Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Özet

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Özet

Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.

Giriş

Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonuna^{bağlanabilir} 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membran^olan kapsüldür ^7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ....

Protokol

Fareler, patojen içermeyen bir ortamda tutulan Delaware Üniversitesi hayvan tesisinde barındırılır. CO₂ inhalasyonu ile ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri, Delaware Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Tüm lens yuvası hazırlığı ve görüntüleme

1. Tüm montaj görüntüleme için lenslerin sabitlenmesi
   1. Ötenaziyi takiben, daha önce tarif edildiği gibi gözleri enüklee edin ve lensleri inceleyin²⁵. Diseksiyonu takiben, lensleri hemen oda sıcaklığında taze 1x fosf....

Tartışmalar

Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirm.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R