Extração de veneno da vespa parasitoide Trichogramma dendrolimi usando um hospedeiro artificial

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para extração de veneno de Trichogramma dendrolimi usando um hospedeiro artificial criado com filme de polietileno e solução de aminoácidos.

Resumo

As vespas parasitoides são um grupo diversificado de insetos himenópteros que servem como recursos inestimáveis para o biocontrole de pragas. Para garantir o sucesso do parasitismo, as vespas parasitoides injetam veneno em seus hospedeiros para suprimir a imunidade de seus hospedeiros, modular o desenvolvimento, o metabolismo e até mesmo o comportamento dos hospedeiros. Com mais de 600.000 espécies estimadas, a diversidade de vespas parasitoides supera a de outros animais peçonhentos, como cobras, caracóis cônicos e aranhas. O veneno da vespa parasitoide é uma fonte pouco explorada de moléculas bioativas com potenciais aplicações no controle de pragas e na medicina. No entanto, a coleta de veneno de parasitoides é um desafio devido à incapacidade de usar estimulação direta ou elétrica e à dificuldade de dissecção devido ao seu pequeno tamanho. Trichogramma é um gênero de vespas parasitoides de ovos minúsculas (~0,5 mm) que são amplamente utilizadas para o controle biológico de pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Aqui, relatamos um método para extração de veneno de T. dendrolimi usando hospedeiros artificiais. Esses hospedeiros artificiais são criados com filme de polietileno e soluções de aminoácidos e, em seguida, inoculados com vespas Trichogramma para parasitismo. O veneno foi posteriormente coletado e concentrado. Este método permite a extração de grandes quantidades de veneno de Trichogramma , evitando a contaminação de outros tecidos causada pela dissecção, um problema comum em protocolos de dissecção de reservatórios de veneno. Esta abordagem inovadora facilita o estudo do veneno de Trichogramma , abrindo caminho para novas pesquisas e potenciais aplicações.

Introdução

As vespas parasitoides são insetos himenópteros parasitas que são importantes recursos para o controle biológico¹. Existe uma grande variedade de vespas parasitoides, com mais de 600.000 espécies estimadas². A diversidade de vespas parasitoides excede em muito a de outros artrópodes peçonhentos, como cobras, caracóis cônicos, aranhas, escorpiões e abelhas. O veneno é um importante fator parasitário em vespas parasitoides. Para o sucesso do parasitismo, o veneno é injetado no hospedeiro, modulando o comportamento, a imunidade, o desenvolvimento e o metabolismo do hospedeiro³. Além disso, o veneno de vespas parasitoides exibe notável diversidade em suas estruturas moleculares, alvos e funções, refletindo complexa coevolução com seus hospedeiros. Assim, o veneno do parasitoide é um recurso valioso e pouco valorizado de moléculas ativas para fins inseticidas ou^medicinais4. Ao contrário do veneno de cobras, caracóis, aranhas, escorpiões e abelhas, o veneno da vespa parasitoide não pode ser coletado por estimulação direta ou estimulação elétrica⁵. O método atual de extração do veneno da vespa parasitoide é dissecar o reservatório de veneno. No entanto, as vespas parasitoides são frequentemente pequenas, e a dissecção de vespas parasitoides requer altas habilidades técnicas. Portanto, se pudermos encontrar uma maneira de coletar o veneno de vespas parasitoides de forma eficiente e conveniente, será de grande ajuda pesquisar o veneno de vespas parasitoides.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) é um gênero de vespas parasitoides minúsculas (~0,5 mm de comprimento)⁶. Essas vespas estão entre os agentes de biocontrole mais amplamente utilizados, particularmente visando ovos de várias pragas de lepidópteros na agricultura e nas florestas. Por exemplo, T. dendrolimi, uma das espécies de Trichogramma mais utilizadas na China, tem sido extensivamente aplicada para controlar uma variedade de pragas agrícolas e florestais, como Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Estudos anteriores mostraram que vespas Trichogramma poderiam injetar seus ovos em hospedeiros artificiais⁷. Hospedeiros artificiais podem ser criados usando materiais como cera⁸, ágar⁹, Parafilm¹⁰ e filme plástico¹¹. A solução em hospedeiros artificiais que induz oviposição suficiente para Trichogramma pode ser simples, como aminoácidos ou sais inorgânicos¹². Baseado na característica de que T. dendrolimi pode parasitar hospedeiros artificiais, este estudo fornece um novo método para extrair veneno de vespas parasitoides usando hospedeiros artificiais. Esta abordagem visa abordar as deficiências de baixo rendimento, baixa pureza e suscetibilidade à contaminação nas técnicas de extração atuais. Usando este método, uma grande quantidade de veneno de alta pureza de T. dendrolimi pode ser extraída, o que atende às necessidades de pesquisa científica e triagem de moléculas bioativas para fins inseticidas ou médicos.

Protocolo

1. Criação de insetos

1. Alimentar Corcyra cephalonica em farinha de milho à temperatura de 26 ± 1°C e umidade relativa de 40% ± 10%.
2. Cepa T. dendrolimi do insetário Jilin em ambientes fechados utilizando ovos de Corcyra cephalonica como hospedeiros. Alimentar adultos de vespa a 10% de água de sacarose em tubos de Drosophila a uma temperatura de 26 ± 1 °C, umidade relativa de 70% ± 10%, claro (L): escuro (D) período de 14 h: 10 h.

2. Preparação de cartões de ovo de filme plástico de polietileno

1. Pegue um filme plástico de polietileno com um comprimento de 16 cm, uma largura de 12 cm e uma espessura de 20 μm. Pressione 30 saliências semicirculares com um diâmetro de 2-3 mm e uma altura de aproximadamente 3 mm usando uma haste de moagem de vidro de acordo com o layout padrão da placa de PCR de 96 furos.
   NOTA: O processo de prensagem de 30 saliências semicirculares usando uma haste de moagem de vidro precisa ser feito prestando atenção à pressão, pois uma prensa muito dura perfurará o plástico e contaminará a haste de moagem sem veneno extraída.
2. Desinfete o filme plástico de polietileno prensado expondo ambos os lados à luz ultravioleta (UV) por 1 h.
3. Adicione uma pequena quantidade de álcool polivinílico a 10% à superfície semicircular.

3. Parasitismo por Trichogramma dendrolimi

1. Após a anestesia com CO₂ , colocar vespas fêmeas de T. dendrolimi em uma caixa de coleta e o número de vespas foi de ~3000.
2. Coloque o lado convexo do cartão de ovo de filme em direção à caixa coletora e prenda as bordas com um elástico.
3. Adicionar 4 μL de solução de aminoácidos (6 g/L de leucina, 4 g/L de fenilalanina, 4,25 g/L de histidina) a cada protrusão semicircular. Cubra com um filme plástico plano de polietileno de 16 cm de comprimento por 12 cm de largura. Use um elástico para cobrir bem a caixa coletora com duas folhas de plástico.
4. Deixe as vespas T. dendrolimi parasitarem livremente por 4-8 h e forneça 10% de água de sacarose através do algodão molhado.

4. Coleta de veneno de T. dendrolimi

1. Obter a solução de aminoácidos parasitados a partir da protrusão interna do cartão de ovo artificial e transferi-la para a tampa de tubos de 1,5 mL.
2. Cubra a tampa do tubo com uma rede de nylon de 10 μm com um diâmetro de 25 mm, prenda bem a rede de nylon e o tubo de centrifugação. Coloque o tubo da centrífuga na vertical para centrifugação curta usando uma minicentrífuga (1360 x g) por 10 s e colete a solução filtrada (~100 μL de veneno de T. dendrolimi ).
3. Medir a concentração do veneno de T. dendrolimi coletado usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Tabela de Materiais).
4. Conservar o veneno a -80 °C para análises complementares.

5. Análises do SDS-PAGE

1. Adicionar 30 μL de veneno de T. dendrolimi a 10 μL de 4x tampão de carregamento de amostra de eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) (Tabela de Materiais) e aquecer a 95 °C por 10 min.
2. Execute a corrida de gel SDS-PAGE a 130 V por 120 min.
3. Corar e descolorir o gel de SDS-PAGE com o aparelho de coloração de proteínas (Tabela de Materiais).

Resultados

A concentração proteica das amostras representativas de veneno foi medida por meio do kit de ensaio proteico, com os resultados apresentados na Tabela 1. Os resultados mostraram que a concentração de proteína do veneno coletada por esse método variou de 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, enquanto o controle negativo da solução de aminoácidos apresentou apenas uma concentração proteica de 0,03 μg/μL a 0,05 μg/μL. A concentração de proteína do veneno coletada por este método é muito maior do ...

Discussão

Aqui, apresentamos um método para extração de veneno de T. dendrolimi usando hospedeiros artificiais. Os pontos-chave no experimento de coleta de veneno são os seguintes. (1) Durante a preparação, T. dendrolimi deve ser anestesiado rapidamente com uma concentração adequada de CO₂. Se a concentração de CO₂ for muito baixa, será insuficiente para anestesiar o Trichogramma rapidamente. Por outro lado, se a concentração for muito alta, Trichogramma pode m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collection box	Deli	8555	Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glass grinding rod	Applygen	tb6268	Semicircular protrudations
L- Leucine	Solarbio	L0011	Artificial host components
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Artificial host components
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Artificial host components
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes	Thermo Fisher	AB1400L	Semicircular protrudations
Polyethylene plastic film	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubber band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole	Sangon Biotech	F504416-0001	Semicircular protrudations