Imagerie à monture entière pour visualiser et quantifier la structure, la morphologie et l’organisation des lentilles périphériques

Résumé

Les protocoles actuels décrivent de nouvelles méthodes d’imagerie à monture entière pour la visualisation des structures périphériques du cristallin oculaire avec des méthodes de quantification d’image. Ces protocoles peuvent être utilisés dans le cadre d’études visant à mieux comprendre la relation entre les structures à l’échelle microscopique des lentilles et le développement/la fonction des lentilles.

Résumé

Le cristallin oculaire est un tissu transparent et flexible qui modifie sa forme pour focaliser la lumière à différentes distances sur la rétine. Mis à part une membrane basale entourant l’organe, appelée capsule, le cristallin est entièrement cellulaire composé d’une monocouche de cellules épithéliales sur l’hémisphère antérieur et d’une masse en vrac de cellules de fibres de cristallin. Tout au long de la vie, les cellules épithéliales prolifèrent dans la zone germinative à l’équateur du cristallin, et les cellules épithéliales équatoriales migrent, s’allongent et se différencient en cellules fibreuses nouvellement formées. Les cellules épithéliales équatoriales modifient considérablement la morphologie, passant de cellules en forme de galets emballées au hasard à des cellules alignées en forme d’hexagone formant des rangées méridiennes. Les cellules de fibres de lentilles nouvellement formées conservent la forme hexagonale des cellules et s’allongent vers les pôles antérieur et postérieur, formant une nouvelle coquille de cellules qui se superposent aux générations précédentes de fibres. On sait peu de choses sur les mécanismes qui conduisent à la remarquable morphogenèse des cellules épithéliales du cristallin en cellules fibreuses. Pour mieux comprendre la structure, le développement et la fonction des lentilles, de nouveaux protocoles d’imagerie ont été développés pour imager les structures périphériques à l’aide de montures entières de lentilles oculaires. Ici, les méthodes permettant de quantifier l’épaisseur de la capsule, la surface des cellules épithéliales, la zone et la forme du noyau cellulaire, l’ordre et l’emballage des cellules de la rangée méridionale et la largeur des cellules des fibres sont présentées. Ces mesures sont essentielles pour élucider les changements cellulaires qui se produisent au cours de la croissance du cristallin tout au long de la vie et comprendre les changements qui se produisent avec l’âge ou la pathologie.

Introduction

Le cristallin oculaire est un tissu flexible et transparent situé dans la région antérieure de l’œil qui a pour fonction de focaliser finement la lumière sur la rétine. La capacité de l’objectif à fonctionner peut être attribuée, en partie, à son architecture complexe et à son organisation 1,2,3,4,5,6. Autour du tissu du cristallin se trouve la capsule, une membrane basale essentielle au maintien de la structure du cristallin et des propriétés biomécaniques ^7,8,9. Le cristallin lui-même est entièrement cellulaire, composé de deux types de cellules : les cellules épithéliales et les cellules fibreuses. La couche épithéliale est constituée d’une monocouche de cellules cuboïdes qui recouvrent l’hémisphère antérieur du cristallin¹⁰. Tout au long de la vie, les cellules épithéliales prolifèrent et migrent le long de la capsule du cristallin vers l’équateur du cristallin. Les cellules épithéliales antérieures sont au repos et en forme de galets en coupe transversale, et près de l’équateur du cristallin, les cellules épithéliales prolifèrent et commencent à subir le processus de différenciation en nouvelles cellules fibreuses^11,12. Les cellules épithéliales équatoriales se transforment de cellules emballées au hasard en rangées méridiennes organisées avec des cellules en forme d’hexagone. La forme hexagonale des cellules est maintenue sur la face basale de ces cellules de différenciation tandis que la face apicale se contracte et s’ancre au point d’appui du cristallin ou modiolus ^4,13,14,15. Au fur et à mesure que les cellules épithéliales équatoriales commencent à s’allonger en cellules fibreuses nouvellement formées, les extrémités apicales des cellules migrent le long de la surface apicale des cellules épithéliales antérieures vers le pôle antérieur tandis que les extrémités basales se déplacent le long de la capsule du cristallin vers le pôle postérieur. Les nouvelles générations de cellules fibreuses se superposent aux générations précédentes de cellules, créant des coquilles sphériques de fibres. Au cours du processus d’élongation et de maturation des cellules, les cellules fibreuses modifient considérablement leur morphologie 11,12,16. Ces cellules fibreuses forment la majeure partie de la masse de la lentille 11,12,16,17,18.

Les mécanismes moléculaires qui contribuent à l’établissement de microstructures complexes du cristallin, de la morphologie cellulaire et de l’organisation cellulaire unique ne sont pas entièrement connus. De plus, la contribution de la capsule du cristallin et de la structure cellulaire à la fonction globale du cristallin (transparence, changement de forme du cristallin) n’est pas claire. Cependant, ces relations sont élucidées à l’aide d’une nouvelle méthodologie d’imagerie et d’évaluations quantitatives des caractéristiques structurelles et cellulaires du cristallin 2,4,19,20,21,22. De nouveaux protocoles d’imagerie de lentilles entières permettant une visualisation à haute résolution spatiale de la capsule du cristallin, des cellules épithéliales et des cellules de fibres périphériques ont été développés. Cela inclut une méthodologie pour quantifier l’épaisseur de la capsule, la taille des cellules, la taille et la circularité du noyau cellulaire, l’ordre des rangées méridionales, l’emballage des cellules fibreuses et la largeur des cellules fibreuses. Ces méthodes de visualisation et de quantification d’images permettent un examen morphométrique approfondi et présentent des avantages par rapport à d’autres méthodes de visualisation (imagerie de montages plats ou de coupes de tissus) en préservant la structure tissulaire 3D globale. Ces méthodes ont permis de tester de nouvelles hypothèses et permettront de continuer à faire progresser la compréhension du développement et de la fonction des cellules du cristallin.

Pour les expériences suivantes, nous utilisons des souris de type sauvage et Rosa26-tdTomato tandem dimère-Tomate (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) dans le fond C57BL/6J entre l’âge de 6 et 10 semaines, des deux sexes. Les souris tdTomato permettent de visualiser les membranes plasmiques cellulaires dans des lentilles vivantes via l’expression de la protéine tdTomato fusionnée aux 8 acides aminés N-terminaux d’une protéine MARCKS mutée qui cible la membrane plasmique via la myristylation N-terminale et les sites internes de cystéine-palmitoylation²³. Nous utilisons également des souris NMIIA^{E1841K/E1841K 24} obtenues à l’origine auprès du Dr Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Comme décrit précédemment²⁰, les souris NMIIA^{E1841K/E1841K} dans un fond FvBN/129SvEv/C57Bl6 qui ont perdu la protéine de filament intermédiaire perlé CP49 (maintient la morphologie des cellules fibreuses matures et la biomécanique du cristallin entier), sont rétrocroisées avec des souris de type sauvage C57BL6/J. Nous avons dépisté la progéniture pour détecter la présence de l’allèle CP49 de type sauvage.

L’imagerie confocale a été réalisée sur un microscope confocal à fluorescence à balayage laser avec un grossissement de 20x (NA = 0,8, distance de travail = 0,55 mm, zoom 1x), de 40x (NA = objectif d’huile de 1,3, distance de travail = 0,2 mm, zoom 1x) ou de 63x (NA = objectif d’huile de 1,4, distance de travail = 0,19 mm, zoom 1x). Toutes les images ont été acquises à l’aide d’une taille de trou d’épingle, qui est un déterminant de l’épaisseur de la section optique, à 1 unité d’Airy (les épaisseurs optiques résultantes sont indiquées dans les légendes des figures). Les images ont été traitées sur Zen Software. Les images ont été exportées au format .tif, puis importées dans FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Protocole

Les souris sont hébergées dans l’animalerie de l’Université du Delaware, maintenue dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Toutes les procédures sur les animaux, y compris l’euthanasie par inhalation de CO₂ , ont été effectuées conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware.

1. Préparation et imagerie de l’ensemble de la monture d’objectif

1. Fixation d’objectifs pour l’imagerie de l’ensemble de la monture
   1. Après l’euthanasie, énucléer les yeux et disséquer les lentilles comme décrit précédemment²⁵. Après la dissection, transférer immédiatement les lentilles dans une solution saline fraîche tamponnée au phosphate 1x (PBS ; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO 4-7H ₂O ; pH 7,4) à température ambiante.
      REMARQUE : La morphologie cellulaire peut être modifiée si les lentilles sont stockées dans le PBS pendant une période prolongée, par conséquent, il est recommandé de les fixer immédiatement dans les ~ 10 minutes suivant la dissection.
   2. Pour l’imagerie de la région antérieure du cristallin sur toute la monture, fixez les lentilles entières en les immergeant dans 0,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % fraîchement fabriqué dans 1x PBS dans un tube de microcentrifugation à température ambiante. Après 30 min, lavez les lentilles 3x (5 min par lavage) avec 1x PBS. Passez à l’étape 1.2 ou conservez-le dans 1x PBS à 4 °C. Les lentilles fixes peuvent être conservées jusqu’à 5 jours.
   3. Pour l’imagerie de la région équatoriale de la lentille à monture entière, fixez les lentilles entières en les immergeant dans 0,5 mL de PFA à 4 % fraîchement fabriqué dans 1x PBS dans un tube de microcentrifugation à température ambiante. Après 1 h, laver les lentilles 3x (5 min par lavage) avec 1x PBS. Passez à l’étape 1.3 ou conservez-le dans 1x PBS à 4 °C. Les lentilles fixes peuvent être conservées jusqu’à 5 jours.
2. Monture entière de la région antérieure du cristallin (fixe ou sous tension)
   1. Pour l’imagerie à monture complète d’objectifs fixes, passez à l’étape 1.2.3.
   2. Pour l’imagerie à monture complète de lentilles vivantes, transférez les lentilles dans un puits d’une plaque à 48 puits contenant 1 mL de Medium 199 (sans rouge phénolique) contenant 1 % d’antibiotique/antimycosique. Incuber les lentilles à 37 °C et à 5 % de CO₂ jusqu’à l’imagerie. Avant l’imagerie, incuber les lentilles dans une solution contenant de l’agglutinine de germe de blé (WGA-640, 1 :500) et du Hoechst 33342 (1 :500) marqués par fluorescence dans un milieu 199 pendant au moins 10 minutes. Passez à l’étape 1.5.
   3. Pour colorer la capsule du cristallin, la F-actine et les noyaux des lentilles fixes, placer les lentilles dans une solution de 500 μL contenant du WGA-640 (1 :500), de la rhodamine-phalloïdine (1 :50) et du Hoechst 33342 (1 :500) dans un tampon de perméabilisation/blocage (1x PBS contenant 0,3 % de Triton, 0,3 % d’albumine sérique bovine (fraction V) et 3 % de sérum de chèvre) dans un tube de microcentrifugation. Teindre les lentilles à 4 °C pendant la nuit.
   4. Après une nuit d’incubation, lavez les lentilles 3 fois (5 min par lavage) avec 1 ml de PBS 1x. Passez à l’imagerie des lentilles.
   5. Pour stabiliser la lentille fixe pour l’imagerie confocale, créer des mottes d’immobilisation de lentille dans l’agarose sur une parabole d’imagerie comme décrit précédemment²¹ (Figure 1).
      1. Chauffer et mélanger doucement l’agarose à 2 % dans le PBS à l’aide d’un micro-ondes jusqu’à ce que la solution soit liquéfiée. Pipeter 250 μL d’agarose liquéfiée à 2 % dans une boîte à fond en verre (figure 1A) et aplatir l’agarose sur la boîte à l’aide d’une lamelle en plastique souple (figure 1B). Une fois l’agarose refroidie et complètement solidifiée, retirez la lamelle à l’aide d’une pince à pointe fine (Figure 1C) et utilisez un poinçon de biopsie de 3 mm pour créer un trou dans l’agarose au centre de la boîte (Figure 1D).
      2. Retirez l’excès d’agarose à l’aide d’une lingette délicate (Figure 1E). Garder la moisissure d’agarose hydratée avec 1x PBS et maintenir à 4 °C jusqu’à utilisation. Les moisissures d’agarose ont été stockées avec succès jusqu’à 1 semaine.
   6. À l’aide d’une pince à embryons, transférez délicatement la lentille vivante ou fixe dans le divot de l’agarose (Figure 1F), contenant ~2 mL de PBS 1x (lentille fixe) ou de Medium 199 sans rouge phénolique (lentille vivante), puis placez la boîte sur une platine de microscope inversée. Pour confirmer que le cristallin est situé avec la région antérieure face à l’objectif, visualisez la coloration des noyaux. Si aucun noyau n’est observé, la région postérieure peut être orientée vers l’objectif.
   7. Pour inverser la lentille, utilisez une pince incurvée et faites pivoter doucement la lentille de ~180° de manière à ce que la région antérieure fasse face à l’objectif. Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal.
   8. Pour la visualisation des capsules d’objectif, acquérez des images z-stack à l’aide d’un objectif 40x avec une taille de pas de 0,3 μm. Acquérir la première image avant la surface de la capsule du cristallin (indiquée par la coloration WGA) et la dernière image après la surface apicale des cellules épithéliales. Pour visualiser les cellules épithéliales, acquérez des images z-stack à l’aide d’un objectif 63x avec une taille de pas de 0,3 μm pour la visualisation des cellules épithéliales du cristallin.
      REMARQUE : Ces paramètres de microscope permettent une reconstruction tridimensionnelle (3D) adéquate des images, ce qui est essentiel pour la quantification de l’épaisseur de la capsule ou de la zone des cellules épithéliales. Il est également possible d’imager des sutures dans des lentilles vivantes tdTomato en imageant au-delà de la monocouche de cellules épithéliales, comme décrit précédemment⁴.
3. Coloration de l’épithélium équatorial du cristallin et des cellules fibreuses
   1. Placer les lentilles fixes dans une solution de 0,5 mL de rhodamine-phalloïdine (1 :300), WGA-640 (1 :250) et Hoechst 33342 (1 :500) dans une solution de perméabilisation/blocage (3 % de BSA, 3 % de sérum de chèvre et 0,3 % de Triton) dans un tube de microcentrifugation. Maintenir à 4 °C toute la nuit.
   2. Après une nuit d’incubation, laver les lentilles 3 fois dans 1 ml 1 PBS (5 min par lavage).
   3. Créer des coins d’agarose d’immobilisation de lentille comme décrit précédemment ^4,10.
      1. En bref, créez des quartiers d’agarose dans des plats à fond de verre (FD35-100, WPI) en versant ~5-6 mL d’agarose fondue à 2 % dans 1x PBS dans des plats (Figure 2A). Une fois que l’agarose s’est solidifiée (figure 2B), créer un divot triangulaire avec une lame tranchante (figure 2C). Retirez le quartier d’agarose et placez 1 mL de PBS 1x dans le plat d’agarose (Figure 2D).
      2. Aspirez toute agarose résiduelle qui pourrait être laissée par la coupe de l’agarose. Plusieurs cales peuvent être créées par parabole pour s’adapter à plusieurs tailles différentes de lentilles (non illustrées). Pour conserver le moule à agarose, placez 1mL de 1x PBS sur le moule à agarose et conservez à 4 °C. Les cales peuvent être conservées jusqu’à 1 semaine.
   4. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, placez la lentille dans un coin d’agarose contenant 1 ml de PBS 1x et ajustez-la de manière à ce que la région équatoriale de la lentille soit orientée vers le bas sur la vitre du microscope au-dessus de l’objectif confocal (Figure 2E-F). Pour confirmer que la région équatoriale est nette, visualisez les noyaux et assurez-vous que les noyaux sont alignés en rangées à l’équateur. Les cellules épithéliales équatoriales peuvent également être identifiées car elles sont irrégulièrement emballées et de forme. De plus, les cellules méridionales sont alignées avec précision et de forme hexagonale, ce qui est indiqué par la coloration de la F-actine au niveau des membranes cellulaires.
   5. Si les noyaux dans le champ de vision sont regroupés de manière aléatoire, la face antérieure du cristallin fait face à l’objectif. Si les noyaux ne peuvent pas être observés, la face postérieure du cristallin est très probablement tournée vers l’objectif. Si la lentille n’est pas assise sur son équateur, réorientez-la et utilisez la pince à épiler incurvée pour faire pivoter la lentille jusqu’à ce que les noyaux précisément alignés à l’équateur de la lentille soient observés.
   6. Imagez l’épithélium équatorial et les cellules fibreuses du cristallin à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (objectif 20x, NA = 0,8, taille de pas 0,5 μm et/ou objectif d’huile 40x, NA = 1,3, taille de pas 0,4 μm). Faites pivoter les images avant la collecte z-stack, dans laquelle les cellules épithéliales équatoriales se trouvent en haut, suivies des cellules de la rangée méridionale et des fibres juste en dessous.

2. Méthodologie d’analyse d’images

1. Mesure de l’épaisseur de la capsule de lentille
   1. À l’aide d’images z-stack obtenues avec un objectif 40x (pas de 0,3 μm) de lentilles tdTomato vivantes marquées WGA ou de lentilles fixes marquées WGA et rho-phalloïdine, obtenez une projection optique 2D dans la vue XZ de la reconstruction 3D et enregistrez-la au format .tif. Traitez les images à l’aide du logiciel Zen.
   2. Ouvrez les images de tranche XZ (.tif) dans le logiciel FIJI ImageJ.
   3. Pour mesurer l’épaisseur de la capsule de la lentille, utilisez la fonction de ligne droite (illustrée à la Figure 3A,B). Définissez la largeur de ligne sur 50 pixels en sélectionnant Modifier > Options > Largeur de ligne. Cette largeur de raie a été déterminée empiriquement pour fournir un rapport signal/bruit élevé avec les réglages du microscope. La largeur de trait optimale peut différer selon d’autres microscopes/réglages de microscope ou lors de l’utilisation de lentilles d’autres espèces. Ensuite, tracez une ligne de la surface supérieure de la capsule jusqu’en dessous de la région basale des cellules épithéliales.
   4. Enregistrez la ligne en tant que région d’intérêt en appuyant sur Ctrl + T.
   5. Séparez les couches en onglets pour l’image, la couleur et les couches fractionnées.
   6. Mesurez l’intensité le long de la ligne pour le canal de la capsule en appuyant sur Ctrl + K.
   7. Dans une feuille de calcul, tracez les valeurs d’intensité en fonction de la distance et déterminez les pics d’intensité de la capsule et de la F-actine, qui représentent respectivement la surface de la capsule et la région basale des cellules épithéliales. Sur l’axe des abscisses se trouve la distance de la ligne.
   8. Ensuite, calculez l’épaisseur de la capsule en déterminant la distance entre les pics d’intensité fluorescente de la capsule et de l’épithélium (Figure 3C, D).
2. Analyse de la surface cellulaire
   1. À l’aide d’images z-stack obtenues à l’aide d’un objectif 63x (NA = 1,4 ; pas de 0,3 μm) sur des lentilles tdTomato vivantes ou des lentilles fixes marquées à la phalloïdine, analysez une tranche de vue XY à partir d’une image confocale z-stack correspondant à l’endroit où la région médiane (latérale) des cellules épithéliales est mise au point. Notez que les membranes latérales sont visibles à l’aide du colorant membranaire tdTomato ou en visualisant la phalloïdine qui est présente au niveau des membranes cellulaires latérales.
      REMARQUE : En raison de la courbure de l’objectif (comme on le voit dans une vue XZ ; Figure 4A-C), toutes les cellules épithéliales ne seront pas nettes dans l’image. La région médiane de l’épithélium correspond à la région où les membranes latérales cellulaires (Figure 4D-E) et les noyaux (Figure 4G-I) sont focalisés.
   2. Exportez l’image au format .tif et ouvrez-la dans FIJI ImageJ.
   3. Pour définir l’échelle dans FIJI ImageJ à des fins d’analyse, utilisez l’outil Ligne pour créer une ligne de la longueur d’une barre d’échelle à partir de l’image confocale.
   4. Enregistrez la longueur en pixels de la ligne et la longueur de la barre d’échelle. Accédez à Analyser dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Définir l’échelle. Entrez le nombre de pixels, c’est-à-dire la longueur de la ligne, dans Distance en pixels, et entrez la longueur connue de la barre d’échelle.
   5. À l’aide de la coloration tdTomato ou rhodamine-phalloïdine comme indication des limites cellulaires, tracez manuellement une population de cellules qui sont nettes dans l’image à l’aide de l’outil polygonal. Ne tracez que les cellules dont les membranes latérales sont visibles (figure 4E) et évitez de tracer des cellules partiellement visibles (c’est-à-dire sur le bord des images). Enregistrez le retour sur investissement en appuyant sur Ctrl+T. Accédez à Modifier dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Effacer l’extérieur. Mesurez maintenant la surface totale de la cellule (ROI) en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ.
   6. Calculez la surface moyenne de la cellule en divisant la zone ROI par le nombre total de cellules. Un moyen simple de déterminer le nombre de cellules est de compter le nombre de noyaux. Allez dans le canal des noyaux (bleu). Dans le menu ROI, sélectionnez le contour des cellules ROI enregistré (Figure 4G). Effacer en dehors du retour sur investissement en accédant à Modifier, puis en cliquant sur Effacer à l’extérieur (Figure 4H). À l’aide de l’outil Multipoint, comptez les noyaux en cliquant sur les noyaux individuels.
3. Analyse de la zone et de la forme du noyau cellulaire
   1. Pour l’analyse de la surface et de la forme des noyaux, analysez une coupe optique vue du plan XY à partir d’une image confocale z-stack correspondant à l’endroit où la région médiane (latérale) des cellules épithéliales tdTomato est mise au point. Analyser une tranche de pile z à partir d’une image confocale où la zone nucléaire est la plus grande (Figure 5A) ; Cela représente la partie médiane des noyaux.
      REMARQUE : Notez qu’en raison de la courbure de la lentille, tous les noyaux ne seront pas nets, comme on peut le voir dans la vue XZ (Figure 4G et Figure 5A).
   2. Sélectionnez une sous-population de noyaux qui sont ciblés et économisez un retour sur investissement.
   3. Utilisez la fonction Effacer l’extérieur . À l’intérieur du ROI, à l’aide de l’outil de sélection à main levée (quatrième bouton de menu à partir de la gauche), tracez soigneusement les bords des noyaux (Figure 5B). Enregistrez chaque trace nucléaire dans la fenêtre ROI en appuyant sur Ctrl+T. Ne tracez que les noyaux où les noyaux complets peuvent être vus et où les noyaux ne se touchent pas.
   4. Une fois que tous les noyaux sont délimités, mesurez la surface et la forme nucléaires des cellules individuelles (c’est-à-dire la circularité) en appuyant sur Ctrl+M.
   5. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul et calculez la superficie nucléaire moyenne et la circularité (Figure 5C).
4. Garniture épithéliale méridionale
   1. Pour mesurer le désordre méridional des rangs, acquérez des images à l’aide d’un objectif 20x (pas de 0,5 μm).
   2. Identifiez le point d’appui de l’objectif/modiolus sur les images. Le point d’appui est la région où les extrémités apicales des cellules épithéliales allongées se contractent pour former un point d’ancrage lors de la différenciation initiale des cellules fibreuses et de l’élongation à l’équateur. Identifiez le point d’appui en fonction de l’intensité brillante de la F-actine (indiquée par une pointe de flèche dans la vue XZ de la figure 6A ; indiquée par une ligne pointillée rouge dans la figure 6B) et du changement d’organisation cellulaire dans une seule coupe optique dans la vue XY.
      NOTE : De plus, la coloration F-actine des régions basale et apicale des cellules épithéliales est apparente au-dessus du point d’appui, alors que seule la région basale des cellules allongées est apparente au-dessous du point d’appui (Figure 6A). Les cellules épithéliales au-dessus de la ligne d’appui sont irrégulièrement tassées et ont tendance à former des rosettes, tandis que les cellules fibreuses situées sous le point d’appui sont disposées en rangées parallèles, ce qui est indiqué par une coloration brillante de la F-actine au niveau de la membrane (Figure 6B).
   3. Une fois que le point d’appui est identifié chez les souris âgées de 2 mois, sélectionnez la section optique unique ~4,5-5 μm périphérique au point d’appui (vers la capsule du cristallin) dans le plan XY. Cette distance est choisie sur la base de l’observation que tous les noyaux des cellules méridionales de la rangée chez les souris âgées de 2 mois sont focalisés lorsqu’ils sont périphériques à ~5 μm du point d’appui. Enregistrez la section optique unique (.tif). Ouvrez l’image sur FIJI.
      REMARQUE : Cette analyse n’a été effectuée que sur des souris âgées de 2 mois et, par conséquent, il n’est pas possible de conclure si cette distance change avec l’âge.
   4. Avant d’effectuer l’analyse d’image, définissez l’échelle sur μm dans ImageJ à l’aide de l’étape 2.2.2.
   5. Délimitez manuellement l’ensemble des régions de la ligne méridionale à l’aide de l’outil de ligne à main levée (région d’intérêt/ROI) en identifiant l’alignement nucléaire, comme le montre la figure 7A. Enregistrez le retour sur investissement en appuyant sur Ctrl+T. Accédez à Modifier dans le menu de la barre d’outils et sélectionnez Effacer l’extérieur. Mesurez la surface totale de la cellule (ROI) en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ.
   6. Identifiez toutes les régions de désordre indiquées par la coloration de l’actine F en décrivant à l’aide de l’outil de ligne à main levée dans FIJI ImageJ. Les critères pour les régions désordonnées comprennent la ramification des rangs, l’empilement irrégulier et le désalignement des rangs (figure 7B), comme indiqué précédemment²⁰.
   7. Mesurez la zone désordonnée délimitée/corrigée en appuyant sur Ctrl + M dans FIJI ImageJ. Additionnez la surface totale désordonnée dans une feuille de calcul.
   8. Divisez la surface désordonnée totale par la zone ROI, puis multipliez par 100 pour obtenir un pourcentage de surface désordonnée. Si aucun trouble n’est observé, placez une valeur de 0 % pour la zone désordonnée.
5. Nombre de rangées méridionales des cellules voisines
   1. Pour mesurer le nombre de cellules voisines, utilisez des images colorées à la F-actine acquises avec un objectif d’huile 40x (pas de 0,4 μm).
   2. Identifiez une coupe optique (plan XY) dans la région basale des cellules de la rangée méridionale vers l’intérieur de la capsule du cristallin où la F-actine est enrichie sur tout le périmètre des cellules de la rangée méridionale, toutes les cellules de la rangée méridienne sont focalisées et sont sur le même plan.
   3. Comptez le nombre de cellules adjacentes à chaque cellule de rangée méridionale (Figure 8). Mesurez le pourcentage moyen de cellules avec six cellules adjacentes dans une feuille de calcul.
      REMARQUE : Déterminez le nombre de cellules adjacentes avec un objectif 20x. Cependant, il est beaucoup plus facile d’observer la forme hexagonale avec un objectif 40x.
6. Analyse d’images de cellules de fibres équatoriales
   1. Prenez des images confococaux z-stack de lentilles colorées à la phalloïdine rhodamine avec un objectif 20x (pas de 0,5 μm).
   2. Identifiez le point d’appui comme indiqué à l’étape 2.4.2. Une fois le point d’appui identifié, sélectionnez une seule section optique. À des fins de normalisation et de comparaison entre les lentilles, quantifiez les largeurs des cellules de fibres de ~10 μm vers l’intérieur à partir du point d’appui dans le plan XY (Figure 9A).
   3. Exportez des images brutes vers FIJI ImageJ. Dans FIJI ImageJ, tracez une ligne (généralement de ~300 à 400 μm de long) à travers plusieurs cellules fibreuses adjacentes pour mesurer la distance entre les pics colorés par l’actine F (analyse par balayage linéaire ; Graphique 9A ; ligne rose).
   4. Obtenez l’intensité fluorescente sur la distance de balayage linéaire en FIDJI en appuyant sur Ctrl+K. Ensuite, exportez les données dans la feuille de calcul pour calculer la distance entre les pics (exemple illustré à la figure 9A-B). Cela correspond à la largeur des cellules de fibres.

Résultats

Capsule antérieure du cristallin, zone des cellules épithéliales et zone nucléaire
Pour analyser l’épaisseur de la capsule de lentille, nous avons coloré des capsules de lentilles, en lentilles vivantes ou fixes, avec WGA. Nous avons identifié les cellules épithéliales du cristallin en marquant les membranes avec tdTomato dans les lentilles vivantes (Figure 2A), ou par coloration à la rhodamine-phalloïdine pour la F-actine au niveau des membranes cellulaires ...

Discussion

Les protocoles décrits permettent une visualisation à haute résolution spatiale des structures et des cellules périphériques du cristallin dans les régions antérieures et équatoriales du cristallin. Dans cette étude, des méthodes de visualisation des structures périphériques des lentilles à l’aide de lentilles intactes (vivantes ou fixes) où l’architecture globale des lentilles 3D est préservée ont été présentées. De plus, des méthodes simples d’analyse morphométrique quantitative à l’aide ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R