使用人工宿主从寄生蜂 Trichogramma dendrolimi 中提取毒液

摘要

在这里，我们提出了一种使用由聚乙烯薄膜和氨基酸溶液制成的人工宿主从 木 霉中提取毒液的方案。

摘要

寄生蜂是一类多样化的膜翅目昆虫，是害虫生物防治的宝贵资源。为了确保成功寄生，寄生蜂将毒液注射到宿主体内，以抑制宿主的免疫力，调节宿主的发育、新陈代谢甚至行为。据估计，寄生蜂的种类超过 600,000 种，其多样性超过了其他有毒动物，如蛇、锥形蜗牛和蜘蛛。寄生蜂毒液是一种未被充分开发的生物活性分子来源，在害虫防治和医学方面具有潜在应用。然而，由于无法使用直接或电刺激，并且由于其体积小而难以解剖，因此收集寄生虫毒液具有挑战性。 Trichogramma 是一种微小的 （~0.5 毫米） 卵寄生蜂属，广泛用于农业和森林中鳞翅目害虫的生物防治。在这里，我们报道了一种使用人工宿主从 T. dendrolimi 中提取毒液的方法。这些人工宿主是用聚乙烯薄膜和氨基酸溶液产生的，然后接种有 毛滴虫 蜂进行寄生。随后收集并浓缩了毒液。这种方法能够提取大量的 毛滴虫 毒液，同时避免由解剖引起的其他组织的污染，这是毒液库解剖方案中的常见问题。这种创新方法促进了 Trichogramma 毒液的研究，为新的研究和潜在应用铺平了道路。

引言

寄生蜂是寄生膜翅目昆虫，是^生物防治的重要资源1。寄生蜂种类繁多，估计有超过 600,000 种².寄生蜂的多样性远远超过其他有毒节肢动物，如蛇、锥形蜗牛、蜘蛛、蝎子和蜜蜂。毒液是寄生蜂的重要寄生因子。为了成功寄生，将毒液注射到宿主体内，调节宿主的行为、免疫、发育和新陈代谢³.此外，寄生蜂的毒液在其分子结构、靶点和功能上表现出显著的多样性，反映了与宿主的复杂协同进化。因此，寄生虫毒液是一种有价值且被低估的活性分子资源，用于杀虫或医疗目的⁴.与蛇、锥形蜗牛、蜘蛛、蝎子和蜜蜂的毒液不同，寄生蜂毒液不能通过直接刺激或电刺激收集⁵.目前提取寄生蜂毒液的方法是解剖毒液库。然而，寄生蜂通常很小，解剖寄生蜂需要很高的技术技能。因此，如果我们能找到一种高效方便地收集寄生蜂毒液的方法，对研究寄生蜂的毒液将有很大的帮助。

毛螨（膜翅目：Trichogrammatidae）是微小（~0.5毫米长）寄生蜂^{属 6}.这些黄蜂是使用最广泛的生物防治剂之一，特别是针对农业和森林中各种鳞翅目害虫的卵。例如，中国应用最广泛的木霉菌种之一——枸杞已被广泛用于防治多种农林害虫，如<....

研究方案

1. 昆虫饲养

1. 在26±1°C的温度和40%±10%的相对湿度下，在玉米粉上饲喂 Corcyra cephalonica 。
2. 以头孢芽卵为寄主，在室内繁殖吉林昆虫的T. dendrolimi菌株。在果蝇管中饲料黄蜂成虫10%蔗糖水，温度为26±1°C，相对湿度为70%±10%，光照（L）：深色（D）周期为14小时：10小时。

2、聚乙烯塑料薄膜蛋卡的制备

1. 取长 16 厘米、宽 12 厘米、厚 20 μm 的聚乙烯塑料薄膜。根据96孔的标准PCR板布局，使用玻璃研磨棒压出30个直径为2-3mm，高度约为3mm的半圆形突起。
   注意： 使用玻璃研磨棒压出 30 个半圆形突起的过程需要注意压力，因为压力太大会刺穿塑料并污染提取的无毒研棒。
2. 通过将两面暴露在紫外线（UV）下1小时来对压制的聚乙烯塑料薄膜进行消毒。
3. 在半圆形表面上加入少量10%聚乙烯醇。

3. 木滴虫 寄生

1. CO2麻醉后，将T. dendrolimi....

结果

使用蛋白质检测试剂盒测量代表性毒液样品的蛋白质浓度，结果如 表1所示。结果表明，该方法采集的毒液蛋白浓度范围为0.35 μg/μL至0.46 μg/μL，而氨基酸溶液阴性对照的蛋白浓度仅为0.03 μg/μL至0.05 μg/μL。该方法采集的毒液蛋白浓度远高于阴性对照，说明该方法能较好地采集寄生蜂的毒液。此外，寄生时间和浓度之间没有特定的相关性，因为不同批次的寄生蜂可能具有不同的活力。.......

讨论

在这里，我们提出了一种使用人工宿主从T. dendrolimi中提取毒液的方法。毒液采集实验的要点如下。（1）在制备过程中，必须用适当浓度的CO₂迅速麻醉树状枸杞。如果 CO₂ 浓度过低，则不足以快速麻醉 Trichogramma。相反，如果浓度过高，Trichogramma可能会死亡，从而降低它们寄生在人工宿主上的能力。（2）必须保证氨基酸溶液的无菌性，因为氨基酸溶液的污.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μm Nylon Net	Millipore	NY1002500	For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol	Aladdin	P139533	For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water	Sinopharm Chemical Reagent	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Collection box	Deli	8555	Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)	Ace Hardware	J70236502X	SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Glass grinding rod	Applygen	tb6268	Semicircular protrudations
L- Leucine	Solarbio	L0011	Artificial host components
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Artificial host components
L-Phenylalanine	Solarbio	P0010	Artificial host components
Mini-Centrifuges	Scilogex	D1008	Centrifuge
MOPS-SDS running buffer	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit	Shanghai Yamay Biomedical Technology	ZJ102	For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes	Thermo Fisher	AB1400L	Semicircular protrudations
Polyethylene plastic film	Suzhou Aopang Trading	001c5427	Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Rubber band	Guangzhou qianrui biology science and technology	009	Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole	Sangon Biotech	F504416-0001	Semicircular protrudations