Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation

Zusammenfassung

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Okularlinse ist ein transparentes, flexibles Gewebe, das seine Form ändert, um Licht aus verschiedenen Entfernungen auf die Netzhaut zu fokussieren. Abgesehen von einer Basalmembran, die das Organ umgibt, der sogenannten Kapsel, ist die Linse vollständig zellulär und besteht aus einer Monoschicht von Epithelzellen auf der vorderen Hemisphäre und einer Masse von Linsenfaserzellen. Im Laufe des Lebens vermehren sich Epithelzellen in der Keimzone am Linsenäquator, und äquatoriale Epithelzellen wandern, verlängern und differenzieren sich zu neu gebildeten Faserzellen. Äquatoriale Epithelzellen verändern die Morphologie von zufällig gepackten Pflastersteinzellen in ausgerichtete sechseckige Zellen, die meridionale Reihen bilden. Neu gebildete Linsenfaserzellen behalten die hexagonale Zellform bei und verlängern sich zum vorderen und hinteren Pol hin, wodurch eine neue Hülle aus Zellen gebildet wird, die über frühere Generationen von Fasern gelegt werden. Über die Mechanismen, die die bemerkenswerte Morphogenese von Linsenepithelzellen zu Faserzellen antreiben, ist wenig bekannt. Um die Struktur, Entwicklung und Funktion von Linsen besser zu verstehen, wurden neue Bildgebungsprotokolle entwickelt, mit denen periphere Strukturen mit ganzen Okularlinsenfassungen abgebildet werden können. Hier werden Methoden zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Epithelzellfläche, der Zellkernfläche und -form, der meridionalen Reihenzellreihenreihung und -packung sowie der Faserzellbreiten gezeigt. Diese Messungen sind unerlässlich, um die zellulären Veränderungen aufzuklären, die während des lebenslangen Linsenwachstums auftreten, und um die Veränderungen zu verstehen, die mit dem Alter oder der Pathologie auftreten.

Einleitung

Die Okularlinse ist ein flexibles, transparentes Gewebe im vorderen Bereich des Auges, das Licht fein auf die Netzhaut fokussiert. Die Funktionsfähigkeit des Objektivs kann zum Teil auf seine komplizierte Architektur und Organisation zurückgeführt werden 1,2,3,4,5,6. Um das Linsengewebe herum befindet sich die Kapsel, eine Basalmembran, die für die Aufrechterhaltung der Linsenstruktur und der biomechanischen Eigenschaften unerlässlich^ist ....

Protokoll

Die Mäuse werden in der Tiereinrichtung der University of Delaware untergebracht und in einer pathogenfreien Umgebung gehalten. Alle Tierbehandlungen, einschließlich der Euthanasie durch CO_{2 -} Inhalation, wurden in Übereinstimmung mit den vom University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierprotokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung und Bildgebung des gesamten Objektivbajonetts

1. Fixierung von Objektiven für die Bildgebung mit ganzem Bajonett
   1. Nach der Euthanasie die Augen enukleieren und die Linsen sezieren, wie zuvor beschrieben²⁵. N....

Diskussion

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen eine hochauflösende Visualisierung von peripheren Linsenstrukturen und -zellen im vorderen und äquatorialen Bereich der Linse. In dieser Studie wurden Methoden zur Visualisierung von Linsenperipheriestrukturen mit intakten (lebenden oder festsitzenden) Linsen gezeigt, bei denen die gesamte 3D-Linsenarchitektur erhalten bleibt. Darüber hinaus wurden einfache Methoden zur morphometrischen quantitativen Analyse mit der öffentlich zugänglichen Software FIJI ImageJ bereitgestellt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R