JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخراج السم من Trichogramma dendrolimi باستخدام مضيف اصطناعي تم إنشاؤه باستخدام فيلم البولي إيثيلين ومحلول الأحماض الأمينية.

Abstract

الدبابير الطفيلية هي مجموعة متنوعة من حشرات غشاء البكارة التي تعمل كموارد لا تقدر بثمن للمكافحة الحيوية للآفات. لضمان التطفل الناجح ، تقوم الدبابير الطفيلية بحقن السم في مضيفيها لقمع مناعة مضيفيها ، وتعديل نمو المضيفين ، والتمثيل الغذائي ، وحتى السلوك. مع أكثر من 600000 نوع تقديري ، فإن تنوع الدبابير الطفيلية يفوق تنوع السامة الأخرى ، مثل الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب. سم الدبابير الطفيلي هو مصدر غير مستكشف للجزيئات النشطة بيولوجيا مع تطبيقات محتملة في مكافحة الآفات والطب. ومع ذلك ، فإن جمع سم الطفيليات يمثل تحديا بسبب عدم القدرة على استخدام التحفيز المباشر أو الكهربائي وصعوبة التشريح بسبب صغر حجمها. Trichogramma هو جنس من الدبابير الطفيلية الصغيرة (~ 0.5 مم) التي تستخدم على نطاق واسع للمكافحة البيولوجية للآفات lepidopteran في كل من الزراعة والغابات. هنا ، نبلغ عن طريقة لاستخراج السم من T. dendrolimi باستخدام مضيفات اصطناعية. يتم إنشاء هذه العوائل الاصطناعية مع فيلم البولي ايثيلين ومحاليل الأحماض الأمينية ومن ثم تلقيح مع الدبابير Trichogramma للتطفل. تم جمع السم وتركيزه في وقت لاحق. تتيح هذه الطريقة استخراج كميات كبيرة من سم Trichogramma مع تجنب التلوث من الأنسجة الأخرى الناتجة عن التشريح ، وهي مشكلة شائعة في بروتوكولات تشريح خزان السم. يسهل هذا النهج المبتكر دراسة سم Trichogramma ، مما يمهد الطريق لأبحاث جديدة وتطبيقات محتملة.

Introduction

الدبابير الطفيلية هي حشرات غشاء البكارة الطفيلية التي تعد موارد مهمة للمكافحة البيولوجية1. هناك مجموعة واسعة من الدبابير الطفيلية ، مع أكثر من 600000 نوع تقديري2. يتجاوز تنوع الدبابير الطفيلية بكثير تنوع المفصليات السامة الأخرى ، مثل الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب والعقارب والنحل. السم هو عامل طفيلي مهم في الدبابير الطفيلية. من أجل التطفل الناجح ، يتم حقن السم في المضيف ، مما يؤدي إلى تعديل سلوك المضيف والمناعة والتطور والتمثيل الغذائي3. علاوة على ذلك ، يظهر سم الدبابير الطفيلية تنوعا ملحوظا في هياكلها الجزيئية وأهدافها ووظائفها ، مما يعكس التطور المشترك المعقد مع مضيفيها. وبالتالي ، فإن السم الطفيلي هو مورد قيم وغير مقدر من الجزيئات النشطة لأغراض مبيدات الحشرات أو الطبية4. على عكس سم الثعابين والقواقع المخروطية والعناكب والعقارب والنحل ، لا يمكن جمع سم الدبابير الطفيلية عن طريق التحفيز المباشر أو التحفيز الكهربائي5. الطريقة الحالية لاستخراج سم الطفيلي هي تشريح خزان السم. ومع ذلك ، غالبا ما تكون الدبابير الطفيلية صغيرة ، ويتطلب تشريح الدبابير الطفيلية مهارات تقنية عالية. لذلك ، إذا تمكنا من إيجاد طريقة لجمع سم الدبابير الطفيلية بكفاءة وسهولة ، فسيكون من المفيد جدا البحث عن سم الدبابير الطفيلية.

Trichogramma (غشائيات الأجنحة: Trichogrammatidae) هو جنس من الدبابير الطفيلية الصغيرة (~ 0.5 مم)6. هذه الدبابير هي من بين عوامل المكافحة الحيوية الأكثر استخداما على نطاق واسع ، ولا سيما استهداف بيض مختلف الآفات حرشفية الأجنحة في كل من الزراعة والغابات. على سبيل المثال ، تم تطبيق T. dendrolimi ، أحد أكثر أنواع Trichogramma استخداما في الصين ، على نطاق واسع لمكافحة مجموعة متنوعة من الآفات الزراعية والحرجية ، مثل Dendrolimus superans و Ostrinia furnacalis و Chilo suppressalis. أظهرت الدراسات السابقة أن الدبابير Trichogramma يمكن أن تحقن بيضها في مضيفات اصطناعية7. يمكن إنشاء مضيفات اصطناعية باستخدام مواد مثل الشمع8 والأجار9 و Parafilm10 والفيلم البلاستيكي11. يمكن أن يكون الحل في العوائل الاصطناعية التي تحفز وضع البيض الكافي ل Trichogramma بسيطا ، مثل الأحماض الأمينية أو الأملاح غير العضوية12. استنادا إلى خاصية أن T. dendrolimi يمكن أن تتطفل على المضيفين الاصطناعيين ، توفر هذه الدراسة طريقة جديدة لاستخراج السم من الدبابير الطفيلية باستخدام مضيفات اصطناعية. يهدف هذا النهج إلى معالجة أوجه القصور في انخفاض الغلة ، وانخفاض النقاء ، والقابلية للتلوث في تقنيات الاستخراج الحالية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن استخراج كمية كبيرة من السم عالي النقاء من T. dendrolimi ، والذي يلبي احتياجات البحث العلمي وفحص الجزيئات النشطة بيولوجيا لأغراض مبيدات الحشرات أو الطبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تربية الحشرات

  1. تغذية Corcyra cephalonica على دقيق الذرة عند درجة حرارة 26 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية من 40 ٪ ± 10 ٪.
  2. سلالة T. dendrolimi من حشرة جيلين في الداخل باستخدام بيض Corcyra cephalonica كمضيفين. تغذية دبور البالغين 10٪ ماء السكروز في أنابيب ذبابة الفاكهة عند درجة حرارة 26 ± 1 درجة مئوية ، الرطوبة النسبية 70٪ ± 10٪ ، الضوء (L): الظلام (D) فترة 14 ساعة: 10 ساعات.

2. إعداد بطاقات البيض فيلم البولي ايثيلين البلاستيك

  1. خذ فيلم بلاستيكي من البولي إيثيلين بطول 16 سم وعرض 12 سم وسمك 20 ميكرومتر. اضغط على 30 نتوءا نصف دائري بقطر 2-3 مم وارتفاع حوالي 3 مم باستخدام قضيب طحن زجاجي وفقا لتخطيط لوحة PCR القياسي المكون من 96 فتحة.
    ملاحظة: يجب أن تتم عملية الضغط على 30 نتوءا نصف دائري باستخدام قضيب طحن زجاجي مع الانتباه إلى الضغط لأن الضغط الشديد سيؤدي إلى ثقب البلاستيك وتلوث قضيب الطحن الخالي من السم المستخرج.
  2. تطهير فيلم البلاستيك البولي ايثيلين المضغوط عن طريق تعريض كلا الجانبين للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 1 ساعة.
  3. أضف كمية صغيرة من كحول البولي فينيل بنسبة 10٪ إلى السطح نصف الدائري.

3. تطفل الترايكوجراما الشجري

  1. بعد تخدير CO2 ، ضع الدبابير الإناث T. dendrolimi في صندوق تجميع ، وكان عدد الدبابير ~ 3000.
  2. ضع الجانب المحدب من بطاقة بيضة الفيلم باتجاه صندوق التجميع وقم بتأمين الحواف بشريط مطاطي.
  3. أضف 4 ميكرولتر من محلول الأحماض الأمينية (6 جم / لتر ليوسين ، 4 جم / لتر فينيل ألانين ، 4.25 جم / لتر هستيدين) إلى كل نتوء نصف دائري. قم بتغطيته بغشاء بلاستيكي مسطح من البولي إيثيلين بطول 16 سم وعرض 12 سم. استخدم شريطا مطاطيا لتغطية صندوق التجميع بإحكام بصفحتين من البلاستيك.
  4. دع الدبابير T. dendrolimi تتطفل بحرية لمدة 4-8 ساعات وتوفر 10٪ من ماء السكروز من خلال القطن المبلل.

4. جمع سم T. dendrolimi

  1. احصل على محلول الأحماض الأمينية المتطفل من النتوء الداخلي لبطاقة البيض الاصطناعية وانقله إلى غطاء أنابيب سعة 1.5 مل.
  2. قم بتغطية غطاء الأنبوب بشبكة نايلون 10 ميكرومتر بقطر 25 مم ، واربط شبكة النايلون وأنبوب الطرد المركزي بإحكام. ضع أنبوب الطرد المركزي في وضع مستقيم للطرد المركزي القصير باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (1360 × جم) لمدة 10 ثوان واجمع المحلول المصفى (~ 100 ميكرولتر من سم T. dendrolimi ).
  3. قم بقياس تركيز سم T. dendrolimi الذي تم جمعه باستخدام مجموعة مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA) (جدول المواد).
  4. قم بتخزين السم في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.

5. تحليلات SDS-PAGE

  1. أضف 30 ميكرولتر من سم T. dendrolimi إلى 10 ميكرولتر من 4x صوديوم دوديسيل سلفات-بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) مخزن تحميل عينة (جدول المواد) وسخنه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. قم بإجراء تشغيل جل SDS-PAGE عند 130 فولت لمدة 120 دقيقة.
  3. قم بتلطيخ وإزالة لون جل SDS-PAGE باستخدام جهاز تلطيخ البروتين (جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم قياس تركيز البروتين لعينات السم التمثيلية باستخدام مجموعة مقايسة البروتين ، مع عرض النتائج في الجدول 1. أظهرت النتائج أن تركيز بروتين السم الذي تم جمعه بهذه الطريقة تراوح من 0.35 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 0.46 ميكروغرام / ميكرولتر ، في حين أن السيطرة السلبية على محلول الأحماض الأمين...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا ، نقدم طريقة لاستخراج السم من T. dendrolimi باستخدام مضيفات اصطناعية. النقاط الرئيسية في تجربة جمع السم هي كما يلي. (1) أثناء التحضير ، يجب تخدير T. dendrolimi بسرعة بتركيز مناسب من CO2. إذا كان تركيز CO2 منخفضا جدا ، فلن يكون كافيا لتخدير Trichogramma بسرعة. على العكس من ذلك ، إذا كا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه ولا مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ونعرب عن تقديرنا للدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هاينان (المنحة رقم 323QN262)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31701843 و 32172483)، وصندوق جيانغسو للابتكار في مجال العلوم والتكنولوجيا الزراعية (المنحة رقم. CX (22) 3012 و CX (21) 3008) ، ومؤسسة "Shuangchuang Doctor" بمقاطعة Jiangsu (المنحة رقم 202030472) ، وصندوق بدء تشغيل جامعة نانجينغ الزراعية (المنحة رقم 804018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μm Nylon NetMilliporeNY1002500For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcoholAladdinP139533For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose waterSinopharm Chemical Reagent 10021463Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading bufferAce HardwareB23010301SDS-PAGE
Collection boxDeli8555Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)Ace HardwareJ70236502XSDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatusGenScriptL00753SDS-PAGE
Glass grinding rod  Applygentb6268Semicircular protrudations 
L- LeucineSolarbioL0011Artificial host components
L-HistidineAladdinA2219458Artificial host components
L-PhenylalanineSolarbioP0010Artificial host components
Mini-CentrifugesScilogexD1008Centrifuge
MOPS-SDS running bufferAce HardwareB23021SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kitShanghai Yamay Biomedical Technology ZJ102For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holesThermo FisherAB1400LSemicircular protrudations 
Polyethylene plastic filmSuzhou Aopang Trading  001c5427Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)YiFeiXue BiotechYWB007SDS-PAGE
Rubber bandGuangzhou qianrui biology science and technology009Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round holeSangon BiotechF504416-0001Semicircular protrudations 

References

  1. Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
  2. Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
  3. Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
  4. Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
  5. Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
  6. Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
  7. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
  8. Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568(1982).
  9. Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
  10. Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
  11. Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
  12. Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
  13. Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
  14. Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
  15. Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Trichogramma dendrolimi Trichogramma Lepidopteran

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved