تصوير كامل التركيب لتصور وقياس بنية العدسة الطرفية ومورفولوجيا الخلية وتنظيمها

Summary

تصف البروتوكولات الحالية تصويرا جديدا كاملا لتصور الهياكل المحيطية في عدسة العين مع طرق لتحديد كمية الصورة. يمكن استخدام هذه البروتوكولات في الدراسات لفهم العلاقة بين الهياكل المجهرية للعدسة بشكل أفضل وتطوير / وظيفة العدسة.

Abstract

عدسة العين عبارة عن نسيج مرن شفاف يغير شكله لتركيز الضوء من مسافات مختلفة على شبكية العين. بصرف النظر عن الغشاء القاعدي المحيط بالعضو، والذي يسمى الكبسولة، فإن العدسة خلوية بالكامل وتتكون من طبقة أحادية من الخلايا الطلائية في نصف الكرة الأمامي وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الطلائية في المنطقة الإنباتية عند خط استواء العدسة ، وتهاجر الخلايا الطلائية الاستوائية وتستطيل وتتمايز إلى خلايا ليفية مكونة حديثا. تغير الخلايا الظهارية الاستوائية بشكل كبير التشكل من خلايا معبأة عشوائيا على شكل حجر مرصوف بالحصى إلى خلايا سداسية الشكل تشكل صفوفا زوالية. تحتفظ خلايا ألياف العدسة المشكلة حديثا بشكل الخلية السداسية وتستطيل نحو القطبين الأمامي والخلفي ، وتشكل غلافا جديدا من الخلايا المتراكبة على الأجيال السابقة من الألياف. لا يعرف سوى القليل عن الآليات التي تدفع التشكل الملحوظ للخلايا الظهارية للعدسة إلى خلايا الألياف. لفهم بنية العدسة وتطورها ووظيفتها بشكل أفضل ، تم تطوير بروتوكولات تصوير جديدة لتصوير الهياكل الطرفية باستخدام حوامل كاملة من عدسات العين. هنا ، يتم عرض طرق تحديد سمك الكبسولة ، ومنطقة الخلية الظهارية ، والمنطقة النووية للخلية وشكلها ، وترتيب خلية الصف الزوالي والتعبئة ، وعرض الخلايا الليفية. هذه القياسات ضرورية لتوضيح التغيرات الخلوية التي تحدث أثناء نمو العدسة مدى الحياة وفهم التغييرات التي تحدث مع تقدم العمر أو علم الأمراض.

Introduction

عدسة العين هي نسيج مرن وشفاف يقع في المنطقة الأمامية من العين يعمل على تركيز الضوء بدقة على شبكية العين. يمكن أن تعزى قدرة العدسة على العمل ، جزئيا ، إلى بنيتها المعقدة وتنظيمها^{1،2،3،4،5،6}. تحيط بالكبسولة أنسجة العدسة ، وهي غشاء قاعدي ضروري للحفاظ على بنية العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية^7،8،9. العدسة نفسها خلوية بالكامل ، وتتكون من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية والليفية. ....

Protocol

يتم إيواء الفئران في منشأة بجامعة ديلاوير ، ويتم الاحتفاظ بها في بيئة خالية من مسببات الأمراض. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك القتل الرحيم عن طريق استنشاق CO₂ ، وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ديلاوير (IACUC).

1. إعداد عدسة كاملة جبل والتصوير

1. تثبيت العدسات للتصوير الكامل
   1. بعد القتل الرحيم ، قم باستئصال العينين وتشريح العدسات كما هو موضح سابقا²⁵. بعد التشريح، انقل العدسات على الفور إلى محلول ملحي جديد 1x فوسفات مخزن (PBS؛ 1.1 mM KH₂PO₄، 155 mM، NaCl، 3.0 mM_{Na 2}HPO 4-7H₂O

النتائج

كبسولة العدسة الأمامية ومنطقة الخلايا الظهارية والمنطقة النووية
لتحليل سمك كبسولة العدسة ، قمنا بتلوين كبسولات العدسات ، إما في العدسات الحية أو الثابتة ، باستخدام WGA. حددنا الخلايا الظهارية للعدسة عن طريق تسمية الأغشية باستخدام tdTomato في العدسات الحية (الشكل 2 أ.......

Discussion

تتيح البروتوكولات الموصوفة تصورا عالي الدقة المكانية لهياكل وخلايا العدسات المحيطية في المناطق الأمامية والاستوائية للعدسة. في هذه الدراسة ، تم عرض طرق لتصور الهياكل الطرفية للعدسة باستخدام عدسات سليمة (حية أو ثابتة) حيث يتم الحفاظ على بنية عدسة 3D الشاملة. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت طرق بسي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R