Imagerie à monture entière pour visualiser et quantifier la structure, la morphologie et l’organisation des lentilles périphériques

Résumé

Les protocoles actuels décrivent de nouvelles méthodes d’imagerie à monture entière pour la visualisation des structures périphériques du cristallin oculaire avec des méthodes de quantification d’image. Ces protocoles peuvent être utilisés dans le cadre d’études visant à mieux comprendre la relation entre les structures à l’échelle microscopique des lentilles et le développement/la fonction des lentilles.

Résumé

Le cristallin oculaire est un tissu transparent et flexible qui modifie sa forme pour focaliser la lumière à différentes distances sur la rétine. Mis à part une membrane basale entourant l’organe, appelée capsule, le cristallin est entièrement cellulaire composé d’une monocouche de cellules épithéliales sur l’hémisphère antérieur et d’une masse en vrac de cellules de fibres de cristallin. Tout au long de la vie, les cellules épithéliales prolifèrent dans la zone germinative à l’équateur du cristallin, et les cellules épithéliales équatoriales migrent, s’allongent et se différencient en cellules fibreuses nouvellement formées. Les cellules épithéliales équatoriales modifient considérablement la morphologie, passant de cellules en forme de galets emballées au hasard à des cellules alignées en forme d’hexagone formant des rangées méridiennes. Les cellules de fibres de lentilles nouvellement formées conservent la forme hexagonale des cellules et s’allongent vers les pôles antérieur et postérieur, formant une nouvelle coquille de cellules qui se superposent aux générations précédentes de fibres. On sait peu de choses sur les mécanismes qui conduisent à la remarquable morphogenèse des cellules épithéliales du cristallin en cellules fibreuses. Pour mieux comprendre la structure, le développement et la fonction des lentilles, de nouveaux protocoles d’imagerie ont été développés pour imager les structures périphériques à l’aide de montures entières de lentilles oculaires. Ici, les méthodes permettant de quantifier l’épaisseur de la capsule, la surface des cellules épithéliales, la zone et la forme du noyau cellulaire, l’ordre et l’emballage des cellules de la rangée méridionale et la largeur des cellules des fibres sont présentées. Ces mesures sont essentielles pour élucider les changements cellulaires qui se produisent au cours de la croissance du cristallin tout au long de la vie et comprendre les changements qui se produisent avec l’âge ou la pathologie.

Introduction

Le cristallin oculaire est un tissu flexible et transparent situé dans la région antérieure de l’œil qui a pour fonction de focaliser finement la lumière sur la rétine. La capacité de l’objectif à fonctionner peut être attribuée, en partie, à son architecture complexe et à son organisation 1,2,3,4,5,6. Autour du tissu du cristallin se trouve la capsule, une membrane basale essentielle au maintien de la structure du cristallin et des propriétés biomé....

Protocole

Les souris sont hébergées dans l’animalerie de l’Université du Delaware, maintenue dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Toutes les procédures sur les animaux, y compris l’euthanasie par inhalation de CO₂ , ont été effectuées conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware.

1. Préparation et imagerie de l’ensemble de la monture d’objectif

1. Fixation d’objectifs pour l’imagerie de l’ensemble de la monture
   1. Après l’euthanasie, énucléer les yeux et disséquer les lentilles comme ....

Discussion

Les protocoles décrits permettent une visualisation à haute résolution spatiale des structures et des cellules périphériques du cristallin dans les régions antérieures et équatoriales du cristallin. Dans cette étude, des méthodes de visualisation des structures périphériques des lentilles à l’aide de lentilles intactes (vivantes ou fixes) où l’architecture globale des lentilles 3D est préservée ont été présentées. De plus, des méthodes simples d’analyse morphométrique quantitative à l’aide .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R