران البالغة من العمر شهرين ، حدد القسم البصري الفردي ~ 4.5-5 ميكرومتر المحيطي إلى نقطة الارتكاز (باتجاه كبسولة العدسة) في المستوى XY. يتم اختيار هذه المسافة بناء على ملاحظة أن جميع نوى خلايا الصف الزوالي في الفئران البالغة من العمر 2 شهرا تكون في بؤرة التركيز عندما تكون ~ 5 ميكرومتر محيطية إلى نقطة الارتكاز. احفظ القسم البصري الفردي (.tif). افتح الصورة على فيجي.
      ملاحظة: تم إجراء هذا التحليل فقط على الفئران البالغة من العمر 2 شهرا ، وبالتالي ، لا يمكن استنتاج ما إذا كانت هذه المسافة تتغير مع تقدم العمر.
    4. قبل إجراء تحليل الصور، اضبط المقياس على μm في ImageJ باستخدام الخطوة 2.2.2.
    5. حدد يدويا مناطق صف الزوال بأكملها باستخدام أداة الخط الحر (منطقة الاهتمام / عائد الاستثمار) من خلال تحديد المحاذاة النووية ، كما هو موضح في الشكل 7 أ. احفظ عائد الاستثمار بالضغط على Ctrl+T. انتقل إلى تحرير في قائمة شريط الأدوات وحدد مسح من الخارج. قم بقياس إجمالي مساحة الخلية (ROI) بالضغط على Ctrl + M في FIJI ImageJ.
    6. حدد أي مناطق اضطراب يشير إليها تلطيخ F-actin عن طريق تحديد الخطوط باستخدام أداة الخط الحر في FIJI ImageJ. تشمل معايير المناطق المضطربة تفرع الصفوف ، والتعبئة غير المنتظمة ، وعدم محاذاة الصفوف (الشكل 7 ب) ، كما هو موضح سابقا20.
    7. قم بقياس المنطقة المضطربة المحددة / المصححة بالضغط على Ctrl + M في FIJI ImageJ. اجمع إجمالي المساحة المضطربة في جدول بيانات.
    8. اقسم إجمالي المساحة المضطربة على منطقة عائد الاستثمار ، ثم اضرب في 100 لتحصل على نسبة مئوية من المنطقة المضطربة. إذا لم يلاحظ أي اضطراب ، ضع قيمة 0٪ للمنطقة المضطربة.
  5. عدد صفوف الزوال للخلايا المجاورة
    1. لقياس عدد الخلايا المجاورة ، استخدم الصور الملطخة ب F-actin التي تم الحصول عليها بهدف زيت 40x (حجم خطوة 0.4 ميكرومتر).
    2. حدد مقطعا بصريا (مستوى XY) في المنطقة القاعدية لخلايا الصف الزوالي إلى الداخل من كبسولة العدسة حيث يتم إثراء F-actin حول محيط خلايا الصف الزوالي بالكامل ، وجميع خلايا الصف الزوالي في التركيز وهي على نفس المستوى.
    3. احسب عدد الخلايا المجاورة لكل خلية صف زوال (الشكل 8). قياس متوسط النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على ست خلايا متجاورة في جدول بيانات.
      ملاحظة: تحديد عدد الخلايا المتجاورة مع هدف 20x. ومع ذلك ، فمن الأسهل بكثير مراقبة الشكل السداسي بهدف 40x.
  6. تحليل صورة خلايا الألياف الاستوائية
    1. التقط صورا متحدة البؤر z-stack للعدسات الملطخة بالرودامين فالويدين بهدف 20x (حجم خطوة 0.5 ميكرومتر).
    2. حدد نقطة الارتكاز كما هو موضح في الخطوة 2.4.2. بمجرد تحديد نقطة الارتكاز ، حدد قسما بصريا واحدا. لأغراض التوحيد القياسي والمقارنة بين العدسات ، حدد عرض خلايا الألياف ~ 10 ميكرومتر إلى الداخل من نقطة الارتكاز في المستوى XY (الشكل 9A).
    3. تصدير الصور الأولية إلى FIJI ImageJ. في FIJI ImageJ ، ارسم خطا (عادة ~ 300-400 ميكرومتر) عبر العديد من خلايا الألياف المجاورة لقياس المسافة بين القمم الملطخة ب F-actin (تحليل مسح الخط ؛ الشكل 9 أ ؛ الخط الوردي).
    4. احصل على كثافة الفلورسنت على مسافة مسح الخط في فيجي بالضغط على Ctrl+K. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات إلى جدول البيانات لحساب المسافة بين الذروة (المثال الموضح في الشكل 9A-B). هذا يتوافق مع عرض خلايا الألياف.

النتائج

كبسولة العدسة الأمامية ومنطقة الخلايا الظهارية والمنطقة النووية
لتحليل سمك كبسولة العدسة ، قمنا بتلوين كبسولات العدسات ، إما في العدسات الحية أو الثابتة ، باستخدام WGA. حددنا الخلايا الظهارية للعدسة عن طريق تسمية الأغشية باستخدام tdTomato في العدسات الحية (الشكل 2 أ...

Discussion

تتيح البروتوكولات الموصوفة تصورا عالي الدقة المكانية لهياكل وخلايا العدسات المحيطية في المناطق الأمامية والاستوائية للعدسة. في هذه الدراسة ، تم عرض طرق لتصور الهياكل الطرفية للعدسة باستخدام عدسات سليمة (حية أو ثابتة) حيث يتم الحفاظ على بنية عدسة 3D الشاملة. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت طرق بسي...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون R01 EY032056 إلى CC و R01 EY017724 إلى VMF ، وكذلك المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة بموجب المنحة رقم P20GM139760. تم دعم STI من قبل NIH-NIGMS T32-GM133395 كجزء من برنامج تدريب ما قبل الدكتوراه لواجهة الكيمياء والبيولوجيا ، وجائزة جامعة ديلاوير لعلماء الدراسات العليا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mm Biopsy PunchAcuderm IncNC9084780
AgaroseApex BioResearch Products20-102GP
Antimycotic/AntibioticCytivaSV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)Prometheus25-529
Delicate task wipesKimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
Laser scanning confocal Microscope 880Zeiss
MatTek Imaging DishMatTek Life SciencesP35G-1.5-14
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences100503-917
PBSGenClone25-507B
Phenol red-free medium 199Gibco11043023
Rhodamine-PhalloidinThermo Fisher00027
Triton X100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved