末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

要約

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。

要約

眼球レンズは透明で柔軟な組織で、その形状を変化させてさまざまな距離からの光を網膜に集束させます。水晶体は、被膜と呼ばれる器官を取り囲む基底膜を除けば、前半球の上皮細胞の単層と水晶体線維細胞の塊からなる完全な細胞である。上皮細胞は生涯を通じて水晶体赤道の発芽帯で増殖し、赤道上皮細胞は遊走、伸長、分化して新たに形成された線維細胞になります。赤道上皮細胞は、ランダムに詰め込まれた丸石型の細胞から、子午線列を形成する整列した六角形の細胞に形態を実質的に変化させます。新たに形成されたレンズ線維細胞は、六角形の細胞形状を保持し、前極および後極に向かって伸び、前世代の線維に重ねられた細胞の新しいシェルを形成します。水晶体上皮細胞から線維細胞への顕著な形態形成を促進するメカニズムについてはほとんど知られていません。レンズの構造、発達、機能をよりよく理解するために、接眼レンズのマウント全体を使用して末梢構造を画像化する新しいイメージングプロトコルが開発されました。ここでは、カプセルの厚さ、上皮細胞面積、細胞核面積と形状、子午線列細胞の順序と充填、および繊維細胞幅を定量する方法を示します。これらの測定は、生涯にわたる水晶体の成長中に発生する細胞の変化を解明し、加齢や病態によって発生する変化を理解するために不可欠です。

概要

眼水晶体は、眼の前部に位置する柔軟で透明な組織で、網膜に光を細かく合わせる役割を果たします。レンズが機能する能力は、部分的には、その複雑なアーキテクチャと構成に起因する可能性があります1,2,3,4,5,6。水晶体組織を取り囲むのは、水晶体構造と生体力学的特性を維持するために不可欠な基底膜であるカプセルです^7,8,9。水晶体自体は完全に細胞状で、上皮細胞と繊維細胞の2種類の細胞で構成されています。上皮層は、レンズ¹⁰の前半球を覆う直方体細胞の単層からなる。生涯を通じて、上皮細胞は増殖し、水晶体嚢に沿って水晶体赤道に向かって移動します。前上皮細胞は断面が静止し、丸石であり、水晶体赤道付近では上皮細胞が増殖し、新しい線維細胞への分化過程を経始める^11,12....

プロトコル

マウスはデラウェア大学の動物施設に収容され、病原体のない環境で維持されています。CO2吸入による安楽死を含むすべての動物処置は、デラウェア大学動物実験委員会(IACUC)によって承認された動物プロトコルに従って実施されました。

1.レンズマウント全体の準備とイメージング

1. ホールマウントイメージング用レンズの固定
   1. 安楽死後、前述のように眼球を摘出し、水晶体を解剖する²⁵。解剖後、レンズを室温で新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS;1.1 mM_KH2PO₄、155 mM、NaCl、3.0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O;pH 7.4)に直ちに移します。
      注:レンズをPBSに長期間保存すると細胞形態が変化する可能性があるため、解剖後~10分以内にすぐに修正することをお勧めします。
   2. 水晶体前部のホールマウントイメージングでは、作製したばかりの4%パラホルムアルデヒド(PFA)0.5 mLを1x PBS中の微量遠心チューブに室温で浸漬してレンズ全体を固定します。30分後、レンズを1x PBSで3回(1回の洗浄で5分)洗浄します。ステップ1.2に進むか、1x PBSで4°Cで保存します。 固定レンズは最大5日間保....

ディスカッション

記載されているプロトコルは、水晶体の前方および赤道領域における周辺レンズ構造および細胞の高空間分解能の視覚化を可能にします。本研究では、3次元レンズ全体の構造が保たれたインタクトレンズ(ライブレンズまたは固定レンズ)を用いて、レンズ周辺構造を可視化する手法を示した。さらに、一般に公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用した形態測定定量分析の簡単な方法も?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R