In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لانتشار الخلايا السرطانية المنتشرة في السائل النخاعي الدماغي (CSF-CTCs) التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من مرض Leptomeningeal المرتبط بالورم الميلانيني (M-LMD) لتطوير نماذج ما قبل السريرية لدراسة M-LMD.

Abstract

يحدث مرض الليبتومينينج المرتبط بالورم الميلانيني (M-LMD) عندما تدخل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) إلى السائل النخاعي الدماغي (CSF) وتستعمر السحايا ، وهي طبقات الغشاء التي تحمي الدماغ والحبل الشوكي. بمجرد إنشائها ، يكون تشخيص مرضى M-LMD كئيبا ، حيث يتراوح معدل البقاء على قيد الحياة بشكل عام من أسابيع إلى شهور. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى ندرة فهمنا للمرض ، ونتيجة لذلك ، توافر خيارات العلاج الفعالة. سيؤدي تحديد البيولوجيا الأساسية ل M-LMD إلى تحسين القدرة بشكل كبير على تكييف العلاجات المتاحة لعلاج M-LMD أو تصميم مثبطات جديدة لهذا المرض القاتل عالميا. ومع ذلك ، يكمن العائق الرئيسي في الحصول على كميات كافية من CTCs من CSF المشتق من المريض (CSF-CTCs) لإجراء تجارب ما قبل السريرية ، مثل التوصيف الجزيئي والتحليل الوظيفي ودراسات الفعالية في الجسم الحي . كما ثبت أن زراعة CSF-CTCs خارج الجسم الحي يمثل تحديا. لمعالجة هذا الأمر ، تم تطوير بروتوكول جديد لثقافة M-LMD CSF-CTCs المشتقة من المريض خارج الجسم الحي وفي الجسم الحي . تم العثور على دمج الوسائط المشروطة التي تنتجها الخلايا السحائية البشرية (HMCs) لتكون حاسمة لهذا الإجراء. يكشف تحليل مصفوفة السيتوكين أن العوامل التي تنتجها HMCs ، مثل البروتينات المرتبطة بعامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGFBPs) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGF-A) ، مهمة في دعم بقاء CSF-CTC خارج الجسم الحي. هنا ، تظهر فائدة خطوط CSF-CTC المعزولة المشتقة من المريض في تحديد فعالية المثبطات التي تستهدف عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) ومسارات إشارات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK). بالإضافة إلى ذلك ، تظهر القدرة على تلقيح هذه الخلايا داخل الجسم الحي لإنشاء نماذج الفئران من M-LMD التي يمكن استخدامها للاختبار قبل السريري للعلاجات المعتمدة أو الجديدة. يمكن أن تساعد هذه الأدوات في كشف البيولوجيا الأساسية التي تقود إنشاء CSF-CTC في السحايا وتحديد علاجات جديدة لتقليل المراضة والوفيات المرتبطة ب M-LMD.

Introduction

يحدث مرض Leptomeningeal (LMD) عندما تنتشر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) في السائل النخاعي الدماغي (CSF) وتؤسس في السحايا الغشاء المحيط بالدماغ والحبل الشوكي 1,2. يمكن أن يحدث LMD في العديد من أنواع السرطان ولكنه منتشر بشكل خاص في سرطان الجلد. في المراحل المتقدمة من سرطان الجلد ، سيصاب ما يقرب من 5٪ من المرضى بسرطان الجلد المرتبط ب M-LMD 2,3. في حين أن عواقب M-LMD منخفضة نسبيا فيما يتعلق بمواقع ورم خبيث أخرى ، إلا أنها مدمرة ، حيث يتراوح معدل البقاء على قيد الحياة بشكل عام من أسابيع إلى أشهر ، وهو مساهم كبير في مراضة المرضى1،3،4. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى ندرة خيارات العلاج الفعالة جنبا إلى جنب مع الثغرات الكبيرة في معرفتنا فيما يتعلق بكيفية استعمار خلايا سرطان الجلد2. لذلك ، فإن فهم بيولوجيا M-LMD سيسهل تصميم علاجات جديدة لتحسين النتائج السريرية.

وقد أظهرت التقارير الأخيرة كيف تستعمر رابع كلوريد الكربون البيئة المكروية الفريدة للعامل الدماغي النخاعي. على سبيل المثال ، يعزز Complement C3 غزو الخلايا السرطانية إلى السائل الدماغي الشوكي عبر الضفيرة المشيمية ، وهي شبكة معقدة من الأوعية الدموية في كل بطين من الدماغ5. علاوة على ذلك ، استجابة للمغذيات الدقيقة النادرة في السائل الدماغي الشوكي ، يمكن ل CTCs تنظيم ليبوكالين -2 ، وهو بروتين كاسح للحديد ، ومستقبلاته SLC22A17 لتعزيز البقاء على قيد الحياة6. باستخدام التحليلات القائمة على omic ل CSF ، وجدت مجموعتنا أيضا أن السائل الدماغي الشوكي غني بالبروتينات التي تنظم إشارات عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) ، بالإضافة إلى المناعة الفطرية3. تؤكد هذه البيانات معا على قيمة CSF-CTCs من الخزعات السائلة لدراسة M-LMD.

في حين يمكن في بعض الأحيان تحديد CSF-CTCs عن طريق أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي للمريض عن طريق البزل القطني أو خزان Ommaya أو التشريح السريع ، فإن أحد القيود الرئيسية هو الحصول على أعداد كافية من هذه الخلايا النادرة والهشة 1,7. على سبيل المثال ، باستخدام تقنية تعداد CTC ، لا يمكن التعرف إلا على عدة مئات إلى عدة آلاف من الخلايا السرطانية لكل عينة CSF7 للمريض ، مما يجعل من الصعب إجراء التحليلات الجزيئية والوظيفية في المختبر أو في الجسم الحي. على الرغم من وجود تقارير عن النجاح في نمو CTCs لفترة وجيزة خارج الجسم الحي من الدم المحيطي (أي CTCs لسرطان الثدي)8،9،10 ، فإن هذه الخلايا عادة ما تنمو فقط على المدى القصير ، ولم يتم الإبلاغ عن أي حالات من القدرة على نمو سرطان الجلد CTCs في السائل الدماغي الشوكي. وبالتالي ، فإن إيجاد طرق لنشر سرطان الجلد CSF-CTCs ، أو CTCs بشكل عام ، سيكون مفيدا للغاية لدراسة بيولوجيا M-LMD 7,11.

لأول مرة ، تم وصف تقنية جديدة لنشر CSF-CTCs من مرضى M-LMD خارج الجسم الحي . هنا في هذا التقرير ، تم تطوير بروتوكول مفصل يسمح بزراعة وتوسيع CSF-CTCs من مرضى M-LMD. نظرا لأن السحايا تفرز مجموعة متنوعة من عوامل النمو مثل FGF و IGF و VEGF-A و IGFBPs التي تدعم النمو المحيط ببيئتها12،13،14،15،16 ، فقد تم ترشيد أن CSF-CTCs قد تتطلب هذه المكونات للنمو في ظروف خارج الجسم الحي . لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول وسائط مشروطة تم إنشاؤها عن طريق زراعة الخلايا السحائية البشرية - (HMCs-) في المختبر. بالنسبة للتلقيح في الجسم الحي ، يتم تلقيح الخلايا المشتقة من المريض في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لتوليد خطوط CSF-CTCs المشتقة من المريض (PD-CSF-CTCs). إن توافر خلايا M-LMD المشتقة من المريض سيدعم المقايسات الخلوية والجزيئية والوظيفية لدراسة M-LMD واقتراح استراتيجيات علاج جديدة لهذا المرض الفتاك.

Protocol

تمت الموافقة على جمع عينات السائل الدماغي الشوكي للمرضى الذين تم تحديد هويتهم من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة جنوب فلوريدا (IRB) (MCC 50103 و 50172 و 19332). يمكن تشخيص المرضى الذين يعانون من M-LMD بعدة طرق ، بما في ذلك علم الخلايا CSF الإيجابي ، أو التصوير بالرنين المغناطيسي المميز (MRI) للدماغ و / أو العمود الفقري ، أو مزيج من النتائج السريرية مع نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي الموحية. تم جمع السائل الدماغي الشوكي من مرضى M-LMD بشكل روتيني كجزء من رعايتهم السريرية القياسية. لا يتم تنفيذ أي إجراء ما لم يكن هناك مؤشر سريري. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى لجمع العينات واستخدامها للبحث والنشر. تمت الموافقة على توليد نماذج murine-LMD في الجسم الحي من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة جنوب فلوريدا (IACUC # IS00010398). يتم تلخيص المخطط العام لهذا البروتوكول في الشكل 1. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الوسائط المكيفة من قبل مؤسسة حمد الطبية

  1. قم بطلاء قارورة T175 ببولي ل ليسين عند 2 ميكروغرام / سم2.
  2. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. نضح محلول بولي ل ليسين باستخدام ماصة مصلية معقمة. لا يشترط شطف القارورة ، وهي جاهزة لثقافة مؤسسة حمد الطبية.
  4. استزرع ما يقرب من 1.0 × 106 HMCs في 30 مل من وسط الثقافة السحائية الكامل (MenCM) ، والذي يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ مكمل نمو الخلايا السحائية ، و 100 وحدة دولية / مل محلول مضاد حيوي للبنسلين والستربتومايسين لكل دورق. استزراع الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا في ظروف زراعة الأنسجة القياسية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. تغيير الوسائط كل 3 أيام.
  6. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 75٪ -80٪ تقريبا ، قم بجمع وحفظ الوسائط المزروعة HMC في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  7. قم بتقسيم HMCs إلى قوارير T175 جديدة و MenCM كاملة جديدة إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الوسائط المثقفة في مؤسسة حمد الطبية.
  8. إلى الوسائط المثقفة في مؤسسة حمد الطبية ، أضف نسبة 1: 1 من MenCM الكامل.
  9. أضف 20 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) ، وعامل نمو البشرة (EGF) 20 نانوغرام / مل ، والذي سيصبح الوسائط المكيفة من HMC ل CSF-CTCs.
    ملاحظة: يوصى بإضافة FGF و EGF جديدين عندما تكون CTCs جاهزة للزراعة.
  10. قم بتخزين الوسائط المكيفة HMC في قسامات سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يوصى بتخزين الوسائط المكيفة من HMC في القسامات عند 4 درجات مئوية ولكن ليس أكثر من 4 أسابيع.

2. جمع السائل الدماغي النخاعي ومعالجة العينات

  1. جهاز الطرد المركزي Prechill عن طريق ضبطه على 4 درجات مئوية.
  2. بمجرد سحبها من المريض ، ضع عينة السائل الدماغي النخاعي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل على الثلج على الفور لإبقائها باردة.
    ملاحظة: يسمح بروتوكول IRB المعتمد لدينا بسحب 7.5 مل من السائل الدماغي النخاعي من المريض الموافق.
  3. جهاز طرد مركزي CSF عند 257 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإزالة وحفظ وعمل حصص من طافي CSF دون إزعاج حبيبات الخلية في الأسفل. يمكن تخزين قسامات السائل الدماغي الشوكي المجمدة عند -80 درجة مئوية إذا لزم الأمر لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: قد لا تكون الحبيبات مرئية للعين المجردة; ومن ثم ، يقترح ترك ~ 40-50 ميكرولتر في قاع الأنبوب.
  5. في نفس الأنبوب ، أضف 1 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإعادة تعليق الخلايا وشطفها ، وكرر الدوران عند 257 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: (اختياري) إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) إذا كانت العينة تحتوي على تلوث الدم. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن بعض الخلايا يمكن أن تضيع أثناء العملية ، بما في ذلك CTCs. يمكن نشر CTCs دون إجراء تحلل كرات الدم الحمراء.
  6. قم بإزالة وتجاهل PBS دون إزعاج حبيبات الخلية ، واترك ~ 50 ميكرولتر في الأسفل.
  7. إجراء عدد الخلايا لتحديد صلاحية الخلية. من هنا ، هناك خياران للمضي قدما في زراعة CSF-CTCs: في الثقافة المختبرية (الخطوة 3) أو محاولة توسيع الطعم الأجنبي المشتق من المريض في الجسم الحي (الخطوة 4).
    ملاحظة: إذا كان سيتم استزراع CSF-CTCs في وقت لاحق ، فقم بحفظ الخلايا بالتبريد في وسائط تجميد زراعة الخلايا حتى تصبح جاهزة للتكاثر. يمكن إجراء وسائط تجميد ثقافة الخلية باستخدام 90٪ FBS + 10٪ DMSO. في حالة توفر السائل الدماغي النخاعي الزائد (على سبيل المثال ، يتم جمع أكثر من مجموعة CSF واحدة من المرضى أو CSF عند تشريح الجثة) ، يمكن تقييم CTCs عن طريق تقديم العينة لمقايسة تعداد CTC17 ، أو تلطيخ المناعي (IF) لعلامة سرطان الجلد (أي مضاد MLANA) والتي قد توفر رؤى حول كمية وجدوى CTCs. لا يمكن استعادة الخلايا بعد إجراء هذه التجارب. لذلك ، لا ينصح به إذا لم تكن هناك عينات CSF احتياطية من المريض.

3. في الثقافة المختبرية وتوسيع CSF-CTCs

  1. إعادة تعليق CSF-CTCs في الوسائط المكيفة بمؤسسة حمد الطبية. إذا تم حفظ CSF-CTCs بالتبريد ، فقم بإذابة الخلايا وتدويرها وغسلها برفق باستخدام برنامج تلفزيوني.
  2. قم بتقسيم جميع الخلايا في آبار ثلاثية في صفيحة 96 بئرا بحجم 150 ميكرولتر لكل بئر. فقط الخلايا القابلة للحياة سوف تلتصق برفق بالسطح بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف أعداد CSF-CTCs اختلافا كبيرا لكل عينة مريض (الجدول 1). بالنسبة للمرضى الذين يعانون من انخفاض عدد CTC ، يتم استخدام لوحة 96 بئرا كنقطة انطلاق للزراعة ، ويتم طلاء الحبيبات بأكملها دون حساب خوفا من فقدان CTCs. ومع ذلك ، إذا كان هناك كمية أكبر من السائل الدماغي الشوكي (أي تم الحصول عليها من تشريح الجثة) ، فمن الممكن عد الخلايا. لا يمكن لجميع الخلايا السرطانية أن تنمو خارج الجسم الحي. سوف يتوسع بعضها ببطء لعدة مقاطع قبل أن تصبح ثابتة. حاليا ، تبلغ فرصة نجاح نمو سرطان الجلد CSF-CTCs خارج الجسم الحي حوالي 60٪ 7.
  3. لكل 3 أيام ، قم بالتعبئة عن طريق إضافة وسائط جديدة مكيفة مع HMC أو قم بإزالة الوسائط برفق عن طريق وضع طرف الماصة على جانب البئر ، مع ترك بعض السوائل خلفها دون إزعاج قاع البئر ، ثم استبدلها بوسائط جديدة مكيفة مع HMC.
  4. عندما تتوسع CSF-CTCs خارج الجسم الحي وتصبح متقاربة بنسبة 90٪ ، قم بالتريبسين ونقل البئر بالكامل إلى بئر جديد في صفيحة مكونة من 24 بئرا. عندما يكون البئر في 24 بئرا متداخلا ، انقله إلى صفيحة من 12 بئرا ، ثم صفيحة من 6 آبار وهكذا.
    ملاحظة: بعد التربسين ، ضع في اعتبارك الحفظ بالتبريد لمجموعة فرعية صغيرة من CTCs في وسائط تجميد زراعة الخلايا (10٪ DMSO + 90٪ FBS) قبل الطلاء كنسخة احتياطية.
  5. الاستمرار في زراعة CTCs. قد تنتشر بعض الخلايا على المدى القصير وتصبح ثابتة في النهاية. ومع ذلك ، قد يتحول واحد أو أكثر من المستنسخة ويتوسع أضعافا مضاعفة (الشكل 2 أ). حدد هذه المستنسخة ، والتي ستصبح ثقافات CSF-CTC (PD-CSF-CTCs) المشتقة من المريض في المختبر.
    ملاحظة: إذا أصبحت هذه المستنسخة مكتظة أو متجمعة ، قم بالتريبسين وإعادة طلاء الخلايا في صفيحة / قارورة زراعة أنسجة جديدة.

4. التلقيح في الجسم الحي ل CSF-CTCs لتوليد نموذج xenograft المشتق من خط الخلية (CDX) أو نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX)

ملاحظة: يتضمن نموذج PDX تطعيم الخلايا السرطانية مباشرة من مريض السرطان (بدون ثقافة خارج الجسم الحي ) ، بينما يستخدم نموذج CDX خطوط الخلايا السرطانية أو ، في هذه الحالة ، CTCs التي تم نشرها وتخليدها18.

  1. استخدم الفئران التي تعاني من نقص المناعة NOD SCID جاما (NSG) لمدة 6-8 أسابيع لتلقيح CSF-CTCs. تستخدم NSGs لأنها تعاني من نقص شديد في المناعة وتتقبل جدا تطعيم الخلايا السرطانية البشرية19. بسبب نقص المناعة ، يجب أن تبقى هذه الفئران في بيئة صحية خاضعة لرقابة صارمة ويجب إيواؤها بمعزل عن سلالات الفئران الأخرى. تم وصف طريقة تقديم murine-LMD بالتفصيل في مكان آخر20.
    ملاحظة: تستخدم الخلايا خارج الجسم الحي (CSF-CTCs للمرضى التي تمت معالجتها فقط في الخطوة 2 دون زراعة) لإنشاء نموذج PDX ؛ هناك حاجة إلى المراقبة الجسدية للحيوان والتصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ لتحديد تطور LMD. من ناحية أخرى ، مع استخدام نموذج CDX في المختبر ، يمكن تسمية PD-CSF-CTCs بمراسل لوسيفيراز ، ويمكن تقييم حالة LMD عن طريق التصوير الحيوي (BLI). نظام وضع العلامات على الخلايا المستخدم في هذا التقرير هو مراسل NanoLuc (NL) الذي يستخدم furimazine كركيزة ، والتي ثبت أنها تزيد من الحساسية بما يتناسب مع نمو الورم21. لم يلاحظ تداخل نمو خلايا CTC (في المختبر أو في الجسم الحي) بواسطة تعبير NL.
  2. تحقق من وجود علامات على تطور LMD باستخدام هذه الطرق: الملاحظة الجسدية: فقدان الوزن ، إمالة الرأس ، وتحدب الظهر. التصوير بالرنين المغناطيسي: تضخم البطينين وعلامات استسقاء الرأس (الشكل 2 ب). BLI: إشارات التوهج الحيوي الإيجابية في منطقة الجهاز العصبي المركزي (الشكل 2C).

5. جمع CSF من الفئران مع LMD لتوسيع الاستنساخ اللاحق

  1. تخدير فأر NSG باستخدام LMD بنسبة 4٪ إيزوفلوران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) حتى لا تظهر أي علامات على رد الفعل الصحيح.
  2. تحضير الماوس عن طريق حلق الفراء من كامل السطح البطني للرأس وإعداد الجلد باستخدام تقنية معقمة.
  3. ضع الأنف باستخدام مخروط أنف معدل على شكل حرف L لجهاز التوجيه التجسيمي ، مما يضمن بقاء فتحتي الأنف دون عائق. قم بتأمين الجلد عن طريق سحبه برفق للأمام عبر الأسطح البطنية لكل من الصيوان بشريط لاصق ، وتثبيته على مخروط الأنف ، ثم ثني الرقبة بزاوية 90 درجة تقريبا بعد تثبيته. تطبيق 1.5٪-3٪ إيزوفلوران للحفاظ على التخدير.
  4. قم بتمديد الرقبة بالكامل والبدء بين الصيوان مباشرة ، وقم بتوجيه أطراف المقص الجراحي لأسفل عبر العظم القذالي بضغط طفيف.
    ملاحظة: في وضع خط الوسط هذا ، يمكن تمييز انخفاض دقيق عندما تدخل أطراف المقص إلى المنطقة المقعرة فوق الصهريج الكبير.
  5. قم بإنشاء شق صغير في خط الوسط بقياس 5-7 مم فوق التقعر المحسوس مباشرة.
  6. استخدم ملقط ذو رأس حاد بأطراف 1-2 مم للضغط برفق على الصهريج الكبير. قدم النصائح في وضع مغلق وافتحها أثناء ممارسة الضغط لأسفل على الجافية.
  7. كرر عملية التشريح الحاد كما هو موضح في الخطوة 6 حتى يمكن تمييز الغشاء الجافية بوضوح ، وتكون الأوعية الدموية المرتبطة مرئية داخل المنطقة المكشوفة.
  8. مع إبقاء الملقط مفتوحا لسحب العضلات المحيطة ، أدخل إبرة 27-29 جم متصلة بحقنة سعة 1 مل أسفل الجافية لتصور شطبة. تأكد من اختراق الإبرة خارج شطبة. تراجع تدريجيا المكبس حقنة.
  9. اجمع أكبر قدر ممكن من السائل الدماغي الشوكي (عادة بين 15-30 ميكرولتر) قبل القتل الرحيم للفئران.
    ملاحظة: يتم إنجاز القتل الرحيم ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا ، من خلال تعريض الموضوع لتركيزات متصاعدة من غاز CO2 المضغوط. على سبيل المثال ، سيتم استخدام معدل إزاحة من 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة لمنع أو تقليل الانزعاج أو الضيق. ويتبع ذلك ضمان وقف حركات القلب والأوعية الدموية والجهاز التنفسي من خلال المراقبة المطولة في هواء الغرفة لمدة تزيد عن 10 دقائق.
  10. انشر السائل الدماغي النخاعي من المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وضعه على الثلج.
  11. أدر العينة عند 257 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة السائل برفق (قم بتجميد عينة السائل الدماغي النخاعي للفأر عند -80 درجة مئوية إذا لزم الأمر لمزيد من التحليل) دون إزعاج حبيبات الخلية.
  12. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم واغسل حبيبات الخلية ؛ كرر الدوران عند 257 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. أعد تعليق الخلايا في وسائط مكيفة من HMC في لوحة 96 بئرا.
    ملاحظة: يجب أن تكون CSF-CTCs التي تم دمجها في الجسم الحي ونمت بنجاح إلى LMD قادرة على النمو مثل مزارع الخلايا الطبيعية. استمر في التوسع عن طريق تغيير الوسائط كل 3 أيام. التربسين ونقل الخلايا إلى جهاز زراعة خلايا أكبر عندما تكون الخلايا متقاربة. ستصبح هذه الخلايا ثقافات PD-CSF-CTC في الجسم الحي. في التقرير الحالي ، كان هناك معدل نجاح بنسبة 100٪ مع نموذج CDX ، ولم يتم إنشاء PDX M-LMD بعد.

النتائج

إن فهم متطلبات نمو CSF-CTCs الناجح خارج الجسم الحي هو جهد مستمر. تحقيقا لهذه الغاية ، يعتقد أن توفير العوامل الأساسية التي تحاكي البيئة المكروية CSF له أهمية رئيسية22. تفرز الخلايا السحائية البشرية (HMCs) مجموعة متنوعة من عوامل النمو في السائل الدماغي الشوكي ، بما في ذلك FGF-2 و EGF و IGFBP2 و IGFBP6 ، ومن المعروف أنها تدعم نمو خلايا CTC12،13،14،23،24. لذلك ، تم إجراء تحليل مصفوفة السيتوكين البشري على وسائط مكيفة HMC لتحديد المكونات المهمة المحتملة المطلوبة لبقاء CTC. في الواقع ، تم تنظيم العديد من عوامل النمو في وسائل الإعلام المستزرعة مع HMCs (الشكل 3 أ). على سبيل المثال ، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، VEGF-A ، و IGFBPs (IGFBP2 و 3 و 4 و 6).

قد تتكون المكونات الخلوية CSF من المرضى من أنواع متعددة من الخلايا ، مثل CTCs والخلايا المناعية والخلايا الليفية. ستتوقف غير CTCs في النهاية عن تمرير العمل الإضافي. بشكل عام ، الخلايا التي تنتشر بنجاح وتبقى في الانتشار هي خلايا سرطانية (M-LMD). التحقق من صحة الخلايا النامية في الثقافة هو في الواقع خلايا M-LMD ، والتي يمكن القيام بها عن طريق اكتشاف IF لتعبير MLANA والتحليلات النسخية ، والتي سبق أن أظهرت7.

كدليل على المفهوم لإظهار الاستخدام والتطبيق المحتملين لخطوط PD-CSF-CTC المنشأة في المختبر وفي الجسم الحي ، تم استخدام تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) ، وكشفت النتائج عن العديد من الجينات التي تم إثراؤها والاحتفاظ بها من المريض غير المزروع CSF-CTCs7. اثنان منهم يشملان مستقبلات بروتين التيروزين كيناز ErbB3 و IGF-1R ، والتي لها آثار على تطور سرطان الجلد ومقاومة العلاج الكيميائي25،26،27.

لاختبار ما إذا كانت قد لعبت دورا في بقاء CSF-CTC ، تم إجراء اختبار انتشار بنفسجي بلوري على PD-CSF-CTCs المعالجة بالأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء tucatinib و ceritinib التي تستهدف ErbB28 و IGF-1R 7,29 على التوالي. تم تضمين الجسم المضاد ل IGFBP2 كعنصر تحكم إيجابي يجب أن يعيق نمو ثقافات PD-CSF-CTC. أظهرت النتائج أن غياب IGFBP2 أو IGF-1R كان فعالا في الحد من انتشار PD-CSF-CTCs (الشكل 3B). بالنظر إلى أن إشارات MAPK هي في اتجاه مجرى IGF-1R ، فقد تم أيضا إجراء تلطيخ الخلايا الحية calcein-AM ومقايسات بقاء الخلايا MTT في ثلاثة خطوط M-LMD PD-CSF-CTC عن طريق معالجتها باستخدام ceritinib أو مثبطات MAPK ، دابرافينيب وتراميتينيب أو مزيج من الثلاثة. أظهرت البيانات أن صلاحية جميع خطوط الخلايا الثلاثة قد انخفضت بشكل كبير بواسطة ceritinib ، في حين أن dabrafenib و trametinib كان لهما تأثيرات مختلطة (الشكل 3C). كانت نتيجة علاجات ديبرافينيب وتراميتينيب مفاجئة. تم اشتقاق جميع خطوط PD-CSF-CTC الثلاثة من مرضى M-LMD الذين لديهم طفرة BRAFV600E 7. قد يشير هذا إلى تأثير مقاومة كيميائية مكتسب ل CSF-CTCs ، وهو أمر يجب التحقيق فيه في المستقبل.

بعد ذلك ، كمثال على كيفية استخدام PD-CSF-CTCs في الجسم الحي ، تم إنشاء نماذج murine-M-LMD عن طريق التلقيح داخل القراب بأعداد متفاوتة من PD-CSF-CTCs. تم تحديد متوسط أوقات البقاء على قيد الحياة في الفئران (الشكل 3D). لتصور تقدم M-LMD ، تم تمييز خطوط PD-CSF-CTC بعلامة مضيئة بيولوجيا ، مثل نظام مراسل NL21 ، وتم التقاطها بواسطة BLI (الشكل 2C). كما تم توضيح موقع نقائل LMD باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع بروتين melan-A (MLANA)30 كعلامة لخلايا سرطان الجلد (الشكل 3E). كدليل على مفهوم اختبار الاستراتيجيات العلاجية ضد M-LMD في الجسم الحي ، تم إعطاء مجموعات murine-M-LMD علاجا وحيدا يوميا عن طريق الفم من ceritinib أو trametinib ، أو مزيج من dabrafenib و trametinib أو ceritinib و trametinib. تلقت المجموعة الضابطة (غير المعالجة) محلول ملحي عن طريق الفم كمقارنة. أظهرت النتائج بقاء لفترة طويلة بشكل ملحوظ (الشكل 3F) وتأخر اكتشاف المرض (الشكل 3G) في المجموعة التي عولجت ب ceritinib و trametinib (متوسط البقاء على قيد الحياة M-LMD غير المعالج: 28.5 يوما مقابل ceritinib و trametinib المعالجين ب M-LMD متوسط البقاء على قيد الحياة: 38.5 يوما. قيمة P = 0.0052). تؤكد هذه البيانات على الفائدة المحتملة لخطوط M-LMD PD-CSF-CTC المطورة لإجراء الدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية العلاجات الجديدة.

figure-results-4766
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لعملية إنشاء الخلايا السرطانية المنتشرة من السائل الدماغي النخاعي المشتقة من المريض (PD-CSF-CTCs). يمكن أخذ عينات من السائل الدماغي النخاعي من المرضى عن طريق البزل القطني أو خزان أومايا أو التشريح السريع. من خلال سلسلة من عمليات الانتشار في المختبر وفي الجسم الحي ، تولد كل خطوة ثقافة CSF-CTC وسيطة (أي CSF-CTCs للمريض ، في الثقافة المختبرية ، في الثقافة الحية ) حتى إنشاء خط PD-CSF-CTC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5567
الشكل 2: أمثلة على الزراعة في المختبر وفي الجسم الحي ل CSF-CTCs المشتقة من مرضى M-LMD. (أ) صور برايتفيلد تمثيلية تظهر النمو في المختبر لمستعمرة M-LMD CSF-CTC في 6 أسابيع و 9 أسابيع في وسائط مكيفة HMC. شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. (ب) صور التصوير بالرنين المغناطيسي في 4 أسابيع و 8 أسابيع بعد تلقيحها داخل القراب باستخدام PD-CSF-CTCs ؛ إنشاء ناجح لنموذج الفئران من M-LMD. تشير الأسهم الصفراء إلى تضخم البطينين واستسقاء الرأس المحتمل في هذا الفأر M-LMD. (ج) تصور BLI التمثيلي لتطور M-LMD في الفئران. هذا الرقم مقتبس من القانون وآخرون.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6545
الشكل 3: تستخدم خطوط PD-CSF-CTC في تجارب ما قبل السريرية المختلفة لدراسة M-LMD. (أ) مجموعة من السيتوكينات البشرية تظهر زيادة في عوامل النمو المفرزة المختلفة (مثل IGFBPs و VEGF-A و GM-CSF) في وسائط الاستزراع (MenCM) في وجود خلايا سحائية بشرية (HMCs). (ب) صورة ممسوحة ضوئيا لمقايسة تكاثر الخلايا البنفسجية البلورية لتحديد فعالية الجسم المضاد ل IGFBP2 ، توكاتينيب ، وسيريتينيب مقابل أحد خطوط PD-CSF-CTC. أعطيت حالة السيطرة علاج السيارة. أجريت التجربة في ثلاث نسخ. (ج) اختبار بقاء الخلية لثلاثة خطوط مختلفة من PD-CSF-CTC (من المرضى 09 و 12 و 16) في المختبر. عولجت الخلايا إما بسيريتينيب (cer) ، أو مزيج من دابرافينيب (dab) + trametinib (tra) ، أو cer + tra ، أو الثلاثة. تم جمع الخلايا في 72 ساعة بعد العلاج. تم استخدام تلطيخ Calcein-AM لتصور صلاحية الخلية ، وتم استخدام اختبار MTT لتحديد بقاء الخلية. تم استخدام اختبار t لعينة مزدوجة للتحليل الإحصائي. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (د) منحنى البقاء على قيد الحياة لنموذج M-LMD الفأر. تم تلقيح الفئران NSG داخل القراب (عبر Cisterna magna) بأحد خطوط PD-CSF-CTC في 10000 و 20000 و 50000 خلية. تم تحديد متوسط بقاء الفئران M-LMD. (ه) الكشف عن IHC ل MLANA ، وهي علامة لسرطان الجلد ، في أقسام الدماغ من الفئران M-LMD. تم العثور على MLANA إيجابي في السحايا (ملطخة باللون الأحمر ؛ مدببة بأسهم صفراء) ، في حين أن الدماغ الطبيعي (السليم) لم يظهر نموا للسرطان (سلبي ل MLANA). قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (F) تجربة فعالية تمثيلية لمجموعات الفئران M-LMD التي تعطى إما محلول ملحي فموي يومي ، أو cer ، أو tra ، أو dab / tra أو cer / tra. تم تحديد بقاء الفئران. تم استخدام اختبار رتبة اللوغاريتم (Mantel-Cox) للتحليل الإحصائي. (G) صور BLI التمثيلية لتطور M-LMD في 5 أسابيع ، مقارنة المجموعة الضابطة (المالحة) المعالجة مقابل CER / TRA تعامل الفئران M-LMD الأفواج. اللوحة (جيم) من الشكل مقتبسة من القانون وآخرون.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص ل CSF-CTCs السريرية التي تم الحصول عليها للثقافة خارج الجسم الحي في مرضى M-LMD. جدول ملخص ل 11 مريضا من مرضى M-LMD ، والتي تمت محاولة نشر CSF-CTCs الخاصة بهم. تم وصف المرضى في الجدول سابقا في Law et al.7. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

M-LMD هو مرض مدمر ومميت عالميا ، وهناك حاجة ملحة لإيجاد استراتيجيات علاج أفضل. أحد العوائق الرئيسية لدراسة M-LMD هو عدم القدرة على الحصول على ما يكفي من CSF-CTCs لإجراء الدراسات الجزيئيةوالوظيفية 1,7. على الرغم من وجود طرق حالية لزراعة CTCs من الدم المحيطي و CSF لأنواع السرطان الأخرى ، مثل سرطان الثدي والمبيض11،31،32 ، فإن طرق انتشار CTC هذه عادة ما تكون قصيرة الأجل ، ولم يتم الإبلاغ عن نجاح في زراعة CSF-CTCs من سرطان الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المنهجيات الحالية لنشر CTCs موجودة في إعدادات قصيرة الأجل خارج الجسم الحي ولم تسفر بعد عن نموذج LMD في الجسم الحي مشتق من خلايا LMD المريضة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول جديد لزراعة هذه الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يؤدي إلى خطوط خلايا فريدة مشتقة من المريض. حاليا ، من بين 11 مريضا من M-LMD في الدراسة ، كانت هناك فرصة 60٪ تقريبا (7 من 11) للنجاح في نشر M-LMD CSF-CTCs في المختبر ، وبينما تم تخفيض هذا إلى ~ 20٪ (2 من 11) في الجسم الحي باستخدام طريقة CDX7.

من الواضح أن الظروف في المختبر لا تلخص البيئة المكروية CSF. ومع ذلك ، فقد تم تنفيذ النهج البروتينية سابقا لدراسة مكونات البروتين في السائل الدماغي الشوكي وقدمت بعض الأفكار حول العوامل الرئيسية التي كانت مطلوبة لنمو CTC خارج الجسم الحي3. على سبيل المثال ، تم تحديد أن أحد المسارات الرئيسية التي تعزز بقاء CTC في مرضى M-LMD كان مرتبطا بالأنشطة المتزايدة المتعلقة ب IGF 3,7. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن leptomeninges تفرز مجموعة متنوعة من السيتوكينات / عوامل النمو في السائل الدماغي الشوكي ، بما في ذلك FGF-2 و EGF و GM-CSF والبروتينات المتعلقة بإشارات IGF12. في الواقع ، تم تلخيص ذلك في وسائل الإعلام المثقفة مع HMCs ، مما يدعم الدور المحتمل لعوامل النمو هذه في تعزيز نمو CSF-CTC.

تتمثل الميزة الرئيسية في إنشاء نموذج PDX (أو CDX) في القدرة على اكتساب رؤى أعمق في أمراض المرض ، وهو أمر تفتقر إليه الظروف في المختبر . من الناحية المثالية ، يفضل اتباع نهج PDX لأن CSF-CTCs ستكون مباشرة من المرضى الذين ليس لديهم زراعة خارج الجسم الحي . في البداية ، بذلت محاولات لإنشاء M-LMD باستخدام هذا النهج ، لكنها لم تنجح حتى الآن. من المحتمل أن ترتبط صعوبة توليد فئران PDX بوفرة وسلامة المواد الأولية (أي عدد قليل جدا من CTCs القابلة للحياة في السائل الدماغي الشوكي للمريض عند الجمع الروتيني في العيادة). قد يفسر هذا سبب نجاحنا المتفوق في نمو CTCs من CSF الذي تم جمعه في تشريح الجثة7. لزيادة احتمال الانتشار في الجسم الحي ، تم تعديل هذا البروتوكول لتوفير نهج CDX بديل. يمكن توسيع CSF-CTCs أولا في المختبر (الخطوة 3) لإنشاء خطوط PD-CSF-CTC التي تتمتع بإمكانات نمو طويلة الأجل وأكبر. ثم يتم تلقيح هذه الخلايا في الفئران لإنشاء M-LMD. على الرغم من أن الطريقة الحالية ولدت عددا محدودا من نماذج CDX M-LMD (~ 20٪) في الجسم الحي ، إلا أن هذا قد يعكس التنوع النسخي ل CSF-CTCs ، وتعقيد البيئة المكروية CSF ، وصعوبة زراعة هذه الخلايا بشكل عام. نحن نفترض أن التطوير المستقبلي لنموذج فأر متوافق مع البشر قد يعزز معدل نجاح النقش نظرا لأهمية البيئة المكروية في دعم بقاء الخلايا السرطانية33.

يتمثل أحد قيود نهج CDX في أنه تم اختيار بعض المستنسخة فقط من عينات المرضى ، وقد لا يعكس الانجراف الجيني للخلايا السرطانية من خلال الزراعة خارج الجسم الحي ملف النسخ للمصدر الأصلي. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أنه على الرغم من الزراعة في المختبر ، احتفظت خطوط PD-CSF-CTC بحوالي 97٪ من تشابه التعبير الجيني مع مرضى CSF-CTCs7 المعزولين وغير المزروعين. في تلك الدراسة ، كشفت تحليلات scRNA-seq عن تداخل التوقيعات الجينية المخصبة بين PD-CSF-CTCs غير المزروعة في المختبر وفي الجسم الحي PD-CSF-CTCs ، مثل SOX9 و ErbB3 و IGF-1R7 ، مما يشير إلى أن هذه قد تكون أهدافا علاجية محتملة. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك هذه الجينات المخصبة بشكل شائع في المسارات البيولوجية المرتبطة بتنظيم النسخ والتمثيل الغذائي7. بشكل جماعي ، يسلط هذا الضوء على القيمة الانتقالية لثقافات PD-CSF-CTC لفهم بيولوجيا M-LMD بشكل أفضل ، وتحديد الآليات والمسارات الجزيئية المستهدفة التي تقود المرض ، وتصميم علاجات عقلانية في الدراسات المستقبلية.

على الرغم من أن المنهجية الحالية لا تزال غير كاملة ، حيث لا توجد طريقة لتحديد مسبق لحالة وصلاحية CSF-CTCs في مرضى M-LMD ، فقد تم إجراء العديد من الملاحظات التي من شأنها أن تزيد من احتمال النجاح لأن CTCs منخفضة العدد وهشة للغاية. وتشمل هذه الخطوات الحاسمة التنسيق مع العيادة لوضع عينات السائل الدماغي الشوكي على الثلج بمجرد سحبها ونقلها بسرعة إلى المختبر للحفاظ على سلامة الخلايا. بعد ذلك ، يجب معالجة CSF-CTCs على الفور ، إما عن طريق طلائها في الثقافة أو حفظ الخلايا بالتبريد.

بشكل عام ، كانت زراعة وتوسيع CSF-CTCs عملية تجربة وخطأ ، لكن إنشاء هذا البروتوكول لتوليد خلايا M-LMD المشتقة من المريض سيمنح الباحثين الموارد اللازمة لإجراء تجارب على عينات المرضى ، والتي لم يكن من الممكن القيام بها من قبل. يتمثل أحد الأهداف الرئيسية للمضي قدما في استخدام M-LMD PD-CSF-CTCs لإجراء التوصيف الجزيئي ، وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ، ودراسات فعالية الأدوية في الجسم الحي لتصميم علاجات عقلانية لعلاج M-LMD. ويعتقد أن هذا النهج سيؤدي إلى استراتيجيات علاجية من شأنها أن تقلل بشكل كبير من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا الجانب المميت حاليا من سرطان الجلد النقيلي المتقدم.

Disclosures

يعمل بيتر فورسيث في المجالس الاستشارية لشركة Abvie Inc و Bayer و Bristol Meyers Squib و BTG و Inovio و Novocure و Tocagen و Ziopharm ، خارج العمل المقدم. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر المرضى والعائلات على كرمهم الاستثنائي في التبرع بالأنسجة لهذه الدراسة العلمية. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة منح P50 CA168536 و R21 CA256289 و R21 CA216756 (إلى KSMS و PAF) K99 CA226679 (إلى IS). صندوق تسريع أبحاث مؤسسة موفيت (إلى BC و PAF) ، برنامج موفيت للبيولوجيا الكيميائية والطب الجزيئي (PAF و DD) ، مؤسسة موفيت (PAF). يتم دعم الجينوم الجزيئي والأنسجة والمعلوماتية الحيوية والإحصاء الحيوي في Moffitt جزئيا من قبل المعهد الوطني للسرطان من خلال منحة دعم مركز السرطان (P30-CA076292) ومؤسسة موفيت.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe 27 - 29 G needlesAny vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubesAny vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubesAny vendorn/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) miceCharles RiverMales optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR)Zoopharm DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS)ScienCell#0010
Gas inhalation anestehsia systemVeteEquip#901812COMPAC5
Hamilton microliter syringesHamilton10, 25, 50, and 100ml30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)Milipore Sigma (or any vender)#F0291
Human epidermal growth factor (EGF)Milipore Sigma (or any vender)#SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeningesScienCell#1400
IVIS 200 imaging systemCaliper Life Sciencesn/a
Magnifying glass with lightAny vendorn/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM)ScienCell#1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS)ScienCell#1452
MRI imagingBrukerBioSpec seriesOptional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solutionScienCell (or any vender)#0503
Phosphate buffered saline (PBS)Any vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps)Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes 
Sterile blue paper/ drape coveringAny vendorn/an/a
Sterile cotton sticksAny vendorn/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)

References

  1. Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).
  2. Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases. Cancers (Basel). 15 (6), 1884 (2023).
  3. Smalley, I., et al. Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance). Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).
  4. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).
  5. Boire, A., et al. Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis. Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).
  6. Chi, Y., et al. Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis. Science. 369 (6501), 276-282 (2020).
  7. Law, V., et al. A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma. Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).
  8. Carmona-Ule, N., et al. Short-term ex vivo culture of CTCs from advance breast cancer patients: Clinical implications. Cancers (Basel). 13 (11), 2668 (2021).
  9. Zhang, L., et al. The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis. Sci Transl Med. 5 (180), (2013).
  10. Yu, M., et al. Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  11. Mohamed, B. M., et al. Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs). Sci Rep. 13 (1), 3704 (2023).
  12. Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: From protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
  13. Mercier, F., Hatton, G. I. Connexin 26 and basic fibroblast growth factor are expressed primarily in the subpial and subependymal layers in adult brain parenchyma: Roles in stem cell proliferation and morphological plasticity. J Comp Neurol. 431 (1), 88-104 (2001).
  14. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).
  15. Nordqvist, A. C., Mathiesen, T. Expression of IGF-II, IGFBP-2, -5, and -6 in meningiomas with different brain invasiveness. J Neurooncol. 5, 19-26 (2002).
  16. Zumkeller, W., Westphal, M. The IGF/IGFBP system in CNS malignancy. Mol Pathol. 54 (4), 227-229 (2001).
  17. Wang, L., et al. Promise and limits of the CellSearch platform for evaluating pharmacodynamics in circulating tumor cells. Semin Oncol. 43 (4), 464-475 (2016).
  18. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8, 160 (2023).
  19. Chen, J., et al. The development and improvement of immunodeficient mice and humanized immune system mouse models. Front Immunol. 13, 1007579 (2022).
  20. Law, V., et al. A Murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033 (2021).
  21. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
  22. Luo, Y. T., et al. The viable circulating tumor cells with cancer stem cells feature, where is the way out. J Exp Clin Cancer Res. 37, 38 (2018).
  23. Stumm, R., Kolodziej, A., Schulz, S., Kohtz, J. D., Hollt, V. Patterns of SDF-1alpha and SDF-1gamma mRNAs, migration pathways, and phenotypes of CXCR4-expressing neurons in the developing rat telencephalon. J Comp Neurol. 502 (3), 382-399 (2007).
  24. Aviezer, D., et al. basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis. Cell. 79 (6), 1005-1013 (1994).
  25. Tiwary, S., et al. ERBB3 is required for metastasis formation of melanoma cells. Oncogenesis. 3 (7), e110 (2014).
  26. Sun, X., et al. miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways. Oncotarget. 7 (33), 53558-53570 (2016).
  27. Satyamoorthy, K., Li, G., Vaidya, B., Patel, D., Herlyn, M. Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways. Cancer Res. 61 (19), 7318-7324 (2001).
  28. Lin, N. U., et al. Tucatinib vs Placebo, both in combination with Trastuzumab and Capecitabine, for previously treated ERBB2 (HER2)-positive metastatic breast cancer in patients with brain metastases: Updated exploratory analysis of the HER2CLIMB randomized clinical trial. JAMA Oncol. 9 (2), 197-205 (2023).
  29. Russo, A., et al. Ceritinib-induced regression of an insulin-like growth factor-driven neuroepithelial brain tumor. Int J Mol Sci. 20 (17), 4267 (2019).
  30. Ohsie, S. J., Sarantopoulos, G. P., Cochran, A. J., Binder, S. W. Immunohistochemical characteristics of melanoma. J Cutan Pathol. 35 (5), 433-444 (2008).
  31. Kulasinghe, A., et al. Short term ex-vivo expansion of circulating head and neck tumour cells. Oncotarget. 7 (37), 60101-60109 (2016).
  32. Li, X., et al. Clinical significance of detecting CSF-derived tumor cells in breast cancer patients with leptomeningeal metastasis. Oncotarget. 9 (2), 2705-2714 (2018).
  33. Lelliott, E. J., et al. A novel immunogenic mouse model of melanoma for the preclinical assessment of combination targeted and immune-based therapy. Sci Rep. 9 (1), 1225 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Leptomeningeal MAPK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved