Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

Resumen

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Resumen

El cristalino ocular es un tejido transparente y flexible que altera su forma para enfocar la luz desde diferentes distancias en la retina. Aparte de una membrana basal que rodea el órgano, llamada cápsula, el cristalino es completamente celular y consiste en una monocapa de células epiteliales en el hemisferio anterior y una masa masiva de células de fibra del cristalino. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan en la zona germinativa en el ecuador del cristalino, y las células epiteliales ecuatoriales migran, se alargan y se diferencian en células de fibra recién formadas. Las células epiteliales ecuatoriales alteran sustancialmente la morfología de células empaquetadas al azar en forma de adoquín a células alineadas en forma de hexágono que forman filas meridionales. Las células de fibra del cristalino recién formadas conservan la forma de célula hexagonal y se alargan hacia los polos anterior y posterior, formando una nueva capa de células que se superponen a las generaciones anteriores de fibras. Poco se sabe sobre los mecanismos que conducen a la notable morfogénesis de las células epiteliales del cristalino a las células fibra. Para comprender mejor la estructura, el desarrollo y la función de las lentes, se han desarrollado nuevos protocolos de obtención de imágenes para obtener imágenes de estructuras periféricas utilizando monturas completas de lentes oculares. Aquí, se muestran métodos para cuantificar el grosor de la cápsula, el área de las células epiteliales, el área y la forma del núcleo de la célula, el orden y el empaquetamiento de las células de la fila meridional y el ancho de las células de las fibras. Estas mediciones son esenciales para dilucidar los cambios celulares que ocurren durante el crecimiento del cristalino a lo largo de la vida y comprender los cambios que ocurren con la edad o la patología.

Introducción

El cristalino ocular es un tejido flexible y transparente situado en la región anterior del ojo que funciona para enfocar la luz en la retina. La capacidad de funcionamiento de la lente se puede atribuir, en parte, a su intrincada arquitectura y organización 1,2,3,4,5,6. Alrededor del tejido del cristalino se encuentra la cápsula, una membrana basal esencial para mantener la estructura del cristalino y las propiedades biomecánicas ^7,8,9

Protocolo

Los ratones se alojan en las instalaciones de animales de la Universidad de Delaware, mantenidas en un entorno libre de patógenos. Todos los procedimientos con animales, incluida la eutanasia por inhalación de CO₂ , se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Delaware.

1. Preparación e imagen de la montura de la lente completa

1. Fijación de lentes para imágenes de montura completa
   1. Después de la eutanasia, enuclear los ojos y diseccionar las lentes como se describió anteriormente^25<....

Resultados

Cápsula anterior del cristalino, área de células epiteliales y área nuclear
Para analizar el grosor de la cápsula de la lente, tiñimos las cápsulas de la lente, ya sea en lentes vivas o fijas, con WGA. Identificamos las células epiteliales del cristalino marcando las membranas con tdTomato en lentes vivas (Figura 2A), o mediante tinción de rodamina-faloidina para F-actina en las membranas celulares de lentes fijas (Figura 2B). En una.......

Discusión

Los protocolos descritos permiten la visualización de alta resolución espacial de las estructuras y células periféricas del cristalino en las regiones anterior y ecuatorial del cristalino. En este estudio, se mostraron métodos para la visualización de estructuras periféricas de lentes utilizando lentes intactas (vivas o fijas) donde se conserva la arquitectura general de la lente 3D. Además, se proporcionaron métodos simples para el análisis cuantitativo morfométrico utilizando el software FIJI ImageJ disponib.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R