Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.

Abstract

Le vespe parassitoidi sono un gruppo eterogeneo di insetti imenotteri che fungono da risorse inestimabili per il biocontrollo dei parassiti. Per garantire il successo del parassitismo, le vespe parassitoidi iniettano veleno nei loro ospiti per sopprimere l'immunità dei loro ospiti, modulare lo sviluppo, il metabolismo e persino il comportamento degli ospiti. Con oltre 600.000 specie stimate, la diversità delle vespe parassitoidi supera quella di altri animali velenosi, come serpenti, lumache a cono e ragni. Il veleno di vespa parassitoide è una fonte poco esplorata di molecole bioattive con potenziali applicazioni nel controllo dei parassiti e nella medicina. Tuttavia, la raccolta del veleno parassitoide è impegnativa a causa dell'impossibilità di utilizzare la stimolazione diretta o elettrica e della difficoltà di dissezione a causa delle loro piccole dimensioni. Trichogramma è un genere di vespe parassitoidi di minuscole (~0,5 mm) uova ampiamente utilizzate per il controllo biologico dei parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Riportiamo qui un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. Questi ospiti artificiali vengono creati con film di polietilene e soluzioni di amminoacidi e poi inoculati con vespe Trichogramma per il parassitismo. Il veleno è stato successivamente raccolto e concentrato. Questo metodo consente l'estrazione di grandi quantità di veleno di Trichogramma evitando la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione, un problema comune nei protocolli di dissezione del serbatoio del veleno. Questo approccio innovativo facilita lo studio del veleno di Trichogramma , aprendo la strada a nuove ricerche e potenziali applicazioni.

Introduzione

Le vespe parassitoidi sono insetti imenotteri parassiti che rappresentano importanti risorse per la lotta biologica¹. Esiste un'ampia varietà di vespe parassitoidi, con oltre 600.000 specie stimate². La diversità delle vespe parassitoidi supera di gran lunga quella di altri artropodi velenosi, come serpenti, lumache a cono, ragni, scorpioni e api. Il veleno è un importante fattore parassitario nelle vespe parassitoidi. Per il successo del parassitismo, il veleno viene iniettato nell'ospite, modulando il comportamento, l'immunità, lo sviluppo e il metabolismo^{dell'ospite 3}. Inoltre, il veleno delle vespe parassitoidi mostra una notevole diversità nelle sue strutture molecolari, nei suoi bersagli e nelle sue funzioni, riflettendo la complessa coevoluzione con i loro ospiti. Pertanto, il veleno parassitoide è una risorsa preziosa e sottovalutata di molecole attive per scopi insetticidi o medici⁴. A differenza del veleno di serpenti, lumache, ragni, scorpioni e api, il veleno di vespe parassitoidi non può essere raccolto mediante stimolazione diretta o elettrostimolazione⁵. L'attuale metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consiste nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono spesso piccole e la dissezione delle vespe parassitoidi richiede elevate competenze tecniche. Pertanto, se riusciamo a trovare un modo per raccogliere il veleno delle vespe parassitoidi in modo efficiente e conveniente, sarà di grande aiuto ricercare il veleno delle vespe parassitoidi.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) è un genere di minuscole vespe parassitoidi (lunghe ~0,5 mm)⁶. Queste vespe sono tra gli agenti di biocontrollo più utilizzati, in particolare per le uova di vari parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Ad esempio, T. dendrolimi, una delle specie di Trichogramma più utilizzate in Cina, è stata ampiamente applicata per controllare una varietà di parassiti agricoli e forestali, come Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Studi precedenti hanno dimostrato che le vespe Trichogramma potevano iniettare le loro uova in ospiti artificiali⁷. Gli ospiti artificiali possono essere creati utilizzando materiali come cera⁸, agar⁹, Parafilm¹⁰ e film plastico¹¹. La soluzione in ospiti artificiali che induce un'ovideposizione sufficiente per Trichogramma può essere semplice, come amminoacidi o sali inorganici¹². Sulla base della caratteristica che T. dendrolimi può parassitare gli ospiti artificiali, questo studio fornisce un nuovo metodo per estrarre il veleno dalle vespe parassitoidi utilizzando ospiti artificiali. Questo approccio mira ad affrontare le carenze di bassa resa, bassa purezza e suscettibilità alla contaminazione nelle attuali tecniche di estrazione. Utilizzando questo metodo, è possibile estrarre una grande quantità di veleno ad alta purezza da T. dendrolimi , che soddisfa le esigenze della ricerca scientifica e dello screening di molecole bioattive per scopi insetticidi o medici.

Protocollo

1. Allevamento di insetti

1. Somministrare Corcyra cephalonica con farina di mais ad una temperatura di 26 ± 1°C e un'umidità relativa del 40% ± 10%.
2. Allevare il ceppo di T. dendrolimi dell'insetto Jilin indoor utilizzando le uova di Corcyra cephalonica come ospiti. Nutrire gli adulti di vespe con acqua di saccarosio al 10% in provette di Drosophila a una temperatura di 26 ± 1 °C, umidità relativa del 70% ± 10%, luce (L): buio (D) periodo di 14 h: 10 h.

2. Preparazione delle carte uovo in film plastico di polietilene

1. Prendi una pellicola di plastica in polietilene con una lunghezza di 16 cm, una larghezza di 12 cm e uno spessore di 20 μm. Pressare 30 sporgenze semicircolari con un diametro di 2-3 mm e un'altezza di circa 3 mm utilizzando un'asta di molatura del vetro secondo la disposizione standard della piastra PCR di 96 fori.
   NOTA: Il processo di pressatura di 30 sporgenze semicircolari utilizzando un'asta di macinazione del vetro deve essere eseguito prestando attenzione alla pressione perché una pressa troppo dura perforerà la plastica e contaminerà l'asta di macinazione senza veleno estratta.
2. Disinfettare il film plastico di polietilene pressato esponendo entrambi i lati alla luce ultravioletta (UV) per 1 ora.
3. Aggiungere una piccola quantità di alcol polivinilico al 10% sulla superficie semicircolare.

3. Parassitismo di Trichogramma dendrolimi

1. Dopo l'anestesia CO₂ , posizionare le vespe femmine di T. dendrolimi in una scatola di raccolta e il numero di vespe era ~ 3000.
2. Posizionare il lato convesso della carta uovo in pellicola verso la scatola di raccolta e fissare i bordi con un elastico.
3. Aggiungere 4 μL di soluzione aminoacidica (6 g/L di leucina, 4 g/L di fenilalanina, 4,25 g/L di istidina) a ciascuna protrusione semicircolare. Copritela con una pellicola di plastica piatta in polietilene lunga 16 cm e larga 12 cm. Utilizzare un elastico per coprire ermeticamente il contenitore di raccolta con due fogli di plastica.
4. Lasciare che le vespe T. dendrolimi parassitino liberamente per 4-8 ore e forniscano il 10% di acqua di saccarosio attraverso il cotone bagnato.

4. Raccolta del veleno di T. dendrolimi

1. Ottenere la soluzione di amminoacidi parassitati dalla sporgenza interna della scheda uovo artificiale e trasferirla nel tappo delle provette da 1,5 mL.
2. Coprire il tappo della provetta con una rete di nylon da 10 μm di diametro 25 mm, fissare saldamente la rete di nylon e la provetta da centrifuga. Posizionare la provetta da centrifuga in posizione verticale per una centrifugazione breve utilizzando una minicentrifuga (1360 x g) per 10 secondi e raccogliere la soluzione filtrata (~100 μL di veleno di T. dendrolimi ).
3. Misurare la concentrazione del veleno di T. dendrolimi raccolto utilizzando un kit per il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (Tabella dei materiali).
4. Conservare il veleno a -80 °C per ulteriori analisi.

5. Analisi SDS-PAGE

1. Aggiungere 30 μL di veleno di T. dendrolimi a 10 μL di tampone di caricamento del campione su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (Tabella dei materiali) e riscaldare a 95 °C per 10 min.
2. Eseguire il ciclo del gel SDS-PAGE a 130 V per 120 min.
3. Colorare e decolorare il gel SDS-PAGE utilizzando l'apparato di colorazione delle proteine (Tabella dei materiali).

Risultati

La concentrazione proteica di campioni di veleno rappresentativi è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine, con i risultati presentati nella Tabella 1. I risultati hanno mostrato che la concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo variava da 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mentre il controllo negativo della soluzione di amminoacidi aveva solo una concentrazione proteica compresa tra 0,03 μg/μL e 0,05 μg/μL. La concentrazione di proteine del veleno raccolte con qu...

Discussione

Qui, presentiamo un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. I punti chiave dell'esperimento di raccolta del veleno sono i seguenti. (1) Durante la preparazione, T. dendrolimi deve essere anestetizzato rapidamente con un'adeguata concentrazione di CO₂ . Se la concentrazione di CO₂ è troppo bassa, sarà insufficiente per anestetizzare rapidamente il Trichogramma . Al contrario, se la concentrazione è troppo alta, i Trichogramma

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collection box	Deli	8555	Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glass grinding rod	Applygen	tb6268	Semicircular protrudations
L- Leucine	Solarbio	L0011	Artificial host components
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Artificial host components
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Artificial host components
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes	Thermo Fisher	AB1400L	Semicircular protrudations
Polyethylene plastic film	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubber band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole	Sangon Biotech	F504416-0001	Semicircular protrudations