Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Özet

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Özet

Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.

Giriş

Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonuna^{bağlanabilir} 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membran^olan kapsüldür ^7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ve iki hücre tipinden oluşur: epitelyal ve fiber hücreler. Epitel tabakası, lensin¹⁰ ön hemisferini kaplayan tek bir küboidal hücre tabakasından oluşur. Yaşam boyunca, epitel hücreleri çoğalır ve lens kapsülü boyunca lens ekvatoruna doğru göç eder. Anterior epitel hücreleri enine kesitte hareketsiz ve parke taşıdır ve lens ekvatorunun yakınında epitel hücreleri çoğalır ve yeni lif hücrelerine farklılaşma sürecinden geçmeye başlar^11,12. Ekvator epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş hücrelerden altıgen şekilli hücrelerle organize meridyen sıralarına dönüşür. Altıgen hücre şekli, bu farklılaşan hücrelerin bazal tarafında korunurken, apikal taraf lens dayanak noktasında veya modiolus 4,13,14,15'te daralır ve sabitlenir. Ekvatoral epitel hücreleri yeni oluşan lif hücrelerine uzamaya başladığında, hücrelerin apikal uçları ön epitel hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca ön kutba doğru hareket ederken, bazal uçlar lens kapsülü boyunca arka kutba doğru hareket eder. Yeni nesil fiber hücreler, önceki nesil hücrelerin üzerini kaplayarak küresel lif kabukları oluşturur. Hücre uzaması ve olgunlaşma süreci sırasında, lif hücreleri morfolojilerini önemli ölçüde değiştirir 11,12,16. Bu lif hücreleri, lens kütlesinin 11,12,16,17,18 kütlesini oluşturur.

Karmaşık lens mikro yapılarının, hücre morfolojisinin ve benzersiz hücresel organizasyonun kurulmasına katkıda bulunan moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca, lens kapsülünün ve hücre yapısının genel lens fonksiyonuna (saydamlık, lens şekli değişikliği) katkısı belirsizdir. Bununla birlikte, bu ilişkiler yeni görüntüleme metodolojisi ve lens yapısal ve hücresel özelliklerinin kantitatif değerlendirmeleri kullanılarak aydınlatılmaktadır^{2,4,19,20,21,22}. Lens kapsülünün, epitel hücrelerinin ve periferik fiber hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesine izin veren tüm lensleri görüntülemek için yeni protokoller geliştirilmiştir. Bu, kapsül kalınlığını, hücre boyutunu, hücre çekirdeği boyutunu ve daireselliğini, meridyen sıra sırasını, fiber hücre paketlemesini ve fiber hücre genişliklerini ölçmek için metodolojiyi içerir. Bu görselleştirme ve görüntü niceleme yöntemleri, derinlemesine morfometrik incelemeye izin verir ve genel 3D doku yapısını koruyarak diğer görselleştirme yöntemlerine (düz bağlantıların veya doku kesitlerinin görüntülenmesi) göre avantajlara sahiptir. Bu yöntemler, yeni hipotezlerin test edilmesine izin vermiştir ve lens hücresi paterni gelişimi ve işlevinin anlaşılmasında sürekli ilerlemeyi sağlayacaktır.

Aşağıdaki deneyler için, her iki cinsiyetten 6 ila 10 haftalık yaşlar arasında C57BL/6J arka planında vahşi tip ve Rosa26-tdDomates fareleri tandem dimer-Domates (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) kullanıyoruz. tdTomato fareleri, N-terminal miristilasyon ve iç sistein-palmitoilasyon bölgeleri²³ yoluyla plazma zarını hedef alan mutasyona uğramış bir MARCKS proteininin N-terminal 8 amino asitlerine kaynaşmış tdTomato proteininin ekspresyonu yoluyla canlı lenslerde hücresel plazma zarlarının görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca orijinal olarak Dr. Robert Adelstein'dan (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) elde edilen NMIIA^{E1841K / E1841K} fareleri²⁴ kullanıyoruz. Daha önce açıklandığı gibi, CP49 boncuklu ara filament proteini kaybına sahip (olgun lif hücresi morfolojisini ve tüm lens biyomekaniğini korur) FvBN/129SvEv/C57Bl6 arka planındaki NMIIA^{E1841K/E1841K} fareleri, C57BL6/J vahşi tip farelerle geri çaprazlanır. Yavruları vahşi tip CP49 alelinin varlığı açısından taradık.

Konfokal görüntüleme, 20x (NA = 0.8, çalışma mesafesi = 0.55mm, 1x yakınlaştırma), 40x (NA = 1.3 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.2mm, 1x yakınlaştırma) veya 63x (NA = 1.4 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.19mm, 1x yakınlaştırma) büyütme ile lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüler, optik kesit kalınlığının belirleyicisi olan iğne deliği boyutu kullanılarak 1 Airy Unit'e kadar elde edilmiştir (ortaya çıkan optik kalınlıklar şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Görüntüler Zen Software'de işlendi. Görüntüler .tif formatta dışa aktarıldı ve ardından FIJI ImageJ Yazılımına (imageJ.net) aktarıldı.

Protokol

Fareler, patojen içermeyen bir ortamda tutulan Delaware Üniversitesi hayvan tesisinde barındırılır. CO₂ inhalasyonu ile ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri, Delaware Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Tüm lens yuvası hazırlığı ve görüntüleme

1. Tüm montaj görüntüleme için lenslerin sabitlenmesi
   1. Ötenaziyi takiben, daha önce tarif edildiği gibi gözleri enüklee edin ve lensleri inceleyin²⁵. Diseksiyonu takiben, lensleri hemen oda sıcaklığında taze 1x fosfat tamponlu salin (PBS; 1.1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3.0 mM Na₂HPO 4-7H₂O; pH 7.4) içine aktarın.
      NOT: Lensler PBS'de uzun süre saklanırsa hücresel morfoloji değişebilir, bu nedenle diseksiyondan hemen ~ 10 dakika sonra düzeltilmesi önerilir.
   2. Lens ön bölgesinin tam montajlı görüntülenmesi için, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüpünde 1x PBS'de 0,5 mL yeni yapılmış %4 paraformaldehit (PFA) içine daldırarak tüm lensleri sabitleyin. 30 dakika sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1x PBS ile yıkayın. Adım 1.2'ye geçin veya 1 °C'de 4x PBS'de saklayın. Sabit lensler 5 güne kadar saklanabilir.
   3. Lens ekvator bölgesinin tam montajlı görüntülenmesi için, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüpünde 1x PBS'de 0,5 mL yeni yapılmış %4 PFA'ya daldırarak tüm lensleri sabitleyin. 1 saat sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1x PBS ile yıkayın. Adım 1.3'e geçin veya 1x PBS'de 4 °C'de saklayın. Sabit lensler 5 güne kadar saklanabilir.
2. Ön lens bölgesinin tamamı (Sabit veya canlı)
   1. Sabit lenslerin tam montajlı görüntülenmesi için adım 1.2.3'e geçin.
   2. Canlı lenslerin tam montajlı görüntülenmesi için, lensleri %1 antibiyotik/antimikotik içeren 1 mL Orta 199 (fenol kırmızısı içermeyen) içeren 48 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Lensleri görüntülemeye kadar 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin. Görüntülemeden önce, lensleri floresan etiketli Buğday Tohumu Aglütinini (WGA-640, 1:500) ve Hoechst 33342 (1:500) içeren bir çözelti içinde Orta 199'da en az 10 dakika inkübe edin. Adım 1.5'e geçin.
   3. Lens kapsülünü, F-aktini ve sabit lenslerin çekirdeklerini boyamak için, lensleri WGA-640 (1:500), rodamin-phalloidin (1:50) ve Hoechst 33342 (1:500) içeren 500 μL'lik bir çözeltiye geçirgenleştirme/bloke etme tamponuna yerleştirin (%0,3 Triton, %0,3 sığır serum albümini (Fraksiyon V) ve %3 keçi serumu içeren 1x PBS) bir mikrosantrifüj tüpünde. Lensleri gece boyunca 4 °C'de boyayın.
   4. Gece boyunca inkübasyondan sonra, lensleri 3x (yıkama başına 5 dakika) 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Görüntüleme lenslerine geçin.
   5. Konfokal görüntüleme için sabit lensi stabilize etmek için, daha önce açıklandığı gibi bir görüntüleme kabı üzerinde agarozda lens immobilizasyon divotları oluşturun²¹ (Şekil 1).
      1. Çözelti sıvılaşana kadar bir mikrodalga kullanarak PBS'de% 2 agarozu ısıtın ve hafifçe karıştırın. 250 μL sıvılaştırılmış %2 agarozu cam tabanlı bir tabağa pipetleyin (Şekil 1A) ve esnek bir plastik lamel kullanarak agarozu tabak boyunca düzleştirin (Şekil 1B). Agaroz soğuduktan ve tamamen katılaştıktan sonra, ince uçlu forseps kullanarak lameli çıkarın (Şekil 1C) ve çanağın ortasında agarozda bir delik oluşturmak için 3 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın (Şekil 1D).
      2. Hassas bir görev mendili kullanarak fazla agarozu çıkarın (Şekil 1E). Agaroz küfünü 1x PBS ile nemlendirin ve kullanana kadar 4 °C'de tutun. Agaroz küfleri 1 haftaya kadar başarıyla saklanmıştır.
   6. Embriyo forseps kullanarak, canlı veya sabit lensi, ~2 mL 1x PBS (sabit lens) veya fenol kırmızısı içermeyen Medium 199 (canlı lens) içeren agarozdaki divot'a yavaşça aktarın (Şekil 1F) ve ardından tabağı ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Lensin ön bölge objektife bakacak şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için çekirdek boyamayı görselleştirin. Herhangi bir çekirdek gözlenmezse, arka bölge hedefe bakıyor olabilir.
   7. Lensi ters çevirmek için kavisli forseps kullanın ve ön bölge objektife bakacak şekilde lensi hafifçe ~180° döndürün. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.
   8. Lens kapsüllerinin görselleştirilmesi için, 0,3 μm adım boyutuna sahip 40x objektif kullanarak z-yığını görüntüleri elde edin. Lens kapsülünün yüzeyinden önceki ilk görüntüyü (WGA boyama ile gösterilir) ve epitel hücrelerinin apikal yüzeyinden sonraki son görüntüyü elde edin. Epitel hücrelerini görselleştirmek için, lens epitel hücrelerinin görselleştirilmesi için 0,3 μm'lik bir adım boyutuna sahip 63x objektif kullanarak z-yığını görüntüleri elde edin.
      NOT: Bu mikroskop parametreleri, kapsül kalınlığının veya epitel hücre alanının görüntü ölçümü için gerekli olan görüntülerin yeterli üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonuna izin verir. Daha önce tarif edildiği gibi epitel hücresi tek tabakasının ötesini görüntüleyerek canlı lens tdTomato lenslerinde sütürlerin görüntülenmesi de mümkündür⁴.
3. Lens ekvatoral epitel ve lif hücre boyama
   1. Sabit lensleri 0.5 mL'lik bir rodamin-phalloidin çözeltisine yerleştirin (1:300), WGA-640 (1:250) ve Hoechst 33342 (1:500) geçirgenlik/bloke edici çözelti içinde (% 3 BSA,% 3 keçi serumu ve% 0.3 Triton) bir mikrosantrifüj tüpü içinde. Gece boyunca 4 °C'de muhafaza edin.
   2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, lensleri 1 mL 1x PBS'de 3x yıkayın (yıkama başına 5 dakika).
   3. Daha önce tarif edildiği gibi lens immobilizasyon agaroz takozları oluşturun ^4,10.
      1. Kısaca, cam tabanlı tabaklarda (FD35-100, WPI) 1x PBS'de ~5-6 mL erimiş %2 agarozu tabaklara dökerek agaroz takozları oluşturun (Şekil 2A). Agaroz katılaştığında (Şekil 2B), keskin bir bıçakla üçgen bir divot oluşturun (Şekil 2C). Agaroz kamasını çıkarın ve agaroz kabına 1 mL 1x PBS yerleştirin (Şekil 2D).
      2. Agarozun kesilmesinden geride kalmış olabilecek herhangi bir kalıntı agarozu aspire edin. Birden fazla farklı boyuttaki lense uyacak şekilde çanak başına birden fazla kama oluşturulabilir (gösterilmemiştir). Agaroz kalıbını saklamak için, agaroz kalıbının üzerine 1 mL 1x PBS yerleştirin ve 4 °C'de tutun. Takozlar 1 haftaya kadar saklanabilir.
   4. Kavisli cımbız kullanarak, lensi 1 mL 1x PBS içeren bir agaroz kamasının içine yerleştirin ve lensin ekvator bölgesi, konfokal objektifin üzerindeki mikroskop camına bakacak şekilde ayarlayın (Şekil 2E-F). Ekvator bölgesinin odakta olduğunu doğrulamak için çekirdekleri görselleştirin ve çekirdeklerin ekvatorda sıralar halinde hizalandığından emin olun. Ekvatoral epitel hücreleri, düzensiz bir şekilde paketlendikleri ve şekillendirildikleri için de tanımlanabilir. Ayrıca, meridyen sıra hücreleri, hücre zarlarında F-aktin boyaması ile gösterilen hassas bir şekilde hizalanır ve altıgen şeklindedir.
   5. Görüş alanındaki çekirdekler rastgele paketlenirse, merceğin ön tarafı objektife bakar. Çekirdekler gözlemlenemiyorsa, merceğin arka tarafı büyük olasılıkla objektife bakıyordur. Mercek ekvatoruna oturmuyorsa, merceği yeniden yönlendirin ve mercek ekvatorunda tam olarak hizalanmış çekirdekler gözlemlenene kadar merceği döndürmek için kavisli cımbızı kullanın.
   6. Lazer taramalı konfokal mikroskop (20x objektif, NA = 0.8, adım boyutu 0.5 μm ve/veya 40x yağ objektifi, NA = 1.3, adım boyutu 0.4 μm) kullanarak lens ekvatoral epitel ve lif hücrelerini görüntüleyin. Ekvatoral epitel hücrelerinin en üstte olduğu, ardından hemen altında meridyen sırası ve lif hücrelerinin bulunduğu z-yığını toplamadan önce görüntüleri döndürün.

2. Görüntü analizi metodolojisi

1. Lens kapsülü kalınlığı ölçümü
   1. WGA ile etiketlenmiş canlı tdTomato lenslerin veya WGA ve rho-phalloidin ile etiketlenmiş sabit lenslerin 40x objektifi (0,3 μm adım boyutu) ile elde edilen z-yığını görüntüleri kullanarak, 3D rekonstrüksiyonun XZ görünümünde optik bir 2D projeksiyon elde edin ve .tif formatında kaydedin. Zen yazılımını kullanarak görüntüleri işleyin.
   2. XZ dilim (.tif) görüntülerini FIJI ImageJ yazılımında açın.
   3. Lens kapsülü kalınlığını ölçmek için düz çizgi işlevini kullanın (Şekil 3A,B'de gösterilmiştir). Çizgi genişliğini 50 piksel olarak ayarlamak için Çizgi genişliğini 50 piksel olarak ayarlayın > Seçenekleri Düzenle > seçin. Bu çizgi genişliği, mikroskop ayarlarıyla yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için ampirik olarak belirlendi. Optimum çizgi genişliği, diğer mikroskoplarda/mikroskop ayarlarında veya diğer türlerden lensler kullanıldığında farklılık gösterebilir. Ardından, kapsülün üst yüzeyinden epitel hücrelerinin bazal bölgesinin altına bir çizgi çizin.
   4. Ctrl + T tuşlarına basarak satırı ilgilendiğiniz bir bölge olarak kaydedin.
   5. Kanalları görüntü, renk ve bölünmüş kanallar için sekmelere ayırın.
   6. Ctrl + K tuşlarına basarak kapsül kanalı çizgisi boyunca yoğunluğu ölçün.
   7. Bir elektronik tabloda, yoğunluk değerlerini mesafenin bir fonksiyonu olarak çizin ve sırasıyla epitel hücrelerinin kapsül yüzeyini ve bazal bölgesini temsil eden kapsül ve F-aktin için yoğunluk tepe noktalarını belirleyin. X ekseninde çizgi mesafesi bulunur.
   8. Ardından, kapsül ve epitelyal floresan yoğunluk pikleri arasındaki mesafeyi belirleyerek kapsül kalınlığını hesaplayın (Şekil 3C, D).
2. Hücre alanı analizi
   1. Canlı tdTomato lenslerinde veya falloidin ile etiketlenmiş sabit lenslerde 63x objektif lens (NA = 1.4; 0.3 μm adım boyutu) kullanılarak elde edilen z-yığını görüntülerini kullanarak, epitel hücrelerinin orta (lateral) bölgesinin odakta olduğu yere karşılık gelen bir z-yığını konfokal görüntüden bir XY görünüm dilimini analiz edin. Yan zarların, tdTomato membran boyası kullanılarak veya lateral hücre zarlarında bulunan falloidin görselleştirilerek görülebildiğine dikkat edin.
      NOT: Merceğin eğriliği nedeniyle (XZ görünümünde görüldüğü gibi; Şekil 4A-C), görüntüde tüm epitel hücreleri odakta olmayacaktır. Epitelin orta bölgesi, hem hücre yan zarlarının (Şekil 4D-E) hem de çekirdeklerin (Şekil 4G-I) odakta olduğu bölgeye karşılık gelir.
   2. Görüntüyü .tif olarak dışa aktarın ve FIJI ImageJ'de açın.
   3. Analiz için FIJI ImageJ'de ölçeği ayarlamak için, konfokal görüntüden bir ölçek çubuğunun uzunluğu olan bir çizgi oluşturmak için çizgi aracını kullanın.
   4. Çizginin piksel uzunluğunu ve ölçek çubuğunun uzunluğunu kaydedin. Araç çubuğu menüsünde Çözümle'ye gidin ve Ölçeği Ayarla'yı seçin. Piksel sayısını, yani Piksel cinsinden Mesafe'ye çizginin uzunluğunu girin ve Bilinen Mesafe'ye ölçek çubuğunun bilinen uzunluğunu girin.
   5. Hücre sınırlarının bir göstergesi olarak tdTomato veya rodamin-phalloidin boyamayı kullanarak, çokgen aracını kullanarak görüntüde odakta olan bir hücre popülasyonunu manuel olarak ana hatlarıyla belirtin. Yalnızca yanal zarların görülebildiği hücreleri izleyin (Şekil 4E) ve kısmen görünür hücrelerin (yani görüntülerin kenarında) izlemekten kaçının. Ctrl+T tuşlarına basarak yatırım getirisinden tasarruf edin. Araç çubuğu menüsünde Düzenle'ye gidin ve Dışını Temizle'yi seçin. Şimdi FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak toplam hücre alanını (ROI) ölçün.
   6. ROI alanını toplam hücre sayısına bölerek ortalama hücre alanını hesaplayın. Hücre sayısını belirlemenin basit bir yolu, çekirdek sayısını saymaktır. Çekirdek kanalına (mavi) gidin. ROI menüsünde, hücrelerin kaydedilmiş ROI anahattını seçin (Şekil 4G). Düzenle'ye gidip Dışını temizle'ye tıklayarak YG'nin dışını temizleyin (Şekil 4H). Çok noktalı aracı kullanarak, tek tek çekirdeklere tıklayarak çekirdekleri sayın.
3. Hücresel nükleer alan ve şekil analizi
   1. Çekirdek alanı ve şekil analizi için, tdTomato epitel hücrelerinin orta (lateral) bölgesinin odakta olduğu yere karşılık gelen bir z-yığını konfokal görüntüden bir XY düzlemi görünümü optik kesitini analiz edin. Nükleer alanın en büyük olduğu konfokal bir görüntüden bir z-yığını dilimini analiz edin (Şekil 5A); Bu, çekirdeğin orta kısmını temsil eder.
      NOT: Merceğin eğriliği nedeniyle, XZ görünümünde görülebileceği gibi tüm çekirdeklerin odakta olmayacağını unutmayın (Şekil 4G ve Şekil 5A).
   2. Odakta olan bir çekirdek alt popülasyonu seçin ve bir yatırım getirisi kaydedin.
   3. Dışını Temizle işlevini kullanın. ROI içinde, Serbest El seçim aracını (soldan dördüncü menü düğmesi) kullanarak, çekirdeklerin sınırlarını dikkatlice izleyin (Şekil 5B). Ctrl+T tuşlarına basarak her nükleer izi ROI penceresine kaydedin. Yalnızca tüm çekirdeklerin görülebildiği ve çekirdeklerin birbirine değmediği ana hatları çizin.
   4. Tüm çekirdekler ana hatlarıyla belirtildikten sonra, Ctrl+M tuşlarına basarak tek tek hücrelerin nükleer alanını ve şeklini (yani daireselliğini) ölçün.
   5. Verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın ve ortalama nükleer alanı ve döngüselliği hesaplayın (Şekil 5C).
4. Meridional sıra epitelyal paketleme
   1. Meridyen sırası bozukluğunu ölçmek için 20x objektif (0,5 μm adım boyutu) kullanarak görüntüler elde edin.
   2. Görüntülerdeki lens dayanak noktasını/modiolusu tanımlayın. Dayanak noktası, uzayan epitel hücrelerinin apikal uçlarının, ekvatordaki ilk lif hücresi farklılaşması ve uzaması sırasında bir bağlantı noktası oluşturmak üzere daraldığı bölgedir. Dayanak noktasını parlak F-aktin yoğunluğuna ( Şekil 6A'da XZ görünümünde ok ucu ile gösterilir; Şekil 6B'de kırmızı kesikli çizgi ile gösterilir) ve XY görünümünde tek bir optik bölümde hücresel organizasyondaki değişikliğe göre tanımlayın.
      NOT: Ek olarak, epitel hücrelerinin hem bazal hem de apikal bölgelerinin F-aktin boyaması dayanak noktasının üzerinde belirgindir, oysa uzama hücrelerinin sadece bazal bölgesi dayanak noktasının altında belirgindir (Şekil 6A). Dayanak noktasının üzerindeki epitel hücreleri düzensiz bir şekilde paketlenir ve rozetler oluşturma eğilimindeyken, dayanak noktasının altındaki lif hücreleri, zarda parlak F-aktin boyaması ile gösterilen paralel sıralar halinde düzenlenir (Şekil 6B).
   3. 2 aylık farelerde dayanak noktası tanımlandıktan sonra, XY düzleminde dayanak noktasına (lens kapsülüne doğru) ~4.5-5 μm periferik tek optik bölümü seçin. Bu mesafe, 2 aylık farelerdeki meridyen sıra hücrelerinin tüm çekirdeklerinin, dayanak noktasına ~ 5 μm periferik olduklarında odakta olduğu gözlemine dayanarak seçilir. Tek optik bölümü (.tif) kaydedin. Resmi FIJI'de açın.
      NOT: Bu analiz sadece 2 aylık fareler üzerinde yapılmıştır ve bu nedenle bu mesafenin yaşla değişip değişmediği sonucuna varılamaz.
   4. Görüntü analizi gerçekleştirmeden önce, adım 2.2.2'yi kullanarak ImageJ'de ölçeği μm olarak ayarlayın.
   5. Şekil 7A'da gösterildiği gibi, nükleer hizalamayı tanımlayarak serbest çizgi aracını (ilgilenilen bölge/ ROI) kullanarak tüm meridyen sıra bölgelerini manuel olarak ana hatlarıyla belirtin. Ctrl+T tuşlarına basarak yatırım getirisinden tasarruf edin. Araç çubuğu menüsünde Düzenle'ye gidin ve Dışını Temizle'yi seçin. FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak toplam hücre alanını (ROI) ölçün.
   6. FIJI ImageJ'deki serbest çizgi aracını kullanarak ana hatlarını çizerek F-aktin boyama ile gösterilen herhangi bir bozukluk bölgesini tanımlayın. Düzensiz bölgeler için kriterler arasında satırların dallanması, düzensiz paketleme ve satırların yanlış hizalanması yer alır (Şekil 7B), daha önce^{gösterildiği gibi 20}.
   7. FIJI ImageJ'de Ctrl + M tuşlarına basarak özetlenen düzensiz alanı ölçün/yamalı. Bir elektronik tablodaki toplam düzensiz alanı toplayın.
   8. Toplam düzensiz alanı ROI alanına bölün, ardından yüzde düzensiz bir alan elde etmek için 100 ile çarpın. Herhangi bir bozukluk gözlenmezse, düzensiz bölge için %0 değerini koyun.
5. Komşu hücrelerin meridyen sıra sayısı
   1. Komşu hücrelerin sayısını ölçmek için, 40x yağ objektifi (0.4 μm adım boyutu) ile elde edilen F-aktin lekeli görüntüleri kullanın.
   2. Meridyen sıra hücrelerinin bazal bölgesinde, F-aktinin meridyen sıra hücrelerinin tüm çevresi boyunca zenginleştirildiği lens kapsülünden içe doğru bir optik kesit (XY düzlemi) tanımlayın, tüm meridyen sıra hücreleri odakta ve aynı düzlemdedir.
   3. Her meridyen sıra hücresinin sahip olduğu bitişik hücrelerin sayısını sayın (Şekil 8). Bir e-tabloda altı bitişik hücreye sahip hücrelerin ortalama yüzdesini ölçün.
      NOT: 20x objektife sahip bitişik hücrelerin sayısını belirleyin. Bununla birlikte, altıgen şeklini 40x objektifle gözlemlemek önemli ölçüde daha kolaydır.
6. Ekvatoral lif hücrelerinin görüntü analizi
   1. 20x objektif (0,5 μm adım boyutu) ile rodamin falloidin lekeli lenslerin z-stack konfokal görüntülerini alın.
   2. Dayanak noktasını adım 2.4.2'de belirtildiği gibi tanımlayın. Dayanak noktası tanımlandıktan sonra, tek bir optik bölüm seçin. Standardizasyon amacıyla ve lensler arasında karşılaştırma yapmak için, XY düzlemindeki dayanak noktasından ~10 μm içeriye doğru fiber hücre genişliklerini ölçün (Şekil 9A).
   3. Ham görüntüleri FIJI ImageJ'ye aktarın. FIJI ImageJ'de, F-aktin lekeli pikler arasındaki mesafeyi ölçmek için birkaç bitişik fiber hücre boyunca bir çizgi (genellikle ~ 300-400 μm uzunluğunda) çizin (çizgi tarama analizi; Şekil 9A; pembe çizgi).
   4. Ctrl+K tuşlarına basarak FIJI'de çizgi tarama mesafesi üzerinden floresan yoğunluğunu elde edin. Ardından, tepeler arası mesafeyi hesaplamak için verileri elektronik tabloya aktarın (örnek Şekil 9A-B'de gösterilmiştir). Bu, lif hücre genişliklerine karşılık gelir.

Sonuçlar

Ön lens kapsülü, epitel hücre alanı ve nükleer alan
Lens kapsülü kalınlığını analiz etmek için, canlı veya sabit lenslerdeki lens kapsüllerini WGA ile boyadık. Lens epitel hücrelerini, canlı lenslerde membranları tdTomato ile etiketleyerek (Şekil 2A) veya sabit lenslerde hücre membranlarında F-aktin için rodamin-phalloidin boyaması yoluyla tanımladık (Şekil 2B). Ortogonal (XZ) bir projeksiyonda, WGA ve tdTomato/rod...

Tartışmalar

Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R