全卡口成像，用于可视化和量化周边晶状体结构、细胞形态和组织

摘要

本方案描述了用于眼晶状体中周边结构可视化的新型全卡口成像以及图像量化方法。这些协议可用于研究，以更好地了解晶状体微观结构与晶状体发育/功能之间的关系。

摘要

人工晶状体是一种透明的柔性组织，可以改变其形状以将不同距离的光聚焦到视网膜上。除了围绕器官的基底膜（称为囊）外，晶状体完全由前半球的单层上皮细胞和大量晶状体纤维细胞组成。在整个生命中，上皮细胞在晶状体赤道的萌发区增殖，赤道上皮细胞迁移、伸长并分化为新形成的纤维细胞。赤道上皮细胞的形态从随机堆积的鹅卵石状细胞转变为排列的六边形细胞，形成经线行。新形成的晶状体纤维细胞保持六边形细胞形状，并向前极和后极伸长，形成覆盖在前几代纤维上的新细胞壳。关于驱动晶状体上皮细胞显着形态发生到纤维细胞的机制知之甚少。为了更好地了解晶状体结构、发育和功能，已经开发了新的成像方案，以使用整个眼晶状体对外围结构进行成像。在这里，显示了量化胶囊厚度、上皮细胞面积、细胞核面积和形状、经向行细胞顺序和堆积以及纤维细胞宽度的方法。这些测量对于阐明终生晶状体生长过程中发生的细胞变化以及了解随着年龄或病理而发生的变化至关重要。

引言

人工晶状体是位于眼睛前部的柔性透明组织，其功能是将光线精细聚焦到视网膜上。镜头的功能能力可以部分归因于其复杂的结构和组织 1,2,3,4,5,6。晶状体组织周围是囊，囊是维持晶状体结构和生物力学特性所必需的基底膜^7,8,9。晶状体本身完全是细胞状的，由两种细胞类型组成：上皮细胞和纤维细胞。上皮层由覆盖晶状体¹⁰前半球的单层立方体细胞组成。在整个生命中，上皮细胞增殖并沿着晶状体囊向晶状体赤道迁移。前上皮细胞在横截面上是静止的鹅卵石状的，在晶状体赤道附近，上皮细胞增殖并开始经历分化过程，形成新的纤维细胞^11,12。赤道上皮细胞从随机堆积的细胞转变为具有六边形细胞的有组织的子午线行。六边形细胞形状保持在这些分化细胞的基底侧，而顶端收缩并锚定在晶状体支点或晶状体^{4、13、14、15}。当赤道上皮细胞开始伸长成新形成的纤维细胞时，细胞的顶端沿着前上皮细胞的顶端表面向前极迁移，而基底尖端沿晶状体囊向后极移动。新一代纤维细胞覆盖前几代细胞，形成球形纤维壳。在细胞伸长和成熟过程中，纤维细胞显著改变其形态11,12,16。这些纤维细胞构成晶状体质量11,12,16,17,18的大部分。

有助于建立复杂的晶状体微观结构、细胞形态和独特细胞组织的分子机制尚不完全清楚。此外，晶状体囊和晶胞结构对整体晶状体功能（透明度、晶状体形状变化）的贡献尚不清楚。然而，这些关系正在使用新的成像方法和对晶状体结构和细胞特征的定量评估^来阐明 2,4,19,20,21,22。已经开发了对整个晶状体进行成像的新方案，这些方案允许对晶状体囊、上皮细胞和外周纤维细胞进行高空间分辨率可视化。这包括量化胶囊厚度、细胞大小、细胞核大小和圆度、经向行顺序、纤维细胞堆积和纤维细胞宽度的方法。这些可视化和图像定量方法允许进行深入的形态测量检查，并且通过保留整体 3D 组织结构，与其他可视化方法（平面或组织切片成像）相比具有优势。这些方法允许测试新的假设，并将持续推进对晶状体细胞模式发展和功能的理解。

对于以下实验，我们在 6 至 10 周龄的 C57BL/6J 背景下使用野生型和 Rosa26-tdTomato 小鼠串联二聚体-番茄 （B6.129（Cg）-Gt（ROSA） （tdTomato）²³ （Jackson Laboratories）。tdTomato 小鼠通过表达 tdTomato 蛋白与突变 MARCKS 蛋白的 N 端 8 个氨基酸融合，通过 N 端肉豆蔻基化和内部半胱氨酸-棕榈酰化位点靶向质膜，从而在活体晶状体中可视化细胞质膜²³。我们还使用最初从Robert Adelstein博士（美国国立卫生研究院国家心脏，肺和血液研究所，贝塞斯达，马里兰州）获得的NMIIA^{E1841K / E1841K} 小鼠²⁴ 。如前所述²⁰，在FvBN / 129SvEv / C57Bl6背景中丢失CP49珠状中间丝蛋白（保持成熟的纤维细胞形态和整个晶状体生物力学）的NMIIA^{E1841K / E1841K}小鼠与C57BL6 / J野生型小鼠回交。我们筛选了后代是否存在野生型 CP49 等位基因。

在激光扫描共聚焦荧光显微镜上进行共聚焦成像，放大倍数为20倍（NA = 0.8，工作距离=0.55mm，1倍变焦），40倍（NA = 1.3油物镜，工作距离=0.2mm，1倍变焦）或63倍（NA = 1.4油物镜，工作距离=0.19mm，1倍变焦）放大倍率。所有图像均使用针孔尺寸（光学截面厚度的决定因素）采集，精确到 1 艾里单位（由此产生的光学厚度在图例中说明）。图像在Zen软件上处理。图像被导出为.tif格式，然后导入FIJI ImageJ软件（imageJ.net）。

研究方案

小鼠被饲养在特拉华大学的动物设施中，保持在无病原体的环境中。所有动物程序，包括吸入 CO₂ 的安乐死，均按照特拉华大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的动物协议进行。

1. 整个镜头卡口准备和成像

1. 固定镜头进行全卡口成像
   1. 安乐死后，如前所述，摘除眼睛并解剖晶状体²⁵.解剖后，立即将镜片转移到室温下新鲜的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS;1.1mM KH₂PO 4,155mM，NaCl，3.0mM_{Na 2}HPO_{4-7H 2O};pH 7.4）中。
      注意：如果晶状体长时间存放在PBS中，细胞形态可能会改变，因此，建议在解剖后~10分钟内立即固定。
   2. 对于晶状体前部区域的全摄像，通过在室温下将 0.5 mL 新鲜制备的 4% 多聚甲醛 （PFA） 浸入 1x PBS 中的微量离心管中来固定整个晶状体。30 分钟后，用 1x PBS 清洗镜片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。继续步骤1.2或在4°C下储存在1x PBS中。 固定镜片最多可存放 5 天。
   3. 对于晶状体赤道区域的全卡口成像，在室温下将 0.5 mL 新鲜制备的 4% PFA 浸入 1x PBS 中的 1x PBS 中，固定整个镜片。1小时后，用1x PBS清洗镜片3次（每次洗涤5分钟）。继续步骤1.3或在4°C下储存在1x PBS中。 固定镜片最多可存放 5 天。
2. 晶状体前部的整个安装口（固定或实时）
   1. 对于固定镜头的整体卡口成像，请继续执行步骤 1.2.3。
   2. 对于活体镜片的全卡口成像，将镜片转移到含有 1 mL 含有 1% 抗生素/抗真菌剂的培养基 199（不含酚红）的 48 孔板的孔中。将透镜在37°C和5%CO₂ 下孵育直至成像。在成像之前，将镜片在含有荧光标记的小麦胚芽凝集素（WGA-640,1：500）和Hoechst 33342（1：500）的培养基199的溶液中孵育至少10分钟。继续执行步骤 1.5。
   3. 要对晶状体囊、F-肌动蛋白和固定晶状体的细胞核进行染色，请将晶状体置于含有 WGA-640 （1：500）、罗丹明-鬼笔环肽 （1：50） 和 Hoechst 33342 （1：500） 的 500 μL 溶液中，在微量离心管中加入透化/封闭缓冲液（1x PBS，含有 0.3% Triton、0.3% 牛血清白蛋白（组分 V）和 3% 山羊血清）。在4°C下染色镜片过夜。
   4. 孵育过夜后，用 1 mL 1x PBS 洗涤镜片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。继续成像镜头。
   5. 为了稳定用于共聚焦成像的固定透镜，如前所述，在成像培养皿上的琼脂糖中创建晶状体固定化凹槽²¹ （图1）。
      1. 加热并使用微波炉在PBS中轻轻混合2%琼脂糖，直至溶液液化。将250μL液化的2%琼脂糖移液到玻璃底培养皿中（图1A），并使用柔性塑料盖玻片将琼脂糖压平（图1B）。琼脂糖冷却并完全凝固后，使用细尖镊子（图1C）取出盖玻片，并使用3mm活检冲床在培养皿中心在琼脂糖上形成一个孔（图1D）。
      2. 使用精细的任务擦拭去除多余的琼脂糖（图1E）。保持琼脂糖霉菌用1x PBS水合，并保持在4°C直至使用。琼脂糖霉菌已成功储存长达 1 周。
   6. 使用胚胎镊子，轻轻地将活体或固定晶状体转移到琼脂糖（图1F）中的凹槽中，琼脂糖中含有~2mL的1x PBS（固定透镜）或无酚红培养基199（活体透镜），然后将培养皿放在倒置的显微镜载物台上。要确认晶状体位于面向物镜的前部区域，请观察细胞核染色。如果没有观察到细胞核，则后部区域可能面向物镜。
   7. 要倒置晶状体，请使用弯曲的镊子并轻轻旋转晶状体~180°，使前部区域朝向物镜。使用共聚焦显微镜采集图像。
   8. 对于透镜囊的可视化，使用步长为 0.3 μm 的 40 倍物镜采集 z 堆叠图像。获取晶状体囊表面（由WGA染色表示）之前的第一张图像和上皮细胞顶端表面之后的最后一张图像。要可视化上皮细胞，请使用步长为 0.3 μm 的 63 倍物镜采集 z 堆栈图像，以可视化晶状体上皮细胞。
      注意：这些显微镜参数允许对图像进行充分的三维（3D）重建，这对于胶囊厚度或上皮细胞区域的图像量化至关重要。如前所述，也可以通过上皮细胞单层成像来对活晶状体 tdTomato 晶状体中的缝合线进行成像⁴。
3. 晶状体赤道上皮和纤维细胞染色
   1. 将固定镜片置于 0.5 mL 罗丹明-鬼笔环肽 （1：300）、WGA-640 （1：250） 和 Hoechst 33342 （1：500） 溶液中，在微量离心管内的透化/封闭溶液（3% BSA、3% 山羊血清和 0.3% Triton）中。在4°C下保持过夜。
   2. 孵育过夜后，在 1mL 1x PBS 中洗涤镜片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
   3. 如前所述，创建晶状体固定琼脂糖楔块^4,10。
      1. 简而言之，通过将~5-6mL熔融的2%琼脂糖在1x PBS中倒入培养皿中，在玻璃底培养皿（FD35-100，WPI）中创建琼脂糖楔（图2A）。一旦琼脂糖凝固（图2B），用锋利的刀片形成一个三角形的凹槽（图2C）。取出琼脂糖楔块，将1mL 1x PBS放入琼脂糖培养皿中（图2D）。
      2. 吸出切割琼脂糖时可能留下的任何残留琼脂糖。每个培养皿可以创建多个楔块，以适应多个不同尺寸的镜头（未显示）。要储存琼脂糖模具，将1mL 1x PBS放在琼脂糖模具上并保持在4°C。 楔子可以保存长达 1 周。
   4. 使用弯曲的镊子，将镜头放入含有 1mL 1x PBS 的琼脂糖楔块中并进行调整，使镜头的赤道区域朝下朝下到共聚焦物镜上方的显微镜玻璃上（图 2E-F）。要确认赤道区域是否处于焦点中，请可视化原子核并确保原子核在赤道上成行对齐。赤道上皮细胞也可以被识别，因为它们是不规则的堆积和形状。同样，经向行细胞精确排列且呈六边形，由细胞膜上的 F-肌动蛋白染色表示。
   5. 如果视场中的原子核是随机堆积的，则镜头的前侧朝向物镜。如果无法观察到原子核，则晶状体的后侧很可能面向物镜。如果镜头不在赤道上，请重新调整镜头的方向，并使用弯曲的镊子旋转镜头，直到观察到镜头赤道处精确对齐的原子核。
   6. 使用激光扫描共聚焦显微镜（20x物镜，NA = 0.8，步长0.5μm和/或40x油物镜，NA = 1.3，步长0.4μm）对晶状体赤道上皮细胞和纤维细胞进行成像。在 z 堆栈收集之前旋转图像，其中赤道上皮细胞位于顶部，然后是正下方的经向行和纤维细胞。

2. 图像分析方法

1. 镜头胶囊厚度测量
   1. 使用用 40 倍物镜（0.3 μm 步长）获得的 z 堆栈图像，该物镜是用 WGA 标记的活 tdTomato 透镜或标记有 WGA 和 rho-phalloidin 的固定透镜，在 3D 重建的 XZ 视图中获得光学 2D 投影并以.tif格式保存。使用 Zen 软件处理图像。
   2. 在 FIJI ImageJ 软件中打开 XZ 切片 （.tif） 图像。
   3. 要测量透镜囊的厚度，请使用直线函数（如 图 3A、B 所示）。通过选择“ 编辑”>“选项”>“线宽”，将线宽设置为 50 像素。根据经验确定该线宽，以在显微镜设置下提供高信噪比。最佳线宽可能因其他显微镜/显微镜设置或使用其他物种的镜头而异。接下来，从包膜的顶面到上皮细胞基底区域下方画一条线。
   4. 按 Ctrl + T 将该行另存为感兴趣区域。
   5. 将通道分为图像、颜色和拆分通道的选项卡。
   6. 按 Ctrl + K 测量胶囊通道沿线的强度。
   7. 在电子表格中，绘制强度值作为距离的函数，并确定包膜和 F-肌动蛋白的强度峰值，它们分别代表上皮细胞的包膜表面和基底区域。x 轴上是线距离。
   8. 接下来，通过确定胶囊和上皮荧光强度峰之间的距离来计算胶囊厚度（图3C，D）。
2. 细胞面积分析
   1. 使用使用63倍物镜（NA = 1.4;0.3μm步长）在活体tdTomato透镜或用鬼笔环肽标记的固定透镜上获得的z-stack图像，分析来自z-stack共聚焦图像的XY视图切片对应于上皮细胞的中间（侧向）区域。请注意，使用 tdTomato 膜染料或通过可视化存在于侧细胞膜上的鬼笔环肽，可以看到侧膜。
      注意：由于镜头的曲率（如XZ视图所示;图4A-C），并非所有上皮细胞都会在图像中聚焦。上皮的中间区域对应于细胞侧膜（图4D-E）和细胞核（图4G-I）都聚焦的区域。
   2. 将图像导出为.tif并在 FIJI ImageJ 中打开它。
   3. 要在 FIJI ImageJ 中设置比例进行分析，请使用线条工具从共聚焦图像创建一条长度为比例尺长度的线。
   4. 记录线条的像素长度和比例尺的长度。转到工具栏菜单上的“分析”，然后选择 “设置比例”。在“距离（以像素为单位）”中输入像素数，即线的长度，在“已知距离”中输入比例尺的已知长度。
   5. 使用 tdTomato 或罗丹明-鬼笔环肽染色作为细胞边界的指示，使用多边形工具手动勾勒出图像中聚焦的细胞群。仅跟踪侧膜可见的细胞（图4E），避免跟踪部分可见的细胞（即在图像的边缘）。按 Ctrl+T 保存 ROI。转到工具栏菜单上的“编辑”，然后选择 “清除外部”。现在，在 FIJI ImageJ 中按 Ctrl + M 测量总单元格面积 （ROI）。
   6. 通过将 ROI 面积除以总像元数来计算平均单元格面积。确定细胞数量的一种简单方法是计算细胞核的数量。转到细胞核通道（蓝色）。在ROI菜单上，选择保存的单元格ROI轮廓（图4G）。通过转到 Edit，然后单击 Clear outside （图 4H），清除 ROI 之外。使用多点工具，通过单击单个原子核来计算原子核。
3. 细胞核面积和形状分析
   1. 对于细胞核面积和形状分析，从 z 堆栈共聚焦图像中分析 XY 平面视图光学切片，该图像对应于 tdTomato 上皮细胞的中间（侧向）区域聚焦的位置。分析核面积最大的共聚焦图像中的z堆栈切片（图5A）;这代表原子核的中间部分。
      注意：请注意，由于透镜的曲率，并非所有原子核都会聚焦，如XZ视图所示（图4G 和 图5A）。
   2. 选择聚焦的原子核子群并保存 ROI。
   3. 使用 “清除外部 ”功能。在ROI中，使用手绘选择工具（左起第四个菜单按钮），仔细描摹细胞核的边界（图5B）。按 Ctrl+T 将每个核迹线保存到 ROI 窗口中。只勾勒出可以看到完整原子核的原子核，并且原子核之间没有相互接触。
   4. 勾勒出所有细胞核的轮廓后，按 Ctrl+M 测量单个细胞的细胞核面积和形状（即圆度）。
   5. 将数据复制并粘贴到电子表格中，并计算平均核面积和圆度（图5C）。
4. 经线上皮填塞
   1. 要测量经向行紊乱，请使用 20 倍物镜（0.5 μm 步长）采集图像。
   2. 识别图像上的晶状体支点/模量。支点是伸长的上皮细胞的顶端在赤道初始纤维细胞分化和伸长过程中收缩形成锚点的区域。根据明亮的F-肌动蛋白强度（ 在图6A的XZ视图中用箭头表示; 在图6B中用红色虚线表示）和XY视图下单个光学切片中细胞组织的变化来识别支点。
      注意：此外，上皮细胞的基底和顶端区域的F-肌动蛋白染色在支点上方明显，而只有伸长细胞的基底区域在支点下方明显（图6A）。支点线上方的上皮细胞不规则堆积，倾向于形成莲座结，而支点下方的纤维细胞平行排列，由膜上明亮的 F-肌动蛋白染色表示（图 6B）。
   3. 一旦在2个月大的小鼠中鉴定出支点，在XY平面中选择支点周边~4.5-5μm的单个光学切片（朝向晶状体囊）。选择该距离是基于以下观察结果：当 2 个月大小鼠的经向行细胞的所有细胞核位于支点外围 ~5 μm 时，它们都处于焦点中。保存单个光学部分 （.tif）。在斐济上打开图像。
      注意：该分析仅在2个月大的小鼠上进行，因此无法得出该距离是否随年龄变化的结论。
   4. 在进行图像分析之前，使用步骤 2.2.2 在 ImageJ 中将比例设置为 μm。
   5. 使用手绘线工具（感兴趣区域/ ROI）通过识别核对齐手动勾勒出整个子午线区域，如 图7A所示。按 Ctrl+T 保存 ROI。转到工具栏菜单上的“编辑”，然后选择 “清除外部”。在 FIJI ImageJ 中按 Ctrl + M 测量总单元格面积 （ROI）。
   6. 通过使用 FIJI ImageJ 中的手绘线条工具勾勒出轮廓，识别 F-肌动蛋白染色指示的任何疾病区域。无序区域的标准包括行的分支、不规则的堆积和行的错位（图 7B），如前²⁰ 所示。
   7. 在 FIJI ImageJ 中按 Ctrl + M 测量轮廓的无序区域/修补区域。对电子表格中的总无序面积求和。
   8. 将总无序面积除以 ROI 面积，然后乘以 100 得到无序面积百分比。如果没有观察到紊乱，则为紊乱区域设置值 0%。
5. 相邻像元的经向行数
   1. 要测量相邻细胞的数量，请使用用 40 倍油物镜（0.4 μm 步长）采集的 F-肌动蛋白染色图像。
   2. 在经向行细胞的基底区域从晶状体囊向内识别光学切片（XY平面），其中F-肌动蛋白富集在经向行细胞的整个周边，所有经向行细胞都聚焦并在同一平面上。
   3. 计算每个子午线行单元格的相邻单元格数（图8）。测量电子表格中具有六个相邻单元格的单元格的平均百分比。
      注意：确定具有 20 倍物镜的相邻单元格的数量。然而，用 40 倍物镜观察六边形要容易得多。
6. 赤道纤维细胞的图像分析
   1. 使用 20 倍物镜（0.5 μm 步长）拍摄罗丹明鬼笔环肽染色镜片的 z 堆栈共聚焦图像。
   2. 按照步骤 2.4.2 中的指示确定支点。确定支点后，选择单个光学截面。出于标准化目的和比较透镜，从XY平面的支点向内量化~10μm的光纤单元宽度（图9A）。
   3. 将原始图像导出到 FIJI ImageJ。在 FIJI ImageJ 中，在几个相邻的纤维细胞上画一条线（通常为 ~300-400 μm 长），以测量 F-肌动蛋白染色峰之间的距离（线扫描分析; 图9A;粉红线）。
   4. 按 Ctrl+K 获得 FIJI 中线扫描距离上的荧光强度。接下来，将数据导出到电子表格中以计算峰间距离（示例如图9A-B所示）。这与光纤单元的宽度相对应。

结果

晶状体前囊、上皮细胞区和核区
为了分析晶状体胶囊的厚度，我们用WGA对活体或固定镜片中的晶状体胶囊进行染色。我们通过在活晶状体中用tdTomato标记膜来鉴定晶状体上皮细胞（图2A），或通过罗丹明 - 鬼笔环肽染色在固定晶状体的细胞膜上对F-肌动蛋白进行染色（图2B）。在正交 （XZ） 投影中，WGA 和 tdTomato/罗丹明-鬼笔环肽染色使我?...

讨论

所描述的方案能够实现晶状体前部和赤道区域周边晶状体结构和细胞的高空间分辨率可视化。在这项研究中，展示了使用完整（动态或固定）镜头可视化镜头周边结构的方法，其中保留了整体 3D 镜头结构。此外，还提供了使用公开可用的FIJI ImageJ软件进行形态定量分析的简单方法。在以前的研究中已经使用了整个安装点的可视化和量化方法。这些方法使我们能够了解前囊和细胞对晶状体形状变化?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R