Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para extraer veneno de Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial creado con una película de polietileno y una solución de aminoácidos.

Resumen

Las avispas parasitoides son un grupo diverso de insectos himenópteros que sirven como recursos invaluables para el control biológico de plagas. Para garantizar el éxito del parasitismo, las avispas parasitoides inyectan veneno en sus huéspedes para suprimir la inmunidad de sus huéspedes, modular el desarrollo, el metabolismo e incluso el comportamiento de los huéspedes. Con más de 600.000 especies estimadas, la diversidad de avispas parasitoides supera a la de otros animales venenosos, como serpientes, caracoles cono y arañas. El veneno de avispa parasitoide es una fuente poco explorada de moléculas bioactivas con aplicaciones potenciales en el control de plagas y la medicina. Sin embargo, la recolección de veneno parasitoide es un desafío debido a la incapacidad de usar estimulación directa o eléctrica y la dificultad en la disección debido a su pequeño tamaño. Trichogramma es un género de avispas parasitoides de huevo diminutas (~0,5 mm) que se utilizan ampliamente para el control biológico de plagas de lepidópteros tanto en la agricultura como en los bosques. Aquí, reportamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi usando huéspedes artificiales. Estos huéspedes artificiales se crean con una película de polietileno y soluciones de aminoácidos y luego se inoculan con avispas Trichogramma para el parasitismo. Posteriormente, el veneno fue recogido y concentrado. Este método permite la extracción de grandes cantidades de veneno de Trichogramma al tiempo que evita la contaminación de otros tejidos causada por la disección, un problema común en los protocolos de disección de reservorios de veneno. Este enfoque innovador facilita el estudio del veneno de Trichogramma , allanando el camino para nuevas investigaciones y posibles aplicaciones.

Introducción

Las avispas parasitoides son insectos himenópteros parásitos que son recursos importantes para el control biológico¹. Existe una gran variedad de avispas parasitoides, con más de 600.000 especies estimadas². La diversidad de avispas parasitoides supera con creces la de otros artrópodos venenosos, como serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas. El veneno es un factor parasitario importante en las avispas parasitoides. Para un parasitismo exitoso, el veneno se inyecta en el huésped, modulando el comportamiento, la inmunidad, el desarrollo y el metabolismo del^huésped. Además, el veneno de las avispas parasitoides muestra una notable diversidad en sus estructuras moleculares, objetivos y funciones, lo que refleja una compleja coevolución con sus huéspedes. Por lo tanto, el veneno parasitoide es un recurso valioso y subestimado de moléculas activas con fines insecticidas o médicos⁴. A diferencia del veneno de serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas, el veneno de avispa parasitoide no se puede recolectar por estimulación directa o estimulación^eléctrica. El método actual de extracción del veneno de avispa parasitoide es diseccionar el depósito de veneno. Sin embargo, las avispas parasitoides suelen ser pequeñas, y la disección de avispas parasitoides requiere altas habilidades técnicas. Por lo tanto, si podemos encontrar una manera de recolectar el veneno de las avispas parasitoides de manera eficiente y conveniente, será de gran ayuda investigar el veneno de las avispas parasitoides.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) es un género de avispas parasitoides diminutas (~0,5 mm de largo)⁶. Estas avispas se encuentran entre los agentes de control biológico más utilizados, especialmente en los huevos de diversas plagas de lepidópteros, tanto en la agricultura como en los bosques. Por ejemplo, T. dendrolimi, una de las especies de Trichogramma más utilizadas en China, se ha aplicado ampliamente para controlar una variedad de plagas agrícolas y forestales, como Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis y Chilo suppressalis. Estudios previos demostraron que las avispas Trichogramma podían inyectar sus huevos en huéspedes artificiales⁷. Los anfitriones artificiales se pueden crear utilizando materiales como cera⁸, agar⁹, Parafilm¹⁰ y película plástica¹¹. La solución en huéspedes artificiales que induce suficiente oviposición para Trichogramma puede ser simple, como aminoácidos o sales inorgánicas¹². Basado en la característica de que T. dendrolimi puede parasitar huéspedes artificiales, este estudio proporciona un nuevo método para extraer veneno de avispas parasitoides utilizando huéspedes artificiales. Este enfoque tiene como objetivo abordar las deficiencias de bajo rendimiento, baja pureza y susceptibilidad a la contaminación en las técnicas de extracción actuales. Mediante el uso de este método, se puede extraer una gran cantidad de veneno de alta pureza de T. dendrolimi , lo que satisface las necesidades de investigación científica y detección de moléculas bioactivas con fines insecticidas o médicos.

Protocolo

1. Cría de insectos

1. Alimente Corcyra cephalonica con harina de maíz a una temperatura de 26 ± 1 °C y una humedad relativa del 40% ± 10%.
2. Cría una cepa de T. dendrolimi del insectario Jilin en interiores utilizando los huevos de Corcyra cephalonica como huéspedes. Alimente a los adultos de avispa al 10% con agua de sacarosa en tubos de Drosophila a una temperatura de 26 ± 1 °C, humedad relativa del 70% ± 10%, luz (L): oscuridad (D) período de 14 h: 10 h.

2. Preparación de tarjetas de huevo de película plástica de polietileno

1. Tome una película de plástico de polietileno con una longitud de 16 cm, un ancho de 12 cm y un grosor de 20 μm. Presione 30 protuberancias semicirculares con un diámetro de 2-3 mm y una altura de aproximadamente 3 mm utilizando una varilla abrasiva de vidrio de acuerdo con el diseño estándar de la placa PCR de 96 orificios.
   NOTA: El proceso de prensar 30 protuberancias semicirculares con una varilla de molienda de vidrio debe realizarse prestando atención a la presión porque una prensa demasiado fuerte perforará el plástico y contaminará la varilla de molienda sin veneno extraída.
2. Desinfecte la película de plástico de polietileno prensado exponiendo ambos lados a la luz ultravioleta (UV) durante 1 h.
3. Agregue una pequeña cantidad de alcohol polivinílico al 10% a la superficie semicircular.

3. Parasitismo por Trichogramma dendrolimi

1. Después de la anestesia con CO₂ , coloque las avispas hembras de T. dendrolimi en una caja de recolección, y el número de avispas fue de ~ 3000.
2. Coloque el lado convexo de la tarjeta de huevo de película hacia la caja de recolección y asegure los bordes con una banda elástica.
3. Añadir 4 μL de solución de aminoácidos (6 g/L de leucina, 4 g/L de fenilalanina, 4,25 g/L de histidina) a cada protuberancia semicircular. Cúbrelo con una película plástica plana de polietileno de 16 cm de largo y 12 cm de ancho. Use una banda elástica para cubrir herméticamente la caja de recolección con dos hojas de plástico.
4. Deje que las avispas T. dendrolimi parasiten libremente durante 4-8 h y proporcione un 10% de agua de sacarosa a través del algodón mojado.

4. Recolección del veneno de T. dendrolimi

1. Obtenga la solución de aminoácidos parasitados de la protuberancia interna de la tarjeta de huevo artificial y transfiérala a la tapa de los tubos de 1,5 ml.
2. Cubra la tapa del tubo con una red de nailon de 10 μm con un diámetro de 25 mm, sujete firmemente la red de nailon y el tubo de centrífuga. Coloque el tubo de centrífuga en posición vertical para una centrifugación corta con una minicentrífuga (1360 x g) durante 10 s y recoja la solución filtrada (~100 μL de veneno de T. dendrolimi ).
3. Mida la concentración de veneno de T. dendrolimi recolectado utilizando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Tabla de materiales).
4. Almacene el veneno a -80 °C para su posterior análisis.

5. Análisis SDS-PAGE

1. Añadir 30 μL de veneno de T. dendrolimi a 10 μL de tampón de carga de muestras de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) 4x (Tabla de materiales) y calentar a 95 °C durante 10 min.
2. Realice el funcionamiento del gel SDS-PAGE a 130 V durante 120 min.
3. Tiñir y decolorar el gel SDS-PAGE utilizando el aparato de tinción de proteínas (Tabla de materiales).

Resultados

La concentración de proteínas de las muestras representativas de veneno se midió utilizando el kit de ensayo de proteínas, con los resultados presentados en la Tabla 1. Los resultados mostraron que la concentración de proteína de veneno recolectada por este método varió de 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mientras que el control negativo de la solución de aminoácidos solo tuvo una concentración de proteína de 0,03 μg/μL a 0,05 μg/μL. La concentración de proteína de veneno recolectada por es...

Discusión

Aquí, presentamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi utilizando huéspedes artificiales. Los puntos clave en el experimento de recolección de veneno son los siguientes. (1) Durante la preparación, T. dendrolimi debe anestesiarse rápidamente con una concentración adecuada de CO₂. Si la concentración de_CO2 es demasiado baja, será insuficiente para anestesiar el Trichogramma rápidamente. Por el contrario, si la concentración es demasiado alta, Tricho...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collection box	Deli	8555	Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glass grinding rod	Applygen	tb6268	Semicircular protrudations
L- Leucine	Solarbio	L0011	Artificial host components
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Artificial host components
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Artificial host components
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes	Thermo Fisher	AB1400L	Semicircular protrudations
Polyethylene plastic film	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubber band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole	Sangon Biotech	F504416-0001	Semicircular protrudations