Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

요약

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

초록

수정체는 다양한 거리의 빛을 망막에 집중시키기 위해 모양을 바꾸는 투명하고 유연한 조직입니다. 캡슐이라고 하는 장기를 둘러싼 기저막을 제외하고, 수정체는 전반구에 있는 상피 세포의 단층과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리로 구성된 완전한 세포입니다. 일생 동안 상피 세포는 수정체 적도의 발아 영역에서 증식하고 적도 상피 세포는 새로 형성된 섬유 세포로 이동, 연장 및 분화합니다. 적도 상피 세포는 무작위로 채워진 조약돌 모양의 세포에서 자오선을 형성하는 정렬된 육각형 모양의 세포로 형태를 실질적으로 변경합니다. 새로 형성된 수정체 섬유 세포는 육각형 세포 모양을 유지하고 전극과 후극을 향해 길쭉하게 뻗어 이전 세대의 섬유 위에 겹쳐진 새로운 세포 껍질을 형성합니다. 수정체 상피 세포의 놀라운 형태 형성을 섬유 세포로 유도하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 렌즈의 구조, 발달 및 기능을 더 잘 이해하기 위해 접안렌즈의 전체 마운트를 사용하여 주변 구조를 이미지화하는 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 여기서는 캡슐 두께, 상피 세포 면적, 세포 핵 면적 및 모양, 자오선 행 세포 순서 및 패킹, 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 측정은 평생 수정체가 성장하는 동안 발생하는 세포 변화를 설명하고 나이 또는 병리학에 따라 발생하는 변화를 이해하는 데 필수적입니다.

서문

수정체는 눈의 앞쪽에 위치한 유연하고 투명한 조직으로, 망막에 빛을 미세하게 초점을 맞추는 기능을 합니다. 렌즈의 기능 능력은 부분적으로는 렌즈의 복잡한 구조와 조직 1,2,3,4,5,6에 기인합니다. 수정체 조직을 둘러싸고 있는 캡슐은 수정체 구조와 생체역학적 특성을 유지하는 데 필수적인 기저막입니다 ^7,8,9. 수정체 자체는 완전히 세포형이며 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 상피층은 렌즈(¹⁰)의 전반구를 덮는 직육면체 세포의 단층으로 구성된다. 일생 동안 상피 세포는 증식하여 수정체 캡슐을 따라 수정체 적도를 향해 이동합니다. 전방 상피 세포는 단면이 정지되어 있고 조약돌이며, 수정체 적도 근처에서 상....

프로토콜

생쥐는 병원체가 없는 환경에서 관리되는 델라웨어 대학교 동물 시설에 수용됩니다. CO2 흡입에 의한 안락사를 포함한 모든 동물 절차는 델라웨어 대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 전체 렌즈 마운트 준비 및 이미징

1. 전체 마운트 이미징을 위한 렌즈 고정
   1. 안락사 후 눈의 적출과 수정체를 해부한다²⁵. 해부 후 렌즈를 실온에서 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS; 1.1mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na₂HPO 4-7H₂O; pH 7.4)에 즉시 옮깁니다.
      알림: 렌즈를 PBS에 장기간 보관하면 세포 형태가 변경될 수 있으므로 절제 후 ~10분 이내에 즉시 고정하는 것이 좋습니다.
   2. 렌즈 전방 영역의 전체 마운트 이미징을 위해 실온의 마이크로 원심분리 튜브에 있는 1x PBS의 갓 만든 4% 파라포름알데히드(PFA) 0.5mL에 담가 전체 렌즈를 고정합니다. 30분....

토론

설명된 프로토콜은 렌즈의 전방 및 적도 영역에서 주변 렌즈 구조와 세포의 높은 공간 해상도를 시각화할 수 있습니다. 본 연구에서는 전체 3D 렌즈 구조가 보존된 온전한(라이브 또는 고정) 렌즈를 사용하여 렌즈 주변 구조를 시각화하는 방법을 보여주었습니다. 또한 공개적으로 사용 가능한 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용한 형태 측정 정량 분석을 위한 간단한 방법이 제공되었습니다. 전체 마운트 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R