Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

요약

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

초록

수정체는 다양한 거리의 빛을 망막에 집중시키기 위해 모양을 바꾸는 투명하고 유연한 조직입니다. 캡슐이라고 하는 장기를 둘러싼 기저막을 제외하고, 수정체는 전반구에 있는 상피 세포의 단층과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리로 구성된 완전한 세포입니다. 일생 동안 상피 세포는 수정체 적도의 발아 영역에서 증식하고 적도 상피 세포는 새로 형성된 섬유 세포로 이동, 연장 및 분화합니다. 적도 상피 세포는 무작위로 채워진 조약돌 모양의 세포에서 자오선을 형성하는 정렬된 육각형 모양의 세포로 형태를 실질적으로 변경합니다. 새로 형성된 수정체 섬유 세포는 육각형 세포 모양을 유지하고 전극과 후극을 향해 길쭉하게 뻗어 이전 세대의 섬유 위에 겹쳐진 새로운 세포 껍질을 형성합니다. 수정체 상피 세포의 놀라운 형태 형성을 섬유 세포로 유도하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 렌즈의 구조, 발달 및 기능을 더 잘 이해하기 위해 접안렌즈의 전체 마운트를 사용하여 주변 구조를 이미지화하는 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 여기서는 캡슐 두께, 상피 세포 면적, 세포 핵 면적 및 모양, 자오선 행 세포 순서 및 패킹, 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 측정은 평생 수정체가 성장하는 동안 발생하는 세포 변화를 설명하고 나이 또는 병리학에 따라 발생하는 변화를 이해하는 데 필수적입니다.

서문

수정체는 눈의 앞쪽에 위치한 유연하고 투명한 조직으로, 망막에 빛을 미세하게 초점을 맞추는 기능을 합니다. 렌즈의 기능 능력은 부분적으로는 렌즈의 복잡한 구조와 조직 1,2,3,4,5,6에 기인합니다. 수정체 조직을 둘러싸고 있는 캡슐은 수정체 구조와 생체역학적 특성을 유지하는 데 필수적인 기저막입니다 ^7,8,9. 수정체 자체는 완전히 세포형이며 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 상피층은 렌즈(¹⁰)의 전반구를 덮는 직육면체 세포의 단층으로 구성된다. 일생 동안 상피 세포는 증식하여 수정체 캡슐을 따라 수정체 적도를 향해 이동합니다. 전방 상피 세포는 단면이 정지되어 있고 조약돌이며, 수정체 적도 근처에서 상피 세포가 증식하여 새로운 섬유 세포로 분화 과정을 거치기 시작합니다^11,12. 적도 상피 세포는 무작위로 포장된 세포에서 육각형 모양의 세포가 있는 조직화된 분열 열로 변형됩니다. 육각형 세포 모양은 이러한 분화 세포의 기저 쪽에서 유지되는 반면 정점 쪽은 수정체 받침점 또는 수정체 4,13,14,15에서 수축 및 고정됩니다. 적도 상피 세포가 새로 형성된 섬유 세포로 늘어나기 시작하면 세포의 정점 끝은 전방 상피 세포의 정점 표면을 따라 전극을 향해 이동하는 반면 기저 끝은 수정체 캡슐을 따라 후방 극을 향해 이동합니다. 새로운 세대의 섬유 셀은 이전 세대의 셀을 오버레이하여 섬유의 구형 껍질을 만듭니다. 세포 신장 및 성숙 과정 동안, 섬유 세포는 실질적으로 그들의 형태를 변화시킨다 11,12,16. 이 섬유 세포는 렌즈 질량 11,12,16,17,18의 대부분을 형성합니다.

복잡한 수정체 미세 구조, 세포 형태 및 독특한 세포 조직을 확립하는 데 기여하는 분자 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않습니다. 또한, 수정체 캡슐과 세포 구조가 전체 수정체 기능(투명도, 수정체 형태 변화)에 기여하는 정도는 불분명합니다. 그러나 이러한 관계는 새로운 이미징 방법론과 수정체의 구조적 및 세포 특징에 대한 정량적 평가를 사용하여 해명되고 있습니다 2,4,19,20,21,22. 렌즈 캡슐, 상피 세포 및 말초 섬유 세포의 높은 공간 해상도 시각화를 가능하게 하는 전체 렌즈를 이미지화하는 새로운 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에는 캡슐 두께, 세포 크기, 세포핵 크기 및 원형도, 자오선 행 순서, 섬유 세포 패킹 및 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법론이 포함됩니다. 이러한 시각화 및 이미지 정량화 방법은 심층적인 형태 측정 검사를 가능하게 하며 전체 3D 조직 구조를 보존함으로써 다른 시각화 방법(평면 마운트 또는 조직 절편의 이미징)에 비해 장점이 있습니다. 이러한 방법은 새로운 가설을 검증할 수 있게 해주었으며, 수정체 세포 패턴의 발달과 기능에 대한 이해를 지속적으로 발전시킬 것입니다.

다음 실험에서는 남녀 모두 6주에서 10주 사이의 C57BL/6J 배경에서 야생형 및 Rosa26-tdTomato 마우스 탠덤 이량체-Tomato(B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories))를 사용합니다. tdTomato 마우스는 N-말단 미리스타일화 및 내부 시스테인-팔미토일화 부위를 통해 원형질막을 표적으로 하는 돌연변이된 MARCKS 단백질의 N-말단 8 아미노산에 융합된 tdTomato 단백질의 발현을 통해 살아있는 수정체에서 세포 원형질막을 시각화할 수 있습니다²³. 또한 로버트 아델스타인 박사(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)로부터 얻은 NMIIA^{E1841K/E1841K} 마우스(²⁴ )를 사용합니다. 앞서 기술한 바와 같이,²⁰, CP49 비드 중간 필라멘트 단백질의 손실(성숙한 섬유 세포 형태 및 전체 수정체 생체역학 유지)이 있는 FvBN/129SvEv/C57Bl6 배경의 NMIIA^{E1841K/E1841K} 마우스는 C57BL6/J 야생형 마우스와 역교배됩니다. 우리는 야생형 CP49 대립유전자의 존재에 대해 자손을 스크리닝했습니다.

컨포칼 이미징은 20x(NA = 0.8, working distance = 0.55mm, 1x zoom), 40x(NA = 1.3 oil objective, working distance = 0.2mm, 1x zoom) 또는 63x(NA = 1.4 oil objective, working distance = 0.19mm, 1x zoom) 배율로 레이저 스캐닝 컨포칼 형광 현미경에서 수행되었습니다. 모든 이미지는 광학 단면 두께의 결정 요인인 핀홀 크기를 사용하여 1 Airy Unit까지 획득했습니다(결과 광학 두께는 그림 범례에 명시되어 있음). 이미지는 Zen Software에서 처리되었습니다. 이미지를 .tif 형식으로 내보낸 다음 FIJI ImageJ Software(imageJ.net)로 가져왔습니다.

프로토콜

생쥐는 병원체가 없는 환경에서 관리되는 델라웨어 대학교 동물 시설에 수용됩니다. CO2 흡입에 의한 안락사를 포함한 모든 동물 절차는 델라웨어 대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 전체 렌즈 마운트 준비 및 이미징

1. 전체 마운트 이미징을 위한 렌즈 고정
   1. 안락사 후 눈의 적출과 수정체를 해부한다²⁵. 해부 후 렌즈를 실온에서 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS; 1.1mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na₂HPO 4-7H₂O; pH 7.4)에 즉시 옮깁니다.
      알림: 렌즈를 PBS에 장기간 보관하면 세포 형태가 변경될 수 있으므로 절제 후 ~10분 이내에 즉시 고정하는 것이 좋습니다.
   2. 렌즈 전방 영역의 전체 마운트 이미징을 위해 실온의 마이크로 원심분리 튜브에 있는 1x PBS의 갓 만든 4% 파라포름알데히드(PFA) 0.5mL에 담가 전체 렌즈를 고정합니다. 30분 후 1x PBS로 렌즈를 3번(세탁당 5분) 세척합니다. 1.2단계로 진행하거나 4°C에서 1x PBS에 보관합니다. 고정 렌즈는 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
   3. 렌즈 적도 영역의 전체 마운트 이미징을 위해 실온의 마이크로 원심분리 튜브에 1x PBS로 갓 만든 4% PFA 0.5mL를 담가 전체 렌즈를 고정합니다. 1시간 후 1x PBS로 렌즈를 3회(세탁 당 5분) 세척합니다. 1.3단계로 진행하거나 4°C에서 1x PBS에 보관합니다. 고정 렌즈는 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 전방 렌즈 영역의 전체 마운트(고정 또는 라이브)
   1. fixed lens의 whole-mount 이미징의 경우 1.2.3단계로 진행합니다.
   2. 살아있는 렌즈의 전체 마운트 이미징의 경우, 1% 항생제/항진균제가 함유된 1mL의 Medium 199(페놀 레드 프리)가 들어 있는 48웰 플레이트의 웰로 렌즈를 옮깁니다. 이미징할 때까지 37°C 및 5%_CO2 에서 렌즈를 배양합니다. 이미징하기 전에 형광 표지된 밀 배아 응집체(WGA-640, 1:500) 및 Hoechst 33342(1:500)를 함유한 용액에서 Medium 199에서 최소 10분 동안 렌즈를 배양합니다. 1.5단계로 진행합니다.
   3. 렌즈 캡슐, F-액틴 및 고정 렌즈의 핵을 염색하려면 WGA-640(1:500), 로다민-팔로이딘(1:50) 및 Hoechst 33342(1:500)가 포함된 500μL 용액에 투과성/차단 완충액(0.3% 트리톤, 0.3% 소 혈청 알부민(분획 V) 및 3% 염소 혈청을 함유한 PBS 1개)를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 밤새 4°C에서 렌즈를 염색합니다.
   4. 하룻밤 배양 후 1x PBS 1mL로 렌즈를 3회(세척 당 5분) 세척합니다. 이미징 렌즈로 진행합니다.
   5. 컨포칼 이미징을 위해 fixed lens를 안정화하려면 앞서 설명한 대로 이미징 접시 상의 agarose에 lens immobilization divots를 생성합니다²¹ (그림 1).
      1. 가열하고 용액이 액화될 때까지 전자레인지를 사용하여 PBS에서 2% 아가로스를 부드럽게 혼합합니다. 액화 2% 아가로스 250μL를 유리 바닥 접시에 피펫팅하고(그림 1A) 유연한 플라스틱 커버슬립을 사용하여 접시 전체에 아가로스를 평평하게 만듭니다(그림 1B). 아가로스가 냉각되고 완전히 응고되면 가는 팁 겸자(그림 1C)를 사용하여 커버슬립을 제거하고 3mm 생검 펀치를 사용하여 접시 중앙에 아가로스에 구멍을 만듭니다(그림 1D).
      2. 섬세한 작업 와이프를 사용하여 과도한 아가로스를 제거합니다(그림 1E). 아가로스 몰드를 1x PBS로 수화하고 사용할 때까지 4°C에서 유지합니다. 아가로스 몰드는 최대 1주일 동안 성공적으로 보관되었습니다.
   6. 배아 겸자를 사용하여 살아있는 렌즈 또는 고정 렌즈를 1x PBS(고정 렌즈) 또는 페놀 적색이 없는 배지 199(라이브 렌즈)의 ~2mL가 들어 있는 아가로스(그림 1F)의 디봇으로 부드럽게 옮긴 다음 접시를 도립 현미경 스테이지에 놓습니다. 렌즈가 대물렌즈를 향하는 앞쪽 영역에 위치하는지 확인하려면 핵 염색을 시각화합니다. 핵이 관찰되지 않으면 후방 영역이 대물렌즈를 향하고 있을 수 있습니다.
   7. 렌즈를 뒤집으려면 구부러진 집게를 사용하고 렌즈를 ~180° 부드럽게 회전시켜 앞쪽 영역이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.
   8. 렌즈 캡슐의 시각화를 위해 스텝 크기가 0.3μm인 40x 대물렌즈를 사용하여 z-stack 이미지를 획득합니다. 렌즈 캡슐 표면 이전의 첫 번째 이미지(WGA 염색으로 표시)와 상피 세포의 정점 표면 이후의 마지막 이미지를 획득합니다. 상피 세포를 시각화하려면 렌즈 상피 세포의 시각화를 위해 스텝 크기가 0.3μm인 63x 대물렌즈를 사용하여 z-stack 이미지를 획득하십시오.
      참고: 이러한 현미경 매개변수는 캡슐 두께 또는 상피 세포 면적의 이미지 정량화에 필수적인 이미지의 적절한 3차원(3D) 재구성을 허용합니다. 또한 앞서 설명한 바와 같이 상피 세포 단층을 지나 이미징하여 라이브 렌즈 tdTomato 렌즈에서 봉합사를 이미지화할 수 있습니다⁴.
3. 수정체 적도 상피 및 섬유 세포 염색
   1. 미세 원심분리 튜브 내의 투과성/차단 용액(3% BSA, 3% 염소 혈청 및 0.3% Triton)에 있는 rhodamine-phalloidin(1:300), WGA-640(1:250) 및 Hoechst 33342(1:500)의 0.5mL 용액에 고정 렌즈를 넣습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 유지합니다.
   2. 하룻밤 배양 후 렌즈를 1mL 1x PBS에 3번 세척합니다(세척 당 5분).
   3. 앞서 설명한 바와 같이 렌즈 고정화 아가로스 웨지를 생성합니다 ^4,10.
      1. 간단히 말해서, 35x PBS에서 ~6-5mL의 용융된 2% 아가로스를 접시에 부어 유리 바닥 접시(FD1-100, WPI)에 아가로스 웨지를 만듭니다(그림 2A). 아가로스가 응고되면(그림 2B) 날카로운 칼날이 있는 삼각형 디봇을 만듭니다(그림 2C). 아가로스 웨지를 제거하고 1x PBS 1mL를 아가로스 접시에 넣습니다(그림 2D).
      2. 아가로스를 절단할 때 남을 수 있는 잔여 아가로스를 흡인합니다. 다양한 크기의 렌즈(표시되지 않음)에 맞도록 접시당 여러 개의 웨지를 만들 수 있습니다. 아가로스 몰드를 보관하려면 1x PBS 1mL를 아가로스 몰드에 놓고 4°C에서 보관합니다. 웨지는 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
   4. 곡선형 핀셋을 사용하여 1x PBS 1mL가 들어 있는 아가로스 웨지 안에 렌즈를 놓고 렌즈의 적도 영역이 컨포칼 대물렌즈 위의 현미경 유리를 아래로 향하도록 조정합니다(그림 2E-F). 적도 영역에 초점이 맞춰져 있는지 확인하려면 핵을 시각화하고 핵이 적도에서 일렬로 정렬되어 있는지 확인합니다. 적도 상피 세포는 불규칙하게 포장되고 모양이 형성되어 있기 때문에 식별 할 수 있습니다. 또한 자오선 행 세포는 정밀하게 정렬되고 육각형 모양이며 세포막에서 F-actin 염색으로 표시됩니다.
   5. 시야의 핵이 무작위로 채워져 있으면 수정체의 앞쪽이 대물렌즈를 향하게 됩니다. 핵을 관찰할 수 없는 경우 수정체의 뒤쪽이 대물렌즈를 향하고 있을 가능성이 큽니다. 렌즈가 적도에 있지 않으면 렌즈의 방향을 바꾸고 렌즈 적도에 정확하게 정렬된 핵이 관찰될 때까지 곡선 핀셋을 사용하여 렌즈를 회전시킵니다.
   6. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(20x objective, NA = 0.8, step size 0.5 μm 및/또는 40x oil objective, NA = 1.3, step size 0.4 μm)을 사용하여 렌즈 적도 상피 및 섬유 세포를 이미지화합니다. 적도 상피 세포가 맨 위에 있고 그 뒤에 자오선 열과 섬유 세포가 바로 아래에 있는 z-stack 수집 전에 이미지를 회전합니다.

2. 이미지 분석 방법론

1. 렌즈 캡슐 두께 측정
   1. WGA로 라벨링된 라이브 tdTomato 렌즈 또는 WGA 및 rho-phalloidin으로 라벨링된 고정 렌즈의 40x 대물렌즈(0.3μm 스텝 크기)로 얻은 z-stack 이미지를 사용하여 3D 재구성의 XZ 뷰에서 광학 2D 프로젝션을 얻고 .tif 형식으로 저장합니다. Zen 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
   2. FIJI ImageJ 소프트웨어에서 XZ 슬라이스(.tif) 이미지를 엽니다.
   3. 렌즈 캡슐 두께를 측정하려면 직선 기능( 그림 3A, B 참조)을 사용하십시오. Edit > Options > Line width를 선택하여 선 너비를 50픽셀로 설정합니다. 이 선폭은 현미경 설정에서 높은 신호 대 잡음비를 제공하기 위해 경험적으로 결정되었습니다. 최적의 선폭은 다른 현미경/현미경 설정 또는 다른 종의 렌즈를 사용할 때 다를 수 있습니다. 다음으로, 캡슐의 상단 표면에서 상피 세포의 기저 영역 아래까지 선을 그립니다.
   4. Ctrl + T를 눌러 선을 관심 영역으로 저장합니다.
   5. 채널을 이미지, 색상 및 분할 채널에 대한 탭으로 구분합니다.
   6. Ctrl + K를 눌러 캡슐 채널의 선을 따라 강도를 측정합니다.
   7. 스프레드시트에서 강도 값을 거리의 함수로 플로팅하고 상피 세포의 캡슐 표면과 기저 영역을 각각 나타내는 캡슐 및 F-액틴의 강도 피크를 결정합니다. x축에는 선 거리가 있습니다.
   8. 다음으로, 캡슐과 상피 형광 강도 피크 사이의 거리를 결정하여 캡슐 두께를 계산합니다(그림 3C, D).
2. 세포 면적 분석
   1. 63x 대물렌즈(NA = 1.4, 0.3μm 단계 크기)를 사용하여 얻은 z-stack 이미지를 라이브 tdTomato 렌즈 또는 phalloidin으로 표지된 고정 렌즈에서 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 컨포칼 이미지에서 XY 뷰 슬라이스를 분석합니다. tdTomato 멤브레인 염료를 사용하거나 외측 세포막에 존재하는 팔로이딘을 시각화하여 외측 막은 볼 수 있습니다.
      참고: 렌즈의 곡률로 인해(XZ에서 볼 수 있듯이; 그림 4A-C), 모든 상피 세포가 이미지에서 초점이 맞춰지는 것은 아닙니다. 상피의 중간 영역은 세포 측막(그림 4D-E)과 핵(그림 4G-I)에 초점이 맞춰진 영역에 해당합니다.
   2. 이미지를 .tif로 내보내고 FIJI ImageJ에서 엽니다.
   3. 분석을 위해 FIJI ImageJ에서 축척을 설정하려면 선 도구를 사용하여 공초점 이미지에서 축척 막대 길이인 선을 만듭니다.
   4. 선의 픽셀 길이와 축척 막대의 길이를 기록합니다. 도구 모음 메뉴에서 Analyze(분석)로 이동하여 Set Scale(배율 설정)을 선택합니다. Distance in Pixels(픽셀 단위 거리)에 선의 길이인 픽셀 수를 입력하고 Known Distance(알려진 거리) 입력에 축척 막대의 알려진 길이를 입력합니다.
   5. tdTomato 또는 rhodamine-phalloidin 염색을 세포 경계 표시로 사용하여 다각형 도구를 사용하여 이미지 내에서 초점이 맞춰진 세포 집단의 윤곽을 수동으로 그립니다. 외측막이 보이는 세포만 추적하고(그림 4E) 부분적으로 보이는 세포(예: 이미지 가장자리)는 추적하지 않습니다. Ctrl+T를 눌러 ROI를 저장합니다. 도구 모음 메뉴에서 Edit(편집)로 이동하여 Clear Outside(외부 지우기)를 선택합니다. 이제 FIJI ImageJ에서 Ctrl + M 을 눌러 총 셀 면적(ROI)을 측정합니다.
   6. ROI 영역을 총 셀 수로 나누어 평균 셀 면적을 계산합니다. 세포의 수를 결정하는 간단한 방법은 핵의 수를 세는 것입니다. 핵 채널(파란색)로 이동합니다. ROI 메뉴에서 저장된 셀의 ROI 개요를 선택합니다(그림 4G). Edit(편집)로 이동한 다음 Clear outside(외부 지우기 )를 클릭하여 ROI 외부를 지웁니다(그림 4H). Multi-point 도구를 사용하여 개별 핵을 클릭하여 핵을 계산합니다.
3. 세포 핵 영역 및 형상 분석
   1. 핵 면적 및 형상 분석의 경우, tdTomato 상피 세포의 중간(측면) 영역에 초점이 맞춰진 위치에 해당하는 z-stack 공초점 이미지에서 XY 평면도 광학 단면을 분석합니다. 핵 영역이 가장 큰 공초점 이미지에서 z-stack 슬라이스를 분석합니다(그림 5A). 이것은 핵의 중간 부분을 나타냅니다.
      NOTE: 렌즈의 곡률로 인해 XZ 뷰에서 볼 수 있듯이 모든 핵에 초점이 맞춰지는 것은 아닙니다(그림 4G 및 그림 5A).
   2. 초점이 맞춰진 핵의 부분집단을 선택하고 ROI를 저장합니다.
   3. 외부 지우기 기능을 사용합니다. ROI 내에서 자유형 선택 도구(왼쪽에서 네 번째 메뉴 버튼)를 사용하여 핵의 경계를 주의 깊게 추적합니다(그림 5B). Ctrl+T를 눌러 각 핵 추적을 ROI 창에 저장합니다. 완전한 핵을 볼 수 있고 핵이 서로 닿지 않는 외곽선 핵만 있습니다.
   4. 모든 핵의 윤곽이 잡히면 Ctrl+M을 눌러 개별 세포의 핵 영역과 모양(즉, 원형도)을 측정합니다.
   5. 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 평균 핵 면적과 원형도를 계산합니다(그림 5C).
4. 자오선 행 상피 패킹
   1. 자오선 장애를 측정하려면 20x 대물렌즈(0.5μm 스텝 크기)를 사용하여 이미지를 획득합니다.
   2. 이미지에서 렌즈 받침점/수정체를 식별합니다. 받침점은 길쭉한 상피 세포의 정점 끝이 수축하여 적도에서 초기 섬유 세포 분화 및 신장 중에 앵커 포인트를 형성하는 영역입니다. 밝은 F-액틴 강도( 그림 6A의 XZ 보기에서는 화살촉으로 표시, 그림 6B에서는 빨간색 점선으로 표시)를 기반으로 받침점을 식별하고 XY 보기의 단일 광학 섹션에서 세포 조직의 변화를 식별합니다.
      참고: 또한, 상피 세포의 기저 영역과 정점 영역 모두의 F-액틴 염색은 받침점 위에서 뚜렷하게 나타나는 반면, 길쭉한 세포의 기저 영역만 받침점 아래에서 뚜렷하게 나타납니다(그림 6A). 지렛대 선 위의 상피 세포는 불규칙하게 채워져 있고 로제트를 형성하는 경향이 있는 반면, 지렛대 아래의 섬유 세포는 평행한 줄로 배열되어 있으며 막에서 밝은 F-액틴 염색으로 표시됩니다(그림 6B).
   3. 2개월 된 마우스에서 받침점이 확인되면 XY 평면의 받침점(렌즈 캡슐 쪽)에 대한 주변 ~4.5-5μm의 단일 광학 섹션을 선택합니다. 이 거리는 2개월 된 마우스의 자오선 행 세포의 모든 핵이 받침점 주변부에 ~5μm 있을 때 초점이 맞춰져 있다는 관찰을 기반으로 선택됩니다. 단일 광학 섹션(.tif)을 저장합니다. FIJI에서 이미지를 엽니다.
      참고: 이 분석은 2개월 된 쥐에 대해서만 수행되었으므로 이 거리가 나이에 따라 변하는지 여부를 결론지을 수 없습니다.
   4. 이미지 분석을 수행하기 전에 2.2.2단계를 사용하여 ImageJ에서 스케일을 μm로 설정합니다.
   5. 그림 7A와 같이 핵 정렬을 식별하여 자유형 라인 도구(관심 영역/ROI)를 사용하여 전체 자오선 행 영역의 윤곽을 수동으로 그립니다. Ctrl+T를 눌러 ROI를 저장합니다. 도구 모음 메뉴에서 Edit(편집)로 이동하여 Clear Outside(외부 지우기)를 선택합니다. FIJI ImageJ에서 Ctrl + M을 눌러 총 셀 면적(ROI)을 측정합니다.
   6. FIJI ImageJ의 자유형 라인 도구를 사용하여 윤곽을 그려 F-액틴 염색으로 표시된 무질서 영역을 식별합니다. 무질서한 영역에 대한 기준에는 앞의²⁰과 같이 행의 분기, 불규칙한 패킹, 행의 정렬 불량이 포함됩니다(그림 7B).
   7. FIJI ImageJ에서 Ctrl + M 을 눌러 윤곽선이 있는 무질서한 영역/패치된 영역을 측정합니다. 스프레드시트의 전체 무질서 영역을 합산합니다.
   8. 전체 무질서 영역을 ROI 영역으로 나눈 다음 100을 곱하여 무질서 영역 백분율을 구합니다. 장애가 관찰되지 않으면 장애 영역에 대해 0% 값을 설정합니다.
5. 인접 세포의 자오선 행 수
   1. 인접 세포의 수를 측정하려면 40x 오일 대물렌즈(0.4μm 단계 크기)로 획득한 F-액틴 염색 이미지를 사용하십시오.
   2. F-액틴이 자오선 행 세포의 전체 둘레에 농축되어 있는 렌즈 캡슐에서 안쪽으로 자오선 행 세포의 기저 영역에서 광학 섹션(XY 평면)을 식별하고, 모든 자오선 행 세포는 초점이 맞춰져 있고 동일한 평면에 있습니다.
   3. 각 자오선 행 셀에 있는 인접 셀의 수를 계산합니다(그림 8). 스프레드시트에서 6개의 인접한 셀이 있는 셀의 평균 백분율을 측정합니다.
      참고: 20x 대물렌즈로 인접한 셀의 수를 결정합니다. 그러나 40x 대물렌즈로 육각형 모양을 관찰하는 것이 훨씬 쉽습니다.
6. 적도 섬유 세포의 이미지 분석
   1. 20x 대물렌즈(0.5μm 단계 크기)로 로다민 팔로이딘 염색 렌즈의 z-stack 컨포칼 이미지를 촬영합니다.
   2. 2.4.2단계에 표시된 대로 받침점을 식별합니다. 받침점이 식별되면 단일 광학 섹션을 선택합니다. 표준화를 위해 렌즈를 비교하기 위해 XY 평면의 받침점에서 안쪽으로 ~10μm fiber cell 너비를 정량화합니다(그림 9A).
   3. Raw 이미지를 FIJI ImageJ로 내보냅니다. FIJI ImageJ에서 F-액틴 염색 피크 사이의 거리를 측정하기 위해 여러 인접 섬유 셀을 가로질러 선(보통 ~300-400μm 길이)을 그립니다(라인 스캔 분석; 그림 9A; 분홍색 선).
   4. Ctrl+K를 눌러 FIJI의 라인 스캔 거리에 대한 형광 강도를 구합니다. 그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보내 피크 간 거리를 계산합니다(그림 9A-B 참조). 이것은 섬유 셀 너비에 해당합니다.

결과

수정체 전방 캡슐, 상피 세포 영역 및 핵 영역
렌즈 캡슐 두께를 분석하기 위해 WGA를 사용하여 라이브 렌즈 또는 고정 렌즈의 렌즈 캡슐을 염색했습니다. 살아있는 렌즈에서 tdTomato로 막을 표지하거나(그림 2A) 고정 렌즈의 세포막에서 F-actin에 대한 로다민-팔로이딘 염색을 통해 수정체 상피 세포를 식별했습니다(그림 2B). 직교(XZ) 투영에?...

토론

설명된 프로토콜은 렌즈의 전방 및 적도 영역에서 주변 렌즈 구조와 세포의 높은 공간 해상도를 시각화할 수 있습니다. 본 연구에서는 전체 3D 렌즈 구조가 보존된 온전한(라이브 또는 고정) 렌즈를 사용하여 렌즈 주변 구조를 시각화하는 방법을 보여주었습니다. 또한 공개적으로 사용 가능한 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용한 형태 측정 정량 분석을 위한 간단한 방법이 제공되었습니다. 전체 마운트 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R