Извлечение яда из паразитоидной осы Trichogramma dendrolimi с использованием искусственного хозяина

Резюме

Здесь мы представляем протокол извлечения яда из Trichogramma dendrolimi с использованием искусственного хозяина, созданного с помощью полиэтиленовой пленки и раствора аминокислоты.

Аннотация

Паразитоидные осы представляют собой разнообразную группу перепончатокрылых насекомых, которые служат бесценными ресурсами для биоборьбы с вредителями. Чтобы обеспечить успешный паразитизм, паразитоидные осы впрыскивают яд своим хозяевам, чтобы подавить иммунитет своих хозяев, модулировать их развитие, метаболизм и даже поведение. Насчитывая более 600 000 видов, разнообразие паразитоидных ос превосходит разнообразие других ядовитых животных, таких как змеи, конусные улитки и пауки. Яд паразитоидной ос является малоизученным источником биологически активных молекул с потенциальными применениями в борьбе с вредителями и медицине. Тем не менее, сбор паразитоидного яда затруднен из-за невозможности использования прямой или электрической стимуляции и трудности вскрытия из-за их небольшого размера. Трихограмма - это род крошечных (~0,5 мм) яиц паразитоидных ос, которые широко используются для биологической борьбы с чешуекрылыми вредителями как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Здесь мы сообщаем о методе извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Этих искусственных хозяев создают с помощью полиэтиленовой пленки и растворов аминокислот, а затем прививают осам трихограммы от паразитизма. Впоследствии яд собирали и концентрировали. Этот метод позволяет извлекать большое количество яда трихограммы , избегая при этом загрязнения других тканей, вызванного вскрытием, что является распространенной проблемой в протоколах вскрытия резервуаров яда. Этот инновационный подход облегчает изучение яда трихограммы , прокладывая путь для новых исследований и потенциальных применений.

Введение

Паразитоидные осы являются паразитическими перепончатокрылыми насекомыми, которые являются важными ресурсами для биологического контроля¹. Существует большое разнообразие паразитоидных ос, насчитывающее более 600 000^видов2. Разнообразие паразитоидных ос намного превосходит разнообразие других ядовитых членистоногих, таких как змеи, конусные улитки, пауки, скорпионы и пчелы. Яд является важным паразитарным фактором паразитоидных ос. При успешном паразитизме яд вводится в организм хозяина, модулируя его поведение, иммунитет, развитие и метаболизм³. Кроме того, яд паразитоидных ос демонстрирует удивительное разнообразие в своих молекулярных структурах, мишенях и функциях, что отражает сложную коэволюцию с их хозяевами. Таким образом, паразитоидный яд является ценным и недооцененным ресурсом активных молекул для инсектицидных или медицинских целей⁴. В отличие от яда змей, конусных улиток, пауков, скорпионов и пчел, яд паразитоидных ос не может быть собран прямой стимуляцией или^{электростимуляцией.} Современный метод извлечения яда паразитоидных ос заключается в вскрытии резервуара яда. Однако паразитоидные осы часто бывают мелкими, и вскрытие паразитоидных ос требует высоких технических навыков. Поэтому, если мы сможем найти способ эффективно и удобно собирать яд паразитоидных ос, это будет большим подспорьем для исследования яда паразитоидных ос.

Trichogramma (лат. Trichogrammatidae) — род мелких (~0,5 мм длиной) паразитоидных ос⁶. Эти осы являются одними из наиболее широко используемых агентов биоконтроля, особенно нацеленных на яйца различных чешуекрылых вредителей как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Например, T. dendrolimi, один из наиболее широко используемых видов Trichogramma в Китае, широко применяется для борьбы с различными сельскохозяйственными и лесными вредителями, такими как Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis и Chilo suppressalis. Предыдущие исследования показали, что осы Trichogramma могут вводить свои яйца в искусственных хозяев⁷. Искусственные хозяева могут быть созданы с использованием таких материалов, как воск⁸, агар⁹, парапленка¹⁰ и пластиковая пленка¹¹. Раствор в искусственных хозяевах, который индуцирует достаточное количество яйцекладок для трихограммы , может быть простым, например, аминокислотами или неорганическими солями¹². Основываясь на характеристике, что T. dendrolimi может паразитировать на искусственных хозяевах, в этом исследовании представлен новый метод извлечения яда из паразитоидных ос с использованием искусственных хозяев. Этот подход направлен на устранение недостатков, связанных с низким выходом, низкой чистотой и восприимчивостью к загрязнению в современных методах экстракции. С помощью этого метода можно извлечь большое количество яда высокой чистоты из T. dendrolimi , что отвечает потребностям научных исследований и скрининга биологически активных молекул для инсектицидных или медицинских целей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Разведение насекомых

1. Кормят Corcyra cephalonica на кукурузной муке при температуре 26 ± 1°С и относительной влажности воздуха 40% ± 10%.
2. Разводить штамм T. dendrolimi из инсектария Цзилинь в помещении, используя яйца Corcyra cephalonica в качестве хозяев. Кормят взрослых ос 10%-ной сахарозой водой в трубках дрозофилы при температуре 26 ± 1 °C, относительной влажности воздуха 70% ± 10%, светлых (L): темных (D) периодов 14 ч: 10 ч.

2. Подготовка карт яиц из полиэтиленовой пленки

1. Возьмите полиэтиленовую пленку длиной 16 см, шириной 12 см и толщиной 20 мкм. Выдавить 30 полукруглых выступов диаметром 2-3 мм и высотой примерно 3 мм с помощью стеклянного шлифовального стержня по стандартной схеме ПЦР-пластины из 96 отверстий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс выдавливания 30 полукруглых выступов с помощью стеклянного шлифовального стержня необходимо выполнять, обращая внимание на давление, потому что слишком твердый пресс проткнет пластик и загрязнит извлеченный неядовитый шлифовальный стержень.
2. Продезинфицируйте прессованную полиэтиленовую пленку, подвергая обе стороны воздействию ультрафиолета (УФ) в течение 1 часа.
3. Добавьте небольшое количество 10% поливинилового спирта на полукруглую поверхность.

3. Паразитизм Trichogramma dendrolimi

1. После анестезии_СО2 поместите самок ос T. dendrolimi в ящик для сбора, и количество ос составило ~3000.
2. Приложите выпуклую сторону пленочной карточки для яиц к коробке для сбора и закрепите края резинкой.
3. Добавьте 4 мкл раствора аминокислоты (6 г/л лейцина, 4 г/л фенилаланина, 4,25 г/л гистидина) к каждому полукруглому выпячиванию. Накройте его плоской полиэтиленовой пленкой длиной 16 см и шириной 12 см. С помощью резинки плотно накройте сборный ящик двумя листами пластика.
4. Дайте осам T. dendrolimi свободно паразитировать в течение 4-8 ч и обеспечьте 10%-ную сахарозную воду через смоченный хлопок.

4. Сбор яда T. dendrolimi

1. Извлеките паразитизированный раствор аминокислоты из внутреннего выступа карточки искусственной яйцеклетки и переложите его в колпачок пробирки объемом 1,5 мл.
2. Накройте крышку пробирки нейлоновой сеткой диаметром 10 мкм диаметром 25 мм, плотно закрепите нейлоновую сетку и центрифужную пробирку. Поместите центрифужную пробирку вертикально для короткого центрифугирования с помощью мини-центрифуги (1360 x g) на 10 с и соберите отфильтрованный раствор (~100 мкл яда T. dendrolimi ).
3. Измерьте концентрацию собранного яда T. dendrolimi с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (таблица материалов).
4. Храните яд при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

5. Анализ SDS-PAGE

1. Добавьте 30 мкл яда T. dendrolimi в 10 мкл 4-кратного буфера для загрузки образца с додецилсульфатом-полиакриламидным гелем натрия (SDS-PAGE) (таблица материалов) и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин.
2. Выполните прогон геля SDS-PAGE при напряжении 130 В в течение 120 мин.
3. Окрасьте и обесцвечивайте гель SDS-PAGE с помощью аппарата для окрашивания белков (таблица материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Концентрацию белка в репрезентативных образцах яда измеряли с помощью набора для анализа белков, результаты представлены в таблице 1. Результаты показали, что концентрация белка яда, собранного этим методом, варьировала от 0,35 мкг/мкл до 0,46 мкг/мкл, в то время как отрицательный ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данной статье мы представляем метод извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Ключевые моменты в эксперименте по сбору яда заключаются в следующем. (1) Во время приготовления T. dendrolimi необходимо быстро обезболивать соответствующей концентрацией CO₂

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collection box	Deli	8555	Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glass grinding rod	Applygen	tb6268	Semicircular protrudations
L- Leucine	Solarbio	L0011	Artificial host components
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Artificial host components
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Artificial host components
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes	Thermo Fisher	AB1400L	Semicircular protrudations
Polyethylene plastic film	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubber band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole	Sangon Biotech	F504416-0001	Semicircular protrudations