Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

Resumen

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Resumen

El cristalino ocular es un tejido transparente y flexible que altera su forma para enfocar la luz desde diferentes distancias en la retina. Aparte de una membrana basal que rodea el órgano, llamada cápsula, el cristalino es completamente celular y consiste en una monocapa de células epiteliales en el hemisferio anterior y una masa masiva de células de fibra del cristalino. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan en la zona germinativa en el ecuador del cristalino, y las células epiteliales ecuatoriales migran, se alargan y se diferencian en células de fibra recién formadas. Las células epiteliales ecuatoriales alteran sustancialmente la morfología de células empaquetadas al azar en forma de adoquín a células alineadas en forma de hexágono que forman filas meridionales. Las células de fibra del cristalino recién formadas conservan la forma de célula hexagonal y se alargan hacia los polos anterior y posterior, formando una nueva capa de células que se superponen a las generaciones anteriores de fibras. Poco se sabe sobre los mecanismos que conducen a la notable morfogénesis de las células epiteliales del cristalino a las células fibra. Para comprender mejor la estructura, el desarrollo y la función de las lentes, se han desarrollado nuevos protocolos de obtención de imágenes para obtener imágenes de estructuras periféricas utilizando monturas completas de lentes oculares. Aquí, se muestran métodos para cuantificar el grosor de la cápsula, el área de las células epiteliales, el área y la forma del núcleo de la célula, el orden y el empaquetamiento de las células de la fila meridional y el ancho de las células de las fibras. Estas mediciones son esenciales para dilucidar los cambios celulares que ocurren durante el crecimiento del cristalino a lo largo de la vida y comprender los cambios que ocurren con la edad o la patología.

Introducción

El cristalino ocular es un tejido flexible y transparente situado en la región anterior del ojo que funciona para enfocar la luz en la retina. La capacidad de funcionamiento de la lente se puede atribuir, en parte, a su intrincada arquitectura y organización 1,2,3,4,5,6. Alrededor del tejido del cristalino se encuentra la cápsula, una membrana basal esencial para mantener la estructura del cristalino y las propiedades biomecánicas ^7,8,9. El cristalino en sí es completamente celular, y consta de dos tipos de células: epiteliales y fibrosas. La capa epitelial está formada por una monocapa de células cuboidales que recubren el hemisferio anterior del cristalino¹⁰. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan y migran a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el ecuador del cristalino. Las células epiteliales anteriores están en reposo y en sección transversal, y cerca del ecuador del cristalino, las células epiteliales proliferan y comienzan a experimentar el proceso de diferenciación en nuevas células de fibra^11,12. Las células epiteliales ecuatoriales se transforman de células empaquetadas al azar en filas meridionales organizadas con células en forma de hexágono. La forma de las células hexagonales se mantiene en el lado basal de estas células diferenciadoras, mientras que el lado apical se contrae y se ancla en el punto de apoyo del cristalino o modiolo 4,13,14,15. A medida que las células epiteliales ecuatoriales comienzan a alargarse en células fibrosas recién formadas, las puntas apicales de las células migran a lo largo de la superficie apical de las células epiteliales anteriores hacia el polo anterior, mientras que las puntas basales se mueven a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el polo posterior. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de células, creando capas esféricas de fibras. Durante el proceso de elongación y maduración celular, las células de fibra alteran sustancialmente su morfología 11,12,16. Estas células de fibra forman la mayor parte de la masa del cristalino 11,12,16,17,18.

Los mecanismos moleculares que contribuyen al establecimiento de las intrincadas microestructuras del cristalino, la morfología celular y la organización celular única no se conocen del todo. Además, la contribución de la cápsula del cristalino y la estructura celular a la función general del cristalino (transparencia, cambio de forma del cristal) no está clara. Sin embargo, estas relaciones están siendo dilucidadas utilizando una nueva metodología de imagen y evaluaciones cuantitativas de las características estructurales y celulares del cristalino 2,4,19,20,21,22. Se han desarrollado nuevos protocolos para obtener imágenes de lentes completas que permiten la visualización de alta resolución espacial de la cápsula del cristalino, las células epiteliales y las células de fibra periférica. Esto incluye la metodología para cuantificar el grosor de la cápsula, el tamaño de la célula, el tamaño y la circularidad del núcleo celular, el orden de las hileras meridionales, el empaquetamiento de las células de fibra y el ancho de las células de fibra. Estos métodos de visualización y cuantificación de imágenes permiten un examen morfométrico en profundidad y tienen ventajas sobre otros métodos de visualización (imágenes de montajes planos o secciones de tejido) al preservar la estructura general del tejido en 3D. Estos métodos han permitido probar nuevas hipótesis y permitirán un avance continuo en la comprensión del desarrollo y la función del patrón de las células del cristalino.

Para los siguientes experimentos, utilizamos ratones de tipo salvaje y Rosa26-tdTomato tándem dímero-Tomate (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) en el fondo C57BL/6J entre las edades de 6 y 10 semanas, de ambos sexos. Los ratones tdTomato permiten la visualización de las membranas plasmáticas celulares en lentes vivas a través de la expresión de la proteína tdTomato fusionada con los aminoácidos N-terminal 8 de una proteína MARCKS mutada que se dirige a la membrana plasmática a través de la miritilación N-terminal y los sitios internos de cisteína-palmitoilación²³. También utilizamos ratones NMIIA^{E1841K/E1841K 24} obtenidos originalmente del Dr. Robert Adelstein (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Como se describió anteriormente²⁰, los ratones NMIIA^{E1841K/E1841K} en el fondo FvBN/129SvEv/C57Bl6 que tienen pérdida de la proteína de filamento intermedio con perlas CP49 (mantiene la morfología de la célula de fibra madura y la biomecánica del cristalino completo), se retrocruzan con ratones de tipo salvaje C57BL6/J. Examinamos a las crías para detectar la presencia del alelo CP49 de tipo salvaje.

Las imágenes confocales se realizaron en un microscopio de fluorescencia confocal de barrido láser con un aumento de 20x (NA = 0,8, distancia de trabajo = 0,55 mm, zoom 1x), 40x (NA = 1,3 objetivo de aceite, distancia de trabajo = 0,2 mm, zoom de 1x) o 63x (NA = objetivo de aceite de 1,4, distancia de trabajo = 0,19 mm, zoom de 1x). Todas las imágenes se adquirieron utilizando un tamaño estenopeico, que es un determinante del espesor de la sección óptica, a 1 unidad de Airy (los espesores ópticos resultantes se indican en las leyendas de las figuras). Las imágenes fueron procesadas en Zen Software. Las imágenes se exportaron a .tif formato y luego se importaron al software FIJI ImageJ (imageJ.net).

Protocolo

Los ratones se alojan en las instalaciones de animales de la Universidad de Delaware, mantenidas en un entorno libre de patógenos. Todos los procedimientos con animales, incluida la eutanasia por inhalación de CO₂ , se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Delaware.

1. Preparación e imagen de la montura de la lente completa

1. Fijación de lentes para imágenes de montura completa
   1. Después de la eutanasia, enuclear los ojos y diseccionar las lentes como se describió anteriormente²⁵. Después de la disección, transfiera las lentes inmediatamente a solución salina tamponada con fosfato 1x fresca (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O; pH 7,4) a temperatura ambiente.
      NOTA: La morfología celular puede verse alterada si las lentes se almacenan en PBS durante un período prolongado de tiempo, por lo tanto, se recomienda fijarlas inmediatamente dentro de ~ 10 minutos de la disección.
   2. Para obtener imágenes de montaje completo de la región anterior de la lente, fije las lentes enteras sumergiéndolas en 0,5 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% recién hecho en 1x PBS en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1x PBS. Continúe con el paso 1.2 o almacene en 1x PBS a 4 °C. Las lentes fijas se pueden almacenar hasta por 5 días.
   3. Para obtener imágenes de montura completa de la región ecuatorial de la lente, fije las lentes enteras sumergiéndolas en 0,5 ml de PFA al 4 % recién hecho en 1x PBS en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Después de 1 h, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1 PBS. Continúe con el paso 1.3 o almacene en 1x PBS a 4 °C. Las lentes fijas se pueden almacenar hasta por 5 días.
2. Montura completa de la región anterior de la lente (fija o viva)
   1. Para obtener imágenes de montura completa de lentes fijas, continúe con el paso 1.2.3.
   2. Para obtener imágenes de montura completa de lentes vivos, transfiera los lentes a un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenga 1 ml de medio 199 (sin rojo de fenol) que contenga 1 % de antibiótico/antimicótico. Incubar las lentes a 37 °C y 5% de CO₂ hasta la obtención de imágenes. Antes de la obtención de imágenes, incube las lentes en una solución que contenga aglutinina de germen de trigo marcada con fluorescencia (WGA-640, 1:500) y Hoechst 33342 (1:500) en medio 199 durante al menos 10 minutos. Continúe con el paso 1.5.
   3. Para teñir la cápsula del cristalino, la F-actina y los núcleos de los cristalinos fijos, coloque los cristalinos en una solución de 500 μl que contenga WGA-640 (1:500), rodamina-faloidina (1:50) y Hoechst 33342 (1:500) en tampón de permeabilización/bloqueo (1x PBS que contenga 0,3% de Tritón, 0,3% de albúmina sérica bovina (fracción V) y 3% de suero de cabra) en un tubo de microcentrífuga. Tiñe las lentes a 4 °C durante la noche.
   4. Después de la incubación durante la noche, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1 ml de 1x PBS. Proceda a la obtención de imágenes de las lentes.
   5. Para estabilizar el cristalino fijo para la obtención de imágenes confocal, cree hendiduras de inmovilización del cristalino en agarosa en una antena parabólica de imagen como se ha descrito anteriormente²¹ (Figura 1).
      1. Caliente y mezcle suavemente la agarosa al 2% en PBS usando un microondas hasta que la solución esté licuada. Pipetear 250 μL de agarosa licuada al 2% en un plato con fondo de vidrio (Figura 1A) y aplanar la agarosa a lo largo del plato con un cubreobjetos de plástico flexible (Figura 1B). Una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique por completo, retire el cubreobjetos con pinzas de punta fina (Figura 1C) y use un punzón de biopsia de 3 mm para crear un orificio en agarosa en el centro del plato (Figura 1D).
      2. Retire el exceso de agarosa con una toallita delicada (Figura 1E). Mantener el moho de agarosa hidratado con 1x PBS y mantener a 4 °C hasta su uso. Los moldes de agarosa se han almacenado con éxito hasta por 1 semana.
   6. Con una pinza para embriones, transfiera suavemente la lente viva o fija a la hendidura de la agarosa (Figura 1F), que contiene ~ 2 ml de 1x PBS (lente fija) o Medium 199 (lente viva) sin rojo de fenol, y luego coloque la placa en una platina de microscopio invertida. Para confirmar que el cristalino está situado con la región anterior orientada hacia el objetivo, visualice la tinción de núcleos. Si no se observan núcleos, la región posterior puede estar orientada hacia el objetivo.
   7. Para invertir la lente, use pinzas curvas y gire suavemente la lente ~ 180 ° para que la región anterior mire hacia el objetivo. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal.
   8. Para la visualización de cápsulas de lentes, adquiera imágenes de pila z utilizando un objetivo de 40x con un tamaño de paso de 0,3 μm. Adquiera la primera imagen antes de la superficie de la cápsula del cristalino (indicada por la tinción WGA) y la última imagen después de la superficie apical de las células epiteliales. Para visualizar las células epiteliales, adquiera imágenes de pila z utilizando un objetivo de 63x con un tamaño de paso de 0,3 μm para la visualización de las células epiteliales del cristalino.
      NOTA: Estos parámetros del microscopio permiten una adecuada reconstrucción tridimensional (3D) de las imágenes, lo cual es esencial para la cuantificación de imágenes del grosor de la cápsula o del área de las células epiteliales. También es posible obtener imágenes de suturas en lentes vivas tdTomato mediante imágenes más allá de la monocapa de células epiteliales, como se describió anteriormente⁴.
3. Tinción de células epiteliales ecuatoriales y fibrosas del cristalino
   1. Coloque las lentes fijas en una solución de 0,5 ml de rodamina-faloidina (1:300), WGA-640 (1:250) y Hoechst 33342 (1:500) en una solución de permeabilización/bloqueo (3% de BSA, 3% de suero de cabra y 0,3% de Triton) dentro de un tubo de microcentrífuga. Mantener a 4 °C durante la noche.
   2. Después de la incubación durante la noche, lave las lentes 3 veces en 1 ml 1x PBS (5 minutos por lavado).
   3. Cree cuñas de agarosa de inmovilización del cristalino como se describió anteriormente ^4,10.
      1. Brevemente, cree gajos de agarosa en platos con fondo de vidrio (FD35-100, WPI) vertiendo ~ 5-6 ml de agarosa fundida al 2% en 1x PBS en platos (Figura 2A). Una vez que la agarosa se solidifique (Figura 2B), cree una hendidura triangular con una cuchilla afilada (Figura 2C). Retire la rodaja de agarosa y coloque 1 ml de 1x PBS en el plato de agarosa (Figura 2D).
      2. Aspire cualquier residuo de agarosa que pueda quedar al cortar la agarosa. Se pueden crear varias cuñas por plato para adaptarse a varios tamaños diferentes de lentes (no se muestran). Para almacenar el molde de agarosa, coloque 1 ml de 1x PBS en el molde de agarosa y manténgalo a 4 ° C. Las cuñas se pueden conservar hasta por 1 semana.
   4. Con pinzas curvas, coloque la lente dentro de una cuña de agarosa que contenga 1 ml de PBS 1x y ajústela de modo que la región ecuatorial de la lente quede hacia abajo sobre el vidrio del microscopio por encima del objetivo confocal (Figura 2E-F). Para confirmar que la región ecuatorial está enfocada, visualice los núcleos y asegúrese de que los núcleos estén alineados en filas en el ecuador. Las células epiteliales ecuatoriales también se pueden identificar, ya que están empaquetadas y formadas de forma irregular. Además, las células de la fila meridional están alineadas con precisión y tienen forma hexagonal, lo que se indica mediante la tinción de F-actina en las membranas celulares.
   5. Si los núcleos en el campo de visión están empaquetados aleatoriamente, el lado anterior de la lente está orientado hacia el objetivo. Si no se pueden observar los núcleos, lo más probable es que la parte posterior del cristalino esté orientada hacia el objetivo. Si la lente no está asentada en su ecuador, reoriente la lente y use la pinza curva para girar la lente hasta que se observen los núcleos alineados con precisión en el ecuador de la lente.
   6. Obtener imágenes de las células epiteliales ecuatoriales y de fibra del cristalino utilizando un microscopio confocal de barrido láser (objetivo 20x, NA = 0,8, tamaño del paso 0,5 μm y/o objetivo de aceite 40x, NA = 1,3, tamaño del paso 0,4 μm). Gire las imágenes antes de la recolección de la pila z, en la que las células epiteliales ecuatoriales están en la parte superior, seguidas de la fila meridional y las células de fibra justo debajo.

2. Metodología de análisis de imágenes

1. Medición del grosor de la cápsula de la lente
   1. Utilizando imágenes de pila z obtenidas con un objetivo de 40x (tamaño de paso de 0,3 μm) de lentes tdTomato en vivo marcadas con WGA o lentes fijas marcadas con WGA y rho-faloidina, obtenga una proyección óptica 2D en la vista XZ de la reconstrucción 3D y guárdela en formato .tif. Procese imágenes con el software Zen.
   2. Abra imágenes de corte XZ (.tif) en el software FIJI ImageJ.
   3. Para medir el grosor de la cápsula de la lente, utilice la función de línea recta (representada en la Figura 3A, B). Establezca el ancho de línea en 50 píxeles seleccionando Editar > Opciones > Ancho de línea. Se determinó empíricamente que este ancho de línea proporcionaba una alta relación señal-ruido con los ajustes del microscopio. El ancho de línea óptimo puede diferir en otros microscopios/configuraciones de microscopio o cuando se usan lentes de otras especies. A continuación, dibuja una línea desde la superficie superior de la cápsula hasta debajo de la región basal de las células epiteliales.
   4. Guarde la línea como región de interés pulsando Ctrl + T.
   5. Separe los canales en pestañas para la imagen, el color y los canales divididos.
   6. Mida la intensidad a lo largo de la línea para el canal de la cápsula presionando Ctrl + K.
   7. En una hoja de cálculo, grafique los valores de intensidad en función de la distancia y determine los picos de intensidad para la cápsula y la F-actina, que representan la superficie de la cápsula y la región basal de las células epiteliales, respectivamente. En el eje x está la distancia de la línea.
   8. A continuación, calcule el grosor de la cápsula determinando la distancia entre los picos de intensidad fluorescente de la cápsula y los epitelios (Figura 3C, D).
2. Análisis del área celular
   1. Utilizando imágenes de pila z obtenidas con una lente de objetivo de 63x (NA = 1,4; tamaño de paso de 0,3 μm) en lentes tdTomato en vivo o lentes fijas marcadas con faloidina, analice un corte de vista XY de una imagen confocal de pila z correspondiente a donde se enfoca la región media (lateral) de las células epiteliales. Tenga en cuenta que las membranas laterales son visibles usando el tinte de membrana tdTomato o visualizando la faloidina que está presente en las membranas celulares laterales.
      NOTA: Debido a la curvatura de la lente (como se ve en una vista XZ; Figura 4A-C), no todas las células epiteliales estarán enfocadas en la imagen. La región media del epitelio corresponde a la región donde se enfocan tanto las membranas laterales celulares (Figura 4D-E) como los núcleos (Figura 4G-I).
   2. Exporte la imagen como un .tif y ábrala en FIJI ImageJ.
   3. Para establecer la escala en FIJI ImageJ para el análisis, utilice la herramienta de línea para crear una línea que tenga la longitud de una barra de escala a partir de la imagen confocal.
   4. Registre la longitud en píxeles de la línea y la longitud de la barra de escala. Vaya a Analizar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Establecer escala. Introduzca el número de píxeles que es la longitud de la línea en Distancia en píxeles y en Distancia conocida introduzca la longitud conocida de la barra de escala.
   5. Utilizando la tinción tdTomato o rodamina-faloidina como indicación de los límites de las celdas, delinee manualmente una población de células que estén enfocadas dentro de la imagen con la herramienta poligonal. Solo trace las células donde las membranas laterales sean visibles (Figura 4E) y evite trazar células parcialmente visibles (es decir, en el borde de las imágenes). Guarde el ROI presionando Ctrl + T. Vaya a Editar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Borrar exterior. Ahora mida el área total de la celda (ROI) presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ.
   6. Calcule el área de celda promedio dividiendo el área de ROI por el número total de celdas. Una forma sencilla de determinar el número de células es contando el número de núcleos. Vaya al canal de núcleos (azul). En el menú ROI, seleccione el esquema de ROI guardado de las celdas (Figura 4G). Para borrar fuera del ROI, vaya a Editar y, a continuación, haga clic en Borrar fuera (Figura 4H). Con la herramienta Multipunto, cuente los núcleos haciendo clic en núcleos individuales.
3. Análisis del área nuclear celular y de la forma
   1. Para el análisis del área y la forma de los núcleos, analice una sección óptica de vista de plano XY a partir de una imagen confocal de pila z correspondiente a donde se enfoca la región media (lateral) de las células epiteliales de tdTomato. Analice un corte de pila z a partir de una imagen confocal donde el área nuclear es la más grande (Figura 5A); Esto representa la parte media de los núcleos.
      NOTA: Tenga en cuenta que debido a la curvatura de la lente, no todos los núcleos estarán enfocados, como se puede ver en la vista XZ (Figura 4G y Figura 5A).
   2. Seleccione una subpoblación de núcleos que estén en el foco y guarde un ROI.
   3. Utilice la función Borrar exterior . Dentro del ROI, utilizando la herramienta de selección a mano alzada (cuarto botón de menú desde la izquierda), trace cuidadosamente los bordes de los núcleos (Figura 5B). Guarde cada traza nuclear en la ventana ROI presionando Ctrl + T. Solo delinee los núcleos donde se puedan ver los núcleos completos y los núcleos no se toquen entre sí.
   4. Una vez que todos los núcleos estén delineados, mida el área nuclear y la forma de las células individuales (es decir, la circularidad) presionando Ctrl + M.
   5. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo y calcule el área nuclear media y la circularidad (Figura 5C).
4. Empaquetamiento epitelial de hileras meridionales
   1. Para medir el trastorno de la hilera meridional, adquiera imágenes con un objetivo de 20x (tamaño de paso de 0,5 μm).
   2. Identifique el punto de apoyo/modiolo de la lente en las imágenes. El punto de apoyo es la región donde las puntas apicales de las células epiteliales alargadas se contraen para formar un punto de anclaje durante la diferenciación y elongación inicial de las células de fibra en el ecuador. Identifique el punto de apoyo en función de la intensidad brillante de la actina F (indicada por la punta de flecha en la vista XZ en la Figura 6A; indicada por una línea discontinua roja en la Figura 6B) y el cambio en la organización celular en una sola sección óptica en la vista XY.
      NOTA: Además, la tinción de F-actina de las regiones basal y apical de las células epiteliales es aparente por encima del punto de apoyo, mientras que solo la región basal de las células alargadas es aparente por debajo del punto de apoyo (Figura 6A). Las células epiteliales por encima de la línea de apoyo están empaquetadas irregularmente y tienden a formar rosetas, mientras que las células de fibra por debajo del punto de apoyo están dispuestas en filas paralelas, indicadas por la tinción de actina F brillante en la membrana (Figura 6B).
   3. Una vez identificado el punto de apoyo en ratones de 2 meses de edad, seleccione la sección óptica única ~4,5-5 μm periférica al punto de apoyo (hacia la cápsula del cristalino) en el plano XY. Esta distancia se selecciona en función de la observación de que todos los núcleos de las células de la fila meridional en ratones de 2 meses de edad están enfocados cuando están a ~5 μm periféricos al punto de apoyo. Guarde la sección óptica única (.tif). Abra la imagen en FIJI.
      NOTA: Este análisis solo se ha realizado en ratones de 2 meses de edad y, por lo tanto, no se puede concluir si esta distancia cambia con la edad.
   4. Antes de realizar el análisis de imágenes, establezca la escala en μm en ImageJ mediante el paso 2.2.2.
   5. Delinee manualmente todas las regiones de la fila meridional utilizando la herramienta de línea a mano alzada (región de interés/ROI) identificando la alineación nuclear, como se muestra en la Figura 7A. Guarde el ROI presionando Ctrl + T. Vaya a Editar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Borrar exterior. Mida el área total de celda (ROI) presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ.
   6. Identifique cualquier región de desorden indicada por la tinción de actina F delineando con la herramienta de línea a mano alzada en FIJI ImageJ. Los criterios para las regiones desordenadas incluyen la ramificación de las filas, el empaquetamiento irregular y la desalineación de las filas (Figura 7B), como se mostró anteriormente²⁰.
   7. Mida el área desordenada delineada/parcheada presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ. Suma el área total desordenada en una hoja de cálculo.
   8. Divida el área total desordenada por el área de ROI, luego multiplíquelo por 100 para obtener un porcentaje de área desordenada. Si no se observa ningún trastorno, coloque un valor de 0% para el área desordenada.
5. Número de fila meridional de células vecinas
   1. Para medir el número de células vecinas, utilice imágenes teñidas con actina F adquiridas con un objetivo de aceite de 40x (tamaño de paso de 0,4 μm).
   2. Identifique una sección óptica (plano XY) en la región basal de las células de la fila meridional hacia adentro de la cápsula del cristalino donde la actina F está enriquecida alrededor de todo el perímetro de las células de la fila meridional, todas las células de la fila meridional están enfocadas y están en el mismo plano.
   3. Cuente el número de celdas adyacentes que tiene cada celda de la fila meridional (Figura 8). Mida el porcentaje promedio de celdas con seis celdas adyacentes en una hoja de cálculo.
      NOTA: Determine el número de celdas adyacentes con un objetivo de 20x. Sin embargo, es significativamente más fácil observar la forma del hexágono con un objetivo de 40x.
6. Análisis de imágenes de células de fibra ecuatorial
   1. Tome imágenes confocales de pila z de lentes teñidas con rodamina faloidina con un objetivo de 20x (tamaño de paso de 0,5 μm).
   2. Identifique el punto de apoyo como se indica en el paso 2.4.2. Una vez identificado el punto de apoyo, seleccione una sola sección óptica. Para fines de estandarización y para comparar entre lentes, cuantifique los anchos de celda de fibra ~ 10 μm hacia adentro desde el punto de apoyo en el plano XY (Figura 9A).
   3. Exporte imágenes sin procesar a FIJI ImageJ. En FIJI ImageJ, dibuje una línea (generalmente ~300-400 μm de largo) a través de varias celdas de fibra adyacentes para medir la distancia entre los picos teñidos con actina F (análisis de escaneo lineal; Figura 9A; línea rosa).
   4. Obtenga la intensidad fluorescente sobre la distancia de escaneo lineal en FIJI presionando Ctrl + K. A continuación, exporte los datos a la hoja de cálculo para calcular la distancia entre picos (ejemplo que se muestra en la Figura 9A-B). Esto corresponde a los anchos de celda de fibra.

Resultados

Cápsula anterior del cristalino, área de células epiteliales y área nuclear
Para analizar el grosor de la cápsula de la lente, tiñimos las cápsulas de la lente, ya sea en lentes vivas o fijas, con WGA. Identificamos las células epiteliales del cristalino marcando las membranas con tdTomato en lentes vivas (Figura 2A), o mediante tinción de rodamina-faloidina para F-actina en las membranas celulares de lentes fijas (Figura 2B). En una...

Discusión

Los protocolos descritos permiten la visualización de alta resolución espacial de las estructuras y células periféricas del cristalino en las regiones anterior y ecuatorial del cristalino. En este estudio, se mostraron métodos para la visualización de estructuras periféricas de lentes utilizando lentes intactas (vivas o fijas) donde se conserva la arquitectura general de la lente 3D. Además, se proporcionaron métodos simples para el análisis cuantitativo morfométrico utilizando el software FIJI ImageJ disponib...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R