全卡口成像，用于可视化和量化周边晶状体结构、细胞形态和组织

摘要

本方案描述了用于眼晶状体中周边结构可视化的新型全卡口成像以及图像量化方法。这些协议可用于研究，以更好地了解晶状体微观结构与晶状体发育/功能之间的关系。

摘要

人工晶状体是一种透明的柔性组织，可以改变其形状以将不同距离的光聚焦到视网膜上。除了围绕器官的基底膜（称为囊）外，晶状体完全由前半球的单层上皮细胞和大量晶状体纤维细胞组成。在整个生命中，上皮细胞在晶状体赤道的萌发区增殖，赤道上皮细胞迁移、伸长并分化为新形成的纤维细胞。赤道上皮细胞的形态从随机堆积的鹅卵石状细胞转变为排列的六边形细胞，形成经线行。新形成的晶状体纤维细胞保持六边形细胞形状，并向前极和后极伸长，形成覆盖在前几代纤维上的新细胞壳。关于驱动晶状体上皮细胞显着形态发生到纤维细胞的机制知之甚少。为了更好地了解晶状体结构、发育和功能，已经开发了新的成像方案，以使用整个眼晶状体对外围结构进行成像。在这里，显示了量化胶囊厚度、上皮细胞面积、细胞核面积和形状、经向行细胞顺序和堆积以及纤维细胞宽度的方法。这些测量对于阐明终生晶状体生长过程中发生的细胞变化以及了解随着年龄或病理而发生的变化至关重要。

引言

人工晶状体是位于眼睛前部的柔性透明组织，其功能是将光线精细聚焦到视网膜上。镜头的功能能力可以部分归因于其复杂的结构和组织 1,2,3,4,5,6。晶状体组织周围是囊，囊是维持晶状体结构和生物力学特性所必需的基底膜^7,8,9。晶状体本身完全是细胞状的，由两种细胞类型组成：上皮细胞和纤维细胞。上皮层由覆盖晶状体¹⁰前半球的单层立方体细胞组成。在整个生命中，上皮细胞增殖并沿着晶状体囊向晶状体赤道迁移。前上皮细胞在横截面上是静止的鹅卵石状的，在晶状体赤道附近，上皮细胞增殖并开始经历分化过程，形成新的纤维细胞^11,12。赤道上皮细胞从随机堆积的细胞转变为具有六边形细胞的有组织的子午线行。六边形细胞形状保....

研究方案

小鼠被饲养在特拉华大学的动物设施中，保持在无病原体的环境中。所有动物程序，包括吸入 CO₂ 的安乐死，均按照特拉华大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的动物协议进行。

1. 整个镜头卡口准备和成像

1. 固定镜头进行全卡口成像
   1. 安乐死后，如前所述，摘除眼睛并解剖晶状体²⁵.解剖后，立即将镜片转移到室温下新鲜的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS;1.1mM KH₂PO 4,155mM，NaCl，3.0mM_{Na 2}HPO_{4-7H 2O};pH 7.4）中。
      注意：如果晶状体长时间存放在PBS中，细胞形态可能会改变，因此，建议在解剖后~10分钟内立即固定。
   2. 对于晶状体前部区域的全摄像，通过在室温下将 0.5 mL 新鲜制备的 4% 多聚甲醛 （PFA） 浸入 1x PBS 中的微量离心管中来固定整个晶状体。30 分钟后，用 1x PBS 清洗镜片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。继续步骤1.2或在4°C下储存在1x PBS中。 固定镜片最多可存放 5 天。
   3. 对于晶状体赤道区域的全卡口成像，在室温下将 0.5 mL 新鲜制备的 4% PFA 浸入 1x PBS 中的 1x PBS 中，固定整个镜....

讨论

所描述的方案能够实现晶状体前部和赤道区域周边晶状体结构和细胞的高空间分辨率可视化。在这项研究中，展示了使用完整（动态或固定）镜头可视化镜头周边结构的方法，其中保留了整体 3D 镜头结构。此外，还提供了使用公开可用的FIJI ImageJ软件进行形态定量分析的简单方法。在以前的研究中已经使用了整个安装点的可视化和量化方法。这些方法使我们能够了解前囊和细胞对晶状体形状变化?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R