Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation

Zusammenfassung

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Okularlinse ist ein transparentes, flexibles Gewebe, das seine Form ändert, um Licht aus verschiedenen Entfernungen auf die Netzhaut zu fokussieren. Abgesehen von einer Basalmembran, die das Organ umgibt, der sogenannten Kapsel, ist die Linse vollständig zellulär und besteht aus einer Monoschicht von Epithelzellen auf der vorderen Hemisphäre und einer Masse von Linsenfaserzellen. Im Laufe des Lebens vermehren sich Epithelzellen in der Keimzone am Linsenäquator, und äquatoriale Epithelzellen wandern, verlängern und differenzieren sich zu neu gebildeten Faserzellen. Äquatoriale Epithelzellen verändern die Morphologie von zufällig gepackten Pflastersteinzellen in ausgerichtete sechseckige Zellen, die meridionale Reihen bilden. Neu gebildete Linsenfaserzellen behalten die hexagonale Zellform bei und verlängern sich zum vorderen und hinteren Pol hin, wodurch eine neue Hülle aus Zellen gebildet wird, die über frühere Generationen von Fasern gelegt werden. Über die Mechanismen, die die bemerkenswerte Morphogenese von Linsenepithelzellen zu Faserzellen antreiben, ist wenig bekannt. Um die Struktur, Entwicklung und Funktion von Linsen besser zu verstehen, wurden neue Bildgebungsprotokolle entwickelt, mit denen periphere Strukturen mit ganzen Okularlinsenfassungen abgebildet werden können. Hier werden Methoden zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Epithelzellfläche, der Zellkernfläche und -form, der meridionalen Reihenzellreihenreihung und -packung sowie der Faserzellbreiten gezeigt. Diese Messungen sind unerlässlich, um die zellulären Veränderungen aufzuklären, die während des lebenslangen Linsenwachstums auftreten, und um die Veränderungen zu verstehen, die mit dem Alter oder der Pathologie auftreten.

Einleitung

Die Okularlinse ist ein flexibles, transparentes Gewebe im vorderen Bereich des Auges, das Licht fein auf die Netzhaut fokussiert. Die Funktionsfähigkeit des Objektivs kann zum Teil auf seine komplizierte Architektur und Organisation zurückgeführt werden 1,2,3,4,5,6. Um das Linsengewebe herum befindet sich die Kapsel, eine Basalmembran, die für die Aufrechterhaltung der Linsenstruktur und der biomechanischen Eigenschaften unerlässlich^{ist 7,8,9}. Die Linse selbst ist vollständig zellulär und besteht aus zwei Zelltypen: Epithel- und Faserzellen. Die Epithelschicht besteht aus einer Monoschicht quaderförmiger Zellen, die die vordere Hemisphäre der Linse¹⁰ bedecken. Im Laufe des Lebens vermehren sich die Epithelzellen und wandern entlang der Linsenkapsel in Richtung Linsenäquator. Die vorderen Epithelzellen sind im Querschnitt ruhig und kopfsteingepflastert, und in der Nähe des Linsenäquators proliferieren die Epithelzellen und beginnen den Differenzierungsprozess zu neuen Faserzellen zu durchlaufen^11,12. Äquatoriale Epithelzellen verwandeln sich von zufällig gepackten Zellen in organisierte meridionale Reihen mit sechseckigen Zellen. Die hexagonale Zellform wird auf der basalen Seite dieser differenzierenden Zellen beibehalten, während sich die apikale Seite am Linsendrehpunkt oder Modiolus verengt und verankert 4,13,14,15. Wenn die äquatorialen Epithelzellen beginnen, sich zu neu gebildeten Faserzellen zu verlängern, wandern die apikalen Spitzen der Zellen entlang der apikalen Oberfläche der vorderen Epithelzellen in Richtung des vorderen Pols, während sich die basalen Spitzen entlang der Linsenkapsel in Richtung des hinteren Pols bewegen. Neue Generationen von Faserzellen überlagern frühere Zellgenerationen und bilden kugelförmige Hüllen aus Fasern. Während des Zellverlängerungs- und Reifungsprozesses verändern Faserzellen ihre Morphologie erheblich 11,12,16. Diese Faserzellen bilden den Großteil der Linsenmasse 11,12,16,17,18.

Die molekularen Mechanismen, die zur Etablierung komplizierter Linsenmikrostrukturen, Zellmorphologie und einzigartiger zellulärer Organisation beitragen, sind nicht vollständig bekannt. Darüber hinaus ist der Beitrag der Linsenkapsel und der Zellstruktur zur Gesamtfunktion der Linse (Transparenz, Änderung der Linsenform) unklar. Diese Zusammenhänge werden jedoch mit Hilfe neuer bildgebender Verfahren und quantitativer Bewertungen von strukturellen und zellulären Merkmalen der Linse aufgeklärt 2,4,19,20,21,22. Es wurden neue Protokolle zur Abbildung ganzer Linsen entwickelt, die eine hochauflösende Visualisierung der Linsenkapsel, der Epithelzellen und der peripheren Faserzellen ermöglichen. Dazu gehört die Methodik zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Zellgröße, der Zellkerngröße und -zirkularität, der meridionalen Reihenreihenfolge, der Faserzellpackung und der Faserzellbreite. Diese Visualisierungs- und Bildquantifizierungsmethoden ermöglichen eine eingehende morphometrische Untersuchung und haben Vorteile gegenüber anderen Visualisierungsmethoden (Bildgebung von flachen Halterungen oder Gewebeschnitten), da die gesamte 3D-Gewebestruktur erhalten bleibt. Diese Methoden haben es ermöglicht, neue Hypothesen zu testen und werden weitere Fortschritte im Verständnis der Entwicklung und Funktion von Linsenzellmustern ermöglichen.

Für die folgenden Experimente verwenden wir Wildtyp- und Rosa26-tdTomato-Mäuse Tandem-Dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) im C57BL/6J-Hintergrund im Alter von 6 bis 10 Wochen beiderlei Geschlechts. Die tdTomato-Mäuse ermöglichen die Visualisierung zellulärer Plasmamembranen in lebenden Linsen durch Expression des tdTomato-Proteins, das mit den N-terminalen 8-Aminosäuren eines mutierten MARCKS-Proteins fusioniert ist, das die Plasmamembran über N-terminale Myrisylierung und interne Cystein-Palmitoylierungsstellen anspricht²³. Wir verwenden auch NMIIA^{E1841K/E1841K} Mäuse²⁴ , die ursprünglich von Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) bezogen wurden. Wie bereits beschrieben, werden²⁰ NMIIA^{E1841K/E1841K-Mäuse} im FvBN/129SvEv/C57Bl6-Hintergrund, die einen Verlust des CP49-Kügelchen-Intermediärfilamentproteins aufweisen (die reife Faserzellmorphologie und die Biomechanik der gesamten Linse erhalten), mit C57BL6/J-Wildtyp-Mäusen rückgekreuzt. Wir untersuchten die Nachkommen auf das Vorhandensein des Wildtyp-CP49-Allels.

Die konfokale Bildgebung wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop mit einer 20-fachen (NA = 0,8, Arbeitsabstand = 0,55 mm, 1-facher Zoom), einer 40-fachen (NA = 1,3 Ölobjektiv, Arbeitsabstand = 0,2 mm, 1-facher Zoom) oder einer 63-fachen (NA = 1,4 Ölobjektiv, Arbeitsabstand = 0,19 mm, 1-facher Zoom) Vergrößerung durchgeführt. Alle Bilder wurden mit einer Lochblende aufgenommen, die eine Determinante für die Dicke des optischen Querschnitts ist, bis zu 1 Airy-Einheit (die resultierenden optischen Dicken sind in den Abbildungslegenden angegeben). Die Bilder wurden mit Zen Software bearbeitet. Die Bilder wurden in .tif Format exportiert und dann in die FIJI ImageJ Software (imageJ.net) importiert.

Protokoll

Die Mäuse werden in der Tiereinrichtung der University of Delaware untergebracht und in einer pathogenfreien Umgebung gehalten. Alle Tierbehandlungen, einschließlich der Euthanasie durch CO_{2 -} Inhalation, wurden in Übereinstimmung mit den vom University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierprotokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung und Bildgebung des gesamten Objektivbajonetts

1. Fixierung von Objektiven für die Bildgebung mit ganzem Bajonett
   1. Nach der Euthanasie die Augen enukleieren und die Linsen sezieren, wie zuvor beschrieben²⁵. Nach der Dissektion werden die Linsen sofort in frische 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO 4-7H₂O; pH 7,4) bei Raumtemperatur überführt.
      HINWEIS: Die zelluläre Morphologie kann verändert werden, wenn die Linsen über einen längeren Zeitraum in PBS gelagert werden, daher wird empfohlen, sie sofort innerhalb von ~10 Minuten nach der Dissektion zu reparieren.
   2. Für die Ganzkörper-Bildgebung des vorderen Linsenbereichs fixieren Sie die ganzen Linsen, indem Sie 0,5 ml frisch hergestelltes 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur eintauchen. Nach 30 min die Linsen 3x (5 min pro Waschgang) mit 1x PBS waschen. Fahren Sie mit Schritt 1.2 fort oder lagern Sie es in 1x PBS bei 4 °C. Festsitzende Linsen können bis zu 5 Tage gelagert werden.
   3. Für die Ganzkörper-Bildgebung der Äquatorregion des Objektivs fixieren Sie ganze Linsen, indem Sie 0,5 ml frisch hergestelltes 4%iges PFA in 1x PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur eintauchen. Nach 1 h die Linsen 3x (5 min pro Waschgang) mit 1x PBS waschen. Fahren Sie mit Schritt 1.3 fort oder lagern Sie es in 1x PBS bei 4 °C. Festsitzende Linsen können bis zu 5 Tage gelagert werden.
2. Gesamte Fassung des vorderen Linsenbereichs (fest oder unter Spannung)
   1. Für die Whole-Mount-Bildgebung von festen Objektiven fahren Sie mit Schritt 1.2.3 fort.
   2. Für die Ganzkörper-Bildgebung von lebenden Linsen werden die Linsen in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml Medium 199 (phenolrotfrei) mit 1 % Antibiotikum/Antimykotikum übertragen. Inkubieren Sie die Linsen bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zur Bildgebung. Vor der Bildgebung werden die Linsen mindestens 10 Minuten lang in einer Lösung mit fluoreszenzmarkiertem Weizenkeimagglutinin (WGA-640, 1:500) und Hoechst 33342 (1:500) in Medium 199 inkubiert. Fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.
   3. Um die Linsenkapsel, F-Aktin und die Kerne der festsitzenden Linsen zu färben, legen Sie die Linsen in eine 500-μl-Lösung mit WGA-640 (1:500), Rhodamin-Phalloidin (1:50) und Hoechst 33342 (1:500) in Permeabilisierungs-/Blockierungspuffer (1x PBS mit 0,3 % Triton, 0,3 % Rinderserumalbumin (Fraktion V) und 3 % Ziegenserum) in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Färben Sie die Gläser über Nacht bei 4 °C.
   4. Nach der Inkubation über Nacht die Linsen 3x (5 min pro Spülung) mit 1 ml 1x PBS waschen. Fahren Sie mit den Bildgebungsobjektiven fort.
   5. Um die feste Linse für die konfokale Bildgebung zu stabilisieren, werden Linsenimmobilisierungsdivots in Agarose auf einer Bildgebungsschale erzeugt, wie zuvor beschrieben²¹ (Abbildung 1).
      1. Erhitzen und mischen Sie vorsichtig 2%ige Agarose in PBS in der Mikrowelle, bis sich die Lösung verflüssigt hat. Pipettieren Sie 250 μl verflüssigte 2%ige Agarose in eine Glasbodenschale (Abbildung 1A) und drücken Sie die Agarose mit einem flexiblen Kunststoff-Deckglas auf der Schale flach (Abbildung 1B). Sobald die Agarose abgekühlt und vollständig erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette mit feiner Spitze (Abbildung 1C) und verwenden Sie eine 3-mm-Biopsiestanze, um ein Loch in der Mitte der Schale in die Agarose zu bohren (Abbildung 1D).
      2. Entfernen Sie überschüssige Agarose mit einem vorsichtigen Tuch (Abbildung 1E). Agarose-Schimmelpilz mit 1x PBS hydratisiert und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren. Agarose-Formen wurden bis zu 1 Woche erfolgreich gelagert.
   6. Übertragen Sie die lebende oder fixierte Linse vorsichtig mit einer Embryozange in das Divot in der Agarose (Abbildung 1F), die ~2 ml 1x PBS (feste Linse) oder phenolrotfreies Medium 199 (lebende Linse) enthält, und legen Sie die Schale dann auf einen inversen Mikroskoptisch. Um zu bestätigen, dass sich die Linse so befindet, dass der vordere Bereich dem Objektiv zugewandt ist, visualisieren Sie die Zellkernfärbung. Wenn keine Kerne beobachtet werden, kann es sein, dass der hintere Bereich dem Ziel zugewandt ist.
   7. Um die Linse umzudrehen, verwenden Sie eine gebogene Pinzette und drehen Sie die Linse vorsichtig um ~180°, so dass der vordere Bereich zum Objektiv zeigt. Erfassen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop.
   8. Für die Visualisierung von Linsenkapseln werden Z-Stack-Bilder mit einem 40x-Objektiv mit einer Schrittweite von 0,3 μm aufgenommen. Das erste Bild vor der Oberfläche der Linsenkapsel (angezeigt durch WGA-Färbung) und das letzte Bild nach der apikalen Oberfläche der Epithelzellen aufgenommen. Um Epithelzellen zu visualisieren, werden Z-Stack-Bilder mit einem 63x-Objektiv mit einer Schrittweite von 0,3 μm zur Visualisierung von Linsenepithelzellen aufgenommen.
      HINWEIS: Diese Mikroskopparameter ermöglichen eine adäquate dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Bildern, die für die Bildquantifizierung der Kapseldicke oder der Epithelzellfläche unerlässlich ist. Es ist auch möglich, Nähte in tdTomato-Linsen mit lebenden Linsen abzubilden, indem man an der Epithelzellmonoschicht vorbeibildet, wie zuvor beschrieben⁴.
3. Färbung von Linsen, äquatorialem Epithel und Faserzellen
   1. Fixierte Linsen in eine 0,5-ml-Lösung von Rhodamin-Phalloidin (1:300), WGA-640 (1:250) und Hoechst 33342 (1:500) in Permeabilisierungs-/Blockierungslösung (3 % BSA, 3 % Ziegenserum und 0,3 % Triton) in einem Mikrozentrifugenröhrchen legen. Über Nacht bei 4 °C halten.
   2. Nach der Inkubation über Nacht die Linsen 3x in 1 ml 1x PBS (5 Minuten pro Spülung) waschen.
   3. Erzeugen Sie Agarose-Keile für die Linsenimmobilisierung, wie zuvor beschrieben ^4,10.
      1. Kurz gesagt, erzeugen Sie Agarosespalten in Schalen mit Glasboden (FD35-100, WPI), indem Sie ~5-6 ml geschmolzene 2%ige Agarose in 1x PBS in Schalen gießen (Abbildung 2A). Sobald die Agarose erstarrt ist (Abbildung 2B), erstellen Sie mit einer scharfen Klinge ein dreieckiges Divot (Abbildung 2C). Entfernen Sie den Agarosespalt und geben Sie 1 ml 1x PBS in die Agaroseschale (Abbildung 2D).
      2. Saugen Sie alle Agarosereste ab, die beim Schneiden der Agarose zurückbleiben könnten. Pro Schale können mehrere Keile erstellt werden, die für mehrere verschiedene Größen von Linsen geeignet sind (nicht abgebildet). Um die Agaroseform aufzubewahren, geben Sie 1 ml 1x PBS auf die Agaroseform und bewahren Sie sie bei 4 °C auf. Keile sind bis zu 1 Woche haltbar.
   4. Platzieren Sie die Linse mit einer gebogenen Pinzette in einem Agarosekeil, der 1 ml 1x PBS enthält, und stellen Sie sie so ein, dass der äquatoriale Bereich der Linse nach unten auf das Mikroskopglas über dem konfokalen Objektiv zeigt (Abbildung 2E-F). Um zu bestätigen, dass die Äquatorregion im Fokus steht, visualisieren Sie die Kerne und stellen Sie sicher, dass die Kerne in Reihen am Äquator ausgerichtet sind. Auch die äquatorialen Epithelzellen können identifiziert werden, da sie unregelmäßig gepackt und geformt sind. Außerdem sind die meridionalen Reihenzellen präzise ausgerichtet und hexagonal geformt, was durch F-Aktin-Färbung an den Zellmembranen angezeigt wird.
   5. Wenn die Kerne im Gesichtsfeld zufällig gepackt sind, ist die vordere Seite der Linse dem Objektiv zugewandt. Wenn Kerne nicht beobachtet werden können, dann ist die hintere Seite der Linse höchstwahrscheinlich dem Objektiv zugewandt. Wenn die Linse nicht auf ihrem Äquator sitzt, richten Sie die Linse neu aus und verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Linse zu drehen, bis die genau ausgerichteten Kerne am Äquator der Linse beobachtet werden.
   6. Abbildung der äquatorialen Epithel- und Faserzellen der Linse mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (20-fach-Objektiv, NA = 0,8, Schrittweite 0,5 μm und/oder 40-faches Ölobjektiv, NA = 1,3, Schrittweite 0,4 μm). Drehen Sie die Bilder vor der Z-Stapel-Sammlung, in der sich die äquatorialen Epithelzellen oben befinden, gefolgt von den meridionalen Reihen- und Faserzellen direkt darunter.

2. Methodik der Bildanalyse

1. Dickenmessung der Linsenkapsel
   1. Unter Verwendung von Z-Stack-Bildern, die mit einem 40-fachen Objektiv (0,3 μm Schrittweite) von entweder lebenden tdTomato-Linsen, die mit WGA markiert sind, oder festen Linsen, die mit WGA und Rho-Phalloidin markiert sind, aufgenommen wurden, erhalten Sie eine optische 2D-Projektion in der XZ-Ansicht der 3D-Rekonstruktion und speichern im .tif-Format. Verarbeiten Sie Bilder mit der Zen-Software.
   2. Öffnen Sie XZ-Slice-Bilder (.tif) in der FIJI ImageJ-Software.
   3. Um die Dicke der Linsenkapsel zu messen, verwenden Sie die Geradenfunktion (siehe Abbildung 3A,B). Legen Sie die Linienbreite auf 50 Pixel fest, indem Sie > Optionen bearbeiten > Linienbreite auswählen. Diese Linienbreite wurde empirisch bestimmt, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis mit den Mikroskopeinstellungen zu erreichen. Die optimale Linienbreite kann bei anderen Mikroskopen/Mikroskopeinstellungen oder bei Verwendung von Objektiven anderer Spezies abweichen. Ziehen Sie als Nächstes eine Linie von der Oberseite der Kapsel bis unter die Basalregion der Epithelzellen.
   4. Speichern Sie die Zeile als Interessenbereich, indem Sie Strg + T drücken.
   5. Trennen Sie Kanäle in Registerkarten für Bild-, Farb- und Teilungskanäle.
   6. Messen Sie die Intensität entlang der Linie für den Kapselkanal, indem Sie Strg + K drücken.
   7. Zeichnen Sie in einer Tabelle die Intensitätswerte als Funktion der Entfernung auf und bestimmen Sie die Intensitätsspitzen für die Kapsel und das F-Aktin, die die Kapseloberfläche bzw. die Basalregion von Epithelzellen darstellen. Auf der x-Achse befindet sich der Linienabstand.
   8. Berechnen Sie als Nächstes die Kapseldicke, indem Sie den Abstand zwischen den Intensitätsspitzen der Kapsel und des Epithels bestimmen (Abbildung 3C, D).
2. Analyse der Zellfläche
   1. Analysieren Sie unter Verwendung von Z-Stapel-Bildern, die mit einem 63-fach-Objektiv (NA = 1,4; 0,3 μm Schrittweite) auf lebenden tdTomato-Linsen oder mit Phalloidin markierten festen Linsen aufgenommen wurden, einen XY-Ansichtsschnitt aus einem konfokalen Z-Stapel-Bild, das der Stelle entspricht, an der sich die mittlere (laterale) Region der Epithelzellen im Fokus befindet. Beachten Sie, dass die lateralen Membranen mit dem tdTomato-Membranfarbstoff oder durch Visualisierung von Phalloidin, das an den lateralen Zellmembranen vorhanden ist, sichtbar sind.
      HINWEIS: Aufgrund der Krümmung des Objektivs (wie in einer XZ-Ansicht zu sehen; Abbildung 4A-C), sind nicht alle Epithelzellen im Bild scharf. Der mittlere Bereich des Epithels entspricht dem Bereich, in dem sowohl die seitlichen Zellmembranen (Abbildung 4D-E) als auch die Zellkerne (Abbildung 4G-I) im Fokus stehen.
   2. Exportieren Sie das Bild als .tif und öffnen Sie es in FIJI ImageJ.
   3. Um den Maßstab in FIJI ImageJ für die Analyse festzulegen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie zu erstellen, die die Länge einer Maßstabsleiste aus dem konfokalen Bild hat.
   4. Notieren Sie die Pixellänge der Linie und die Länge der Maßstabsleiste. Wechseln Sie im Menü der Symbolleiste zu Analysieren, und wählen Sie Maßstab festlegen aus. Geben Sie die Anzahl der Pixel, d. h. die Länge der Linie, in Abstand in Pixel ein, und geben Sie in der bekannten Entfernung die bekannte Länge der Maßstabsleiste ein.
   5. Wenn Sie die tdTomato- oder Rhodamin-Phalloidin-Färbung als Hinweis auf die Zellgrenzen verwenden, umreißen Sie manuell eine Population von Zellen, die im Bild scharf sind, mit dem polygonalen Werkzeug. Verfolgen Sie nur Zellen, bei denen laterale Membranen sichtbar sind (Abbildung 4E), und vermeiden Sie es, teilweise sichtbare Zellen (d. h. am Rand der Bilder) zu verfolgen. Speichern Sie ROI, indem Sie Strg+T drücken. Wechseln Sie im Menü der Symbolleiste zu Bearbeiten, und wählen Sie Außen löschen aus. Messen Sie nun die Gesamtzellenfläche (ROI), indem Sie Strg + M in FIJI ImageJ drücken.
   6. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellenfläche, indem Sie die ROI-Fläche durch die Gesamtzahl der Zellen dividieren. Eine einfache Möglichkeit, die Anzahl der Zellen zu bestimmen, besteht darin, die Anzahl der Zellkerne zu zählen. Gehen Sie zum Kernkanal (blau). Wählen Sie im Menü ROI die gespeicherte ROI-Kontur der Zellen aus (Abbildung 4G). Löschen Sie außerhalb der ROI, indem Sie zu Bearbeiten wechseln und dann auf Außerhalb löschen klicken (Abbildung 4H). Zählen Sie mit dem Mehrpunkt-Werkzeug die Kerne, indem Sie auf einzelne Kerne klicken.
3. Analyse der Zellkernfläche und -form
   1. Für die Analyse der Zellkernfläche und -form analysieren Sie einen optischen Schnitt der XY-Ebene aus einem konfokalen Z-Stapelbild, das der Stelle entspricht, an der sich die mittlere (laterale) Region der tdTomato-Epithelzellen im Fokus befindet. Analysieren Sie einen Z-Stapel-Schnitt aus einem konfokalen Bild, bei dem die Kernfläche am größten ist (Abbildung 5A). Dies stellt den mittleren Teil der Kerne dar.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass aufgrund der Krümmung der Linse nicht alle Kerne scharf sind, wie in der XZ-Ansicht zu sehen ist (Abbildung 4G und Abbildung 5A).
   2. Wählen Sie eine Teilpopulation von Kernen aus, die im Fokus stehen, und sparen Sie einen ROI.
   3. Verwenden Sie die Funktion "Außen löschen ". Zeichnen Sie innerhalb der ROI mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug (vierte Menüschaltfläche von links) vorsichtig die Grenzen der Kerne nach (Abbildung 5B). Speichern Sie jede nukleare Ablaufverfolgung im ROI-Fenster, indem Sie STRG+T drücken. Umrisskerne nur dort, wo die kompletten Kerne zu sehen sind und sich die Kerne nicht berühren.
   4. Sobald alle Kerne umrissen sind, messen Sie die Kernfläche und -form der einzelnen Zellen (d. h. die Kreisförmigkeit), indem Sie Strg+M drücken.
   5. Kopieren Sie Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, und berechnen Sie die durchschnittliche Kernfläche und die Zirkularität (Abbildung 5C).
4. Meridionale Reihenepithelpackung
   1. Um die meridionale Reihenstörung zu messen, nehmen Sie Bilder mit einem 20-fachen Objektiv (0,5 μm Schrittweite) auf.
   2. Identifizieren Sie den Drehpunkt/Modiolus der Linse auf Bildern. Der Drehpunkt ist die Region, in der sich die apikalen Spitzen der sich verlängernden Epithelzellen verengen, um einen Ankerpunkt während der anfänglichen Differenzierung und Verlängerung der Faserzellen am Äquator zu bilden. Identifizieren Sie den Drehpunkt anhand der hellen F-Aktin-Intensität (in Abbildung 6A durch eine Pfeilspitze gekennzeichnet; in Abbildung 6B durch eine rote gestrichelte Linie gekennzeichnet) und der Änderung der zellulären Organisation in einem einzelnen optischen Schnitt in der XY-Ansicht.
      ANMERKUNG: Darüber hinaus ist die F-Aktin-Färbung sowohl der basalen als auch der apikalen Regionen von Epithelzellen oberhalb des Drehpunkts sichtbar, während nur der basale Bereich der länglichen Zellen unterhalb des Drehpunkts sichtbar ist (Abbildung 6A). Die Epithelzellen oberhalb der Drehpunktlinie sind unregelmäßig gepackt und neigen zur Bildung von Rosetten, während die Faserzellen unterhalb des Drehpunkts in parallelen Reihen angeordnet sind, was durch eine helle F-Aktin-Färbung an der Membran angezeigt wird (Abbildung 6B).
   3. Sobald der Drehpunkt bei 2 Monate alten Mäusen identifiziert ist, wählen Sie den einzelnen optischen Schnitt ~4,5-5 μm peripher zum Drehpunkt (in Richtung der Linsenkapsel) in der XY-Ebene. Dieser Abstand wird aufgrund der Beobachtung gewählt, dass alle Kerne der meridionalen Reihenzellen bei 2 Monate alten Mäusen im Fokus sind, wenn sie ~5 μm peripher zum Drehpunkt sind. Speichern Sie den einzelnen optischen Abschnitt (.tif). Öffnen Sie das Bild auf FIJI.
      HINWEIS: Diese Analyse wurde nur an 2 Monate alten Mäusen durchgeführt und daher kann nicht festgestellt werden, ob sich dieser Abstand mit dem Alter ändert.
   4. Bevor Sie die Bildanalyse durchführen, stellen Sie den Maßstab in ImageJ mit Schritt 2.2.2 auf μm ein.
   5. Umreißen Sie manuell die gesamten meridionalen Reihenbereiche mit dem Freihandlinienwerkzeug (Region of Interest/ROI), indem Sie die Kernausrichtung identifizieren, wie in Abbildung 7A dargestellt. Speichern Sie ROI, indem Sie Strg+T drücken. Wechseln Sie im Menü der Symbolleiste zu Bearbeiten, und wählen Sie Außen löschen aus. Messen Sie die Gesamtzellenfläche (ROI), indem Sie Strg + M in FIJI ImageJ drücken.
   6. Identifizieren Sie alle Bereiche der Störung, die durch F-Aktin-Färbung angezeigt werden, indem Sie sie mit dem Freihandlinienwerkzeug in FIJI ImageJ umreißen. Zu den Kriterien für ungeordnete Regionen gehören die Verzweigung der Reihen, die unregelmäßige Packung und die Fehlausrichtung der Reihen (Abbildung 7B), wie zuvor gezeigt²⁰.
   7. Messen Sie den umrissenen ungeordneten Bereich/geflickt, indem Sie Strg + M in FIJI ImageJ drücken. Summieren Sie den gesamten ungeordneten Bereich in einer Tabelle.
   8. Teilen Sie die gesamte ungeordnete Fläche durch die ROI-Fläche und multiplizieren Sie sie dann mit 100, um einen Prozentsatz der ungeordneten Fläche zu erhalten. Wenn keine Störung beobachtet wird, legen Sie einen Wert von 0 % für den gestörten Bereich fest.
5. Meridionale Zeilenanzahl benachbarter Zellen
   1. Um die Anzahl der benachbarten Zellen zu messen, verwenden Sie F-Aktin-gefärbte Bilder, die mit einem 40-fachen Ölobjektiv (0,4 μm Schrittweite) aufgenommen wurden.
   2. Identifizieren Sie einen optischen Schnitt (XY-Ebene) in der basalen Region der meridionalen Reihenzellen nach innen von der Linsenkapsel, wo F-Aktin um den gesamten Umfang der meridionalen Reihenzellen angereichert ist, alle meridionalen Reihenzellen sind im Fokus und befinden sich auf derselben Ebene.
   3. Zählen Sie die Anzahl der benachbarten Zellen, die jede meridionale Zeilenzelle aufweist (Abbildung 8). Messen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz von Zellen mit sechs benachbarten Zellen in einer Tabelle.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Anzahl der benachbarten Zellen mit einem 20-fachen Ziel. Allerdings ist es mit einem 40x-Objektiv deutlich einfacher, die Sechseckform zu beobachten.
6. Bildanalyse äquatorialer Faserzellen
   1. Nehmen Sie konfokale Z-Stack-Bilder von Rhodamin-Phalloidin-gefärbten Linsen mit einem 20-fach-Objektiv (0,5 μm Schrittweite) auf.
   2. Bestimmen Sie den Drehpunkt wie in Schritt 2.4.2 angegeben. Sobald der Drehpunkt identifiziert ist, wählen Sie einen einzelnen optischen Schnitt aus. Zu Standardisierungszwecken und zum Vergleich zwischen Linsen quantifizieren Sie die Faserzellbreiten ~10 μm vom Drehpunkt in der XY-Ebene nach innen (Abbildung 9A).
   3. Exportieren Sie RAW-Bilder in FIJI ImageJ. Ziehen Sie in FIJI ImageJ eine Linie (normalerweise ~300-400 μm lang) über mehrere benachbarte Faserzellen, um den Abstand zwischen F-Aktin-gefärbten Peaks zu messen (Zeilenscan-Analyse; Abbildung 9A; rosa Linie).
   4. Ermitteln Sie die Fluoreszenzintensität über den Zeilenabtastabstand in FIJI, indem Sie Strg+K drücken. Exportieren Sie als Nächstes Daten in die Tabelle, um die Entfernung zwischen den Spitzen zu berechnen (Beispiel in Abbildung 9A-B). Dies entspricht Faserzellbreiten.

Ergebnisse

Vordere Linsenkapsel, Epithelzellbereich und Kernbereich
Um die Dicke der Linsenkapsel zu analysieren, färbten wir Linsenkapseln entweder in lebenden oder festen Linsen mit WGA. Wir identifizierten Linsenepithelzellen durch Markierung von Membranen mit tdTomato in lebenden Linsen (Abbildung 2A) oder durch Rhodamin-Phalloidin-Färbung für F-Aktin an den Zellmembranen in fixierten Linsen (Abbildung 2B). In einer orthogonalen (XZ) Projektion e...

Diskussion

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen eine hochauflösende Visualisierung von peripheren Linsenstrukturen und -zellen im vorderen und äquatorialen Bereich der Linse. In dieser Studie wurden Methoden zur Visualisierung von Linsenperipheriestrukturen mit intakten (lebenden oder festsitzenden) Linsen gezeigt, bei denen die gesamte 3D-Linsenarchitektur erhalten bleibt. Darüber hinaus wurden einfache Methoden zur morphometrischen quantitativen Analyse mit der öffentlich zugänglichen Software FIJI ImageJ bereitgestellt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R