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Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Vermehrung von zerebralen Tumorzellen (CSF-CTCs) beschrieben, die von Patienten mit Melanom-assoziierter leptomeningealer Erkrankung (M-LMD) gesammelt wurden, um präklinische Modelle zur Untersuchung von M-LMD zu entwickeln.

Zusammenfassung

Die Melanom-assoziierte leptomeningeale Erkrankung (M-LMD) tritt auf, wenn zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) eindringen und die Hirnhäute, die Membranschichten, die das Gehirn und das Rückenmark schützen, besiedeln. Einmal etabliert, ist die Prognose für M-LMD-Patienten düster, wobei das Gesamtüberleben zwischen Wochen und Monaten liegt. Dies ist vor allem auf ein mangelndes Verständnis der Krankheit und damit auf die Verfügbarkeit wirksamer Behandlungsmöglichkeiten zurückzuführen. Die Definition der zugrunde liegenden Biologie von M-LMD wird die Fähigkeit erheblich verbessern, verfügbare Therapien für die Behandlung von M-LMD anzupassen oder neuartige Inhibitoren für diese universell tödliche Krankheit zu entwickeln. Ein großes Hindernis besteht jedoch darin, ausreichende Mengen an CTCs aus dem patienteneigenen Liquor (CSF-CTCs) zu gewinnen, um präklinische Experimente durchzuführen, wie z. B. molekulare Charakterisierung, Funktionsanalyse und In-vivo-Wirksamkeitsstudien . Auch die Kultivierung von CSF-CTCs ex vivo hat sich als Herausforderung erwiesen. Um dies zu adressieren, wird ein neuartiges Protokoll für die Kultivierung von patienteneigenen M-LMD CSF-CTCs ex vivo und in vivo entwickelt. Es hat sich herausgestellt, dass der Einbau von konditionierten Medien, die von menschlichen Meningealzellen (HMCs) produziert werden, für das Verfahren von entscheidender Bedeutung ist. Die Zytokin-Array-Analyse zeigt, dass Faktoren, die von HMCs produziert werden, wie z. B. insulinähnliche Wachstumsfaktor-bindende Proteine (IGFBPs) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-A (VEGF-A), wichtig für die Unterstützung des Überlebens von Liquor und CTC ex vivo sind. Hier wird die Nützlichkeit der isolierten patienteneigenen CSF-CTC-Linien bei der Bestimmung der Wirksamkeit von Inhibitoren demonstriert, die auf die Signalwege des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF) und der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) abzielen. Darüber hinaus wird die Fähigkeit gezeigt, diese Zellen in vivo intrathekal zu inokulieren, um Mausmodelle von M-LMD zu etablieren, die für die präklinische Erprobung zugelassener oder neuartiger Therapien eingesetzt werden können. Diese Werkzeuge können helfen, die zugrunde liegende Biologie zu entschlüsseln, die die Etablierung von Liquor-CTC in den Hirnhäuten antreibt, und neue Therapien zu identifizieren, um die mit M-LMD verbundene Morbidität und Mortalität zu reduzieren.

Einleitung

Die leptomeningeale Disease (LMD) tritt auf, wenn zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) disseminieren und sich in den Hirnhäuten, der Membran, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt, etablieren 1,2. LMD kann bei mehreren Krebsarten auftreten, ist aber besonders häufig bei Melanomen. In fortgeschrittenen Stadien des Melanoms entwickeln etwa 5% der Patienten eine Melanom-assoziierte M-LMD 2,3. Die Folgen der M-LMD sind zwar im Vergleich zu anderen Metastasierungsstellen relativ gering, aber mit einem Gesamtüberleben von Wochen bis Monaten verheerend und tragen wesentlich zur Morbidität der Patienten bei 1,3,4. Dies ist in erster Linie auf einen Mangel an wirksamen Behandlungsmöglichkeiten in Kombination mit großen Wissenslücken darüber zurückzuführen, wie die Leptomeninge von Melanomzellen besiedelt werden2. Daher wird das Verständnis der Biologie von M-LMD die Entwicklung neuartiger Therapien zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse erleichtern.

Jüngste Berichte haben gezeigt, wie CTCs die einzigartige Liquor-Mikroumgebung besiedeln. Zum Beispiel fördert Komplement C3 die Invasion von Tumorzellen in den Liquor über den Plexus choroideus, ein kompliziertes Netzwerk von Blutgefäßen in jedem Ventrikel des Gehirns5. Darüber hinaus können CTCs als Reaktion auf die knappen Mikronährstoffe im Liquor Lipocalin-2, ein Eisenfängerprotein, und seine Rezeptor-SLC22A17 hochregulieren, um das Überleben zu verbessern6. Mit Hilfe von omikbasierten Analysen des Liquors fand unsere Gruppe auch heraus, dass der Liquor mit Proteinen angereichert ist, die die Signalübertragung des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF) sowie die angeborene Immunität regulieren3. Zusammengenommen unterstreichen diese Daten den Wert von Liquor-CTCs aus Flüssigbiopsien für die Untersuchung von M-LMD.

Während Liquor-CTCs manchmal durch Probenahme von Liquor des Patienten über eine Lumbalpunktion, ein Ommaya-Reservoir oder eine schnelle Autopsie identifiziert werden können, besteht eine große Einschränkung darin, eine ausreichende Anzahl dieser seltenen und fragilen Zellen zu erhalten 1,7. So sind bei der CTC-Zähltechnik nur einige hundert bis mehrere tausend Tumorzellen pro Liquorprobedes Patienten identifizierbar 7, was die Durchführung molekularer und funktioneller Analysen in vitro oder in vivo erschwert. Obwohl es Berichte über Erfolge bei der kurzzeitigen Ex-vivo-Züchtung von CTCs aus peripherem Blut (d. h. Brustkrebs-CTCs) gibt8,9,10, wachsen diese Zellen in der Regel nur kurzfristig, und es wurden keine Fälle berichtet, in denen Melanom-CTCs im Liquor gezüchtet werden konnten. Daher wird die Suche nach Wegen zur Vermehrung von Melanom-CSF-CTCs oder CTCs im Allgemeinen für die Untersuchung der Biologie von M-LMD von großem Nutzen sein 7,11.

Zum ersten Mal wird eine neuartige Technik zur Vermehrung von Liquor-CTCs von M-LMD-Patienten ex vivo beschrieben. In diesem Bericht wurde ein detailliertes Protokoll entwickelt, das die Kultivierung und Expansion von Liquor-CTCs von M-LMD-Patienten ermöglicht. Da die Hirnhäute eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren wie FGF, IGF, VEGF-A und IGFBPs sezernieren, die das Wachstum in ihrer Umgebung unterstützen 12,13,14,15,16, wurde rationalisiert, dass CSF-CTCs diese Komponenten möglicherweise benötigen, um unter ex vivo-Bedingungen zu wachsen. Daher werden in diesem Protokoll konditionierte Medien verwendet, die durch die Kultivierung von humanen Meningealzellen (HMCs) in vitro erzeugt werden. Für die In-vivo-Inokulation werden von Patienten stammende Zellen in immundefiziente Mäuse inokuliert, um von Patienten stammende Liquor-CTCs (PD-CSF-CTCs) zu erzeugen. Die Verfügbarkeit von patienteneigenen M-LMD-Zellen wird zelluläre, molekulare und funktionelle Assays unterstützen, um M-LMD zu untersuchen und neue Behandlungsstrategien für diese tödliche Krankheit vorzuschlagen.

Protokoll

Die Entnahme von deidentifizierten Liquorproben von Patienten wurde vom Institutional Review Board (IRB) der University of South Florida genehmigt (MCC 50103, 50172 und 19332). Patienten mit M-LMD können auf verschiedene Weise diagnostiziert werden, einschließlich einer positiven Liquorzytologie, einer charakteristischen Magnetresonanztomographie (MRT) des Gehirns und/oder der Wirbelsäule oder einer Kombination aus klinischen Befunden und suggestiven MRT-Befunden. Liquor von diesen M-LMD-Patienten wurde routinemäßig als Teil ihrer klinischen Standardversorgung entnommen. Es wird kein Eingriff durchgeführt, es sei denn, es liegt eine klinische Indikation vor. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde für die Entnahme von Proben und deren Verwendung für Forschungs- und Veröffentlichungszwecke eingeholt. Die Generierung von in vivo murinen LMD-Modellen wurde vom University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC# IS00010398) genehmigt. Das Gesamtschema dieses Protokolls ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von HMC-konditionierten Medien

  1. Einen T175-Kolben mit Poly-L-Lysin bei 2 μg/cm2 vorpolieren.
  2. Stellen Sie den Kolben für 1 h in einen 37 °C heißen Inkubator.
  3. Aspirieren Sie die Poly-L-Lysin-Lösung mit einer sterilen serologischen Pipette. Es ist nicht erforderlich, den Kolben zu spülen, und ist bereit für die HMC-Kultur.
  4. Kultivieren Sie ca. 1,0 x 106 HMCs in 30 ml vollständigem Meningealkulturmedium (MenCM), das 5 % fötales Rinderserum, 1 % meningeale Zellwachstumsergänzung und 100 I.E./ml Penicillin-Streptomycin-Antibiotikalösung pro Kolben enthält. Die Zellen werden im Zellkultur-Inkubator unter Standard-Gewebekulturbedingungen bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
  5. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.
  6. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 75 % bis 80 % erreichen, sammeln Sie die HMC-Kulturmedien und bewahren Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf.
  7. Teilen Sie HMCs in neue T175-Kolben und frische komplette MenCM auf, wenn mehr HMC-Kulturmedien benötigt werden.
  8. Fügen Sie den HMC-Kulturmedien ein Verhältnis von 1:1 vollständiges MenCM hinzu.
  9. Fügen Sie 20 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und 20 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) hinzu, die zu den HMC-konditionierten Medien für Liquor-CTCs werden.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, frischen FGF und EGF hinzuzufügen, wenn die CTCs für die Kultivierung bereit sind.
  10. HMC-konditionierte Medien in 50-ml-Aliquoten bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, HMC-konditionierte Medien in Aliquoten bei 4 °C, jedoch nicht länger als 4 Wochen zu lagern.

2. Liquorentnahme und Probenaufbereitung

  1. Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
  2. Sobald die Liquorprobe dem Patienten entnommen wurde, legen Sie sie sofort in ein konisches 15-ml-Röhrchen auf Eis, um sie kühl zu halten.
    HINWEIS: Unser IRB-zugelassenes Protokoll ermöglicht die Entnahme von 7,5 ml Liquor von dem eingewilligten Patienten.
  3. Zentrifugieren Sie den Liquor bei 257 x g für 5 min bei 4 °C.
  4. Entfernen, aufbewahren und aliquotieren des Liquorüberstandes, ohne das Zellpellet am Boden zu stören. Liquor-Überstandsaliquote können bei Bedarf für weitere Analysen bei -80 °C gefroren gelagert werden.
    HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise mit bloßem Auge nicht sichtbar. Daher wird empfohlen, ~40-50 μl am Boden des Röhrchens zu belassen.
  5. Geben Sie im selben Röhrchen 1 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um die Zellen zu resuspendieren und zu spülen, und wiederholen Sie das Schleudern bei 257 x g für 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: (Optional) Führen Sie eine Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) durch, wenn die Probe eine Blutkontamination enthält. Beachten Sie jedoch, dass einige Zellen, einschließlich CTCs, während des Prozesses verloren gehen können. CTCs können ohne das Erythrozytenlyseverfahren vermehrt werden.
  6. Entfernen und entsorgen Sie PBS, ohne das Zellpellet zu stören, und lassen Sie ~50 μl am Boden.
  7. Führen Sie eine Zellzählung durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Von hier aus gibt es zwei Möglichkeiten, mit der Züchtung von Liquor-CTCs fortzufahren: in vitro Kultur (Schritt 3) oder Versuch einer in vivo patienteneigenen Xenotransplantat-Expansion (Schritt 4).
    HINWEIS: Wenn CSF-CTCs zu einem späteren Zeitpunkt kultiviert werden sollen, kryokonservieren Sie die Zellen in Zellkultur-Gefriermedien, bis sie für die Vermehrung bereit sind. Gefriermedien für Zellkulturen können mit 90 % FBS + 10 % DMSO hergestellt werden. Wenn überschüssiger Liquor verfügbar ist (d. h. mehr als eine Liquorentnahme von Patienten oder Liquor wird bei der Autopsie entnommen), können CTCs bewertet werden, indem die Probe für den CTC-Enumerationsassay17 oder eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) für Melanommarker (d. h. Anti-MLANA) eingeschickt wird, was Aufschluss über die Menge und Lebensfähigkeit von CTCs geben kann. Zellen können nach Durchführung dieser Experimente nicht mehr gewonnen werden. Daher wird es nicht empfohlen, wenn keine Ersatz-Liquorproben des Patienten vorhanden sind.

3. In-vitro-Kultur und Expansion von CSF-CTCs

  1. Resuspendieren Sie CSF-CTCs in HMC-konditionierten Medien. Wenn CSF-CTCs kryokonserviert werden, tauen Sie die Zellen auf, schleudern Sie sie und waschen Sie sie vorsichtig mit PBS.
  2. Teilen Sie alle Zellen in dreifache Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit 150 μl Volumen pro Vertiefung auf. Nur lebensfähige Zellen haften über Nacht leicht an der Oberfläche.
    HINWEIS: Die Anzahl der Liquor-CTCs kann je nach Patientenprobe stark variieren (Tabelle 1). Bei Patienten mit niedrigen CTC-Werten wird eine 96-Well-Platte als Ausgangspunkt für die Kultivierung verwendet, und das gesamte Pellet wird ohne Zählung plattiert, aus Angst, CTCs zu verlieren. Handelt es sich jedoch um eine größere Menge Liquor (d.h. aus einer Autopsie), ist es möglich, die Zellen zu zählen. Nicht alle Tumorzellen können ex vivo wachsen; Einige dehnen sich über mehrere Passagen langsam aus, bevor sie statisch werden. Derzeit liegt die Erfolgschance der Züchtung von Melanom-CSF-CTCs ex vivo bei etwa 60 %7.
  3. Füllen Sie alle 3 Tage auf, indem Sie frisches HMC-konditioniertes Medium hinzufügen, oder entfernen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie die Pipettenspitze an der Seite des Wells platzieren, wobei Sie etwas Flüssigkeit zurücklassen, ohne den Boden des Wells zu stören, und ersetzen Sie es dann durch frisches HMC-konditioniertes Medium.
  4. Wenn sich ex vivo CSF-CTCs ausdehnen und zu 90 % konfluent werden, trypsinisieren sie und übertragen die gesamte Vertiefung in eine neue Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Wenn die Vertiefung in einer 24-Well-Platte konfluent ist, übertragen Sie sie auf eine 12-Well-Platte, dann auf eine 6-Well-Platte und so weiter.
    HINWEIS: Erwägen Sie nach der Trypsinisierung, eine kleine Untergruppe von CTCs in Zellkultur-Gefriermedien (10 % DMSO + 90 % FBS) zu kryokonservieren, bevor Sie sie als Backup plattieren.
  5. Fahre mit der Kultivierung von CTCs fort. Einige Zellen können sich kurzfristig vermehren und schließlich statisch werden. Ein oder mehrere Klone können sich jedoch exponentiell transformieren und erweitern (Abbildung 2A). Wählen Sie diese Klone aus, die zu den In-vitro-CSF-CTC-Kulturen (PD-CSF-CTCs) werden.
    HINWEIS: Wenn diese Klone überfüllt sind oder sich ansammeln, trypsinisieren Sie die Zellen und plattieren Sie sie in einer frischen Gewebekulturplatte/einem frischen Gewebekulturkolben neu.

4. In-vivo-Inokulation von Liquor-CTCs zur Generierung eines Zelllinien-abgeleiteten Xenotransplantats (CDX) oder eines patientenabgeleiteten Xenotransplantats (PDX) Modells

HINWEIS: Ein PDX-Modell beinhaltet die Transplantation von Krebszellen direkt von einem Krebspatienten (ohne ex vivo-Kultur ), während das CDX-Modell Krebszelllinien oder, in diesem Fall, CTCs verwendet, die vermehrt und immortalisiert wurden18.

  1. Verwenden Sie 6-8 Wochen lang weibliche immundefiziente NOD SCID gamma (NSG) Mäuse für die Liquor-CTCs-Inokulation. NSGs werden verwendet, weil sie stark immundefizient sind und sehr empfänglich für die Transplantation von humanen Tumorzellen sind19. Aufgrund ihrer Immunschwäche sollten diese Mäuse in einer streng kontrollierten hygienischen Umgebung gehalten und isoliert von anderen Mausstämmen untergebracht werden. Das Verfahren zur Darstellung von murin-LMD wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben20.
    HINWEIS: Zur Generierung des PDX-Modells werden ex vivo-Zellen (Liquor-CTCs von Patienten, die nur in Schritt 2 ohne Kultivierung verarbeitet wurden) verwendet; Eine physische Beobachtung des Tieres und eine MRT des Gehirns sind erforderlich, um das Fortschreiten der LMD zu bestimmen. Auf der anderen Seite können mit dem CDX-Modell , das in vitro verwendet wird, PD-CSF-CTCs mit einem Luciferase-Reporter markiert werden, und der Status von LMD kann durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) beurteilt werden. Das in diesem Bericht verwendete Zellmarkierungssystem ist ein NanoLuc (NL)-Reporter, der Furimazin als Substrat verwendet, von dem gezeigt wurde, dass es die Empfindlichkeit proportional zum Tumorwachstum erhöht21. Eine Interferenz des CTC-Zellwachstums (in vitro oder in vivo) durch die NL-Expression wurde nicht beobachtet.
  2. Überprüfen Sie mit diesen Methoden auf Anzeichen eines LMD-Fortschreitens: körperliche Beobachtung: Gewichtsverlust, Kopfneigung und gebeugter Rücken. MRT: vergrößerte Ventrikel und Anzeichen von Hydrozephalie (Abbildung 2B). BLI: positive biolumineszierende Signale in der ZNS-Region (Abbildung 2C).

5. Liquorentnahme von Mäusen mit LMD für die anschließende Klonexpansion

  1. Narkose die NSG-Maus mit LMD mit 4% Isofluran (nach institutionell anerkannten Protokollen), bis sie keine Anzeichen des Aufrichtreflexes mehr zeigt.
  2. Bereiten Sie die Maus vor, indem Sie das Fell der gesamten Bauchfläche des Kopfes rasieren und die Haut mit steriler Technik vorbereiten.
  3. Positionieren Sie die Nase mit einem modifizierten L-förmigen Nasenkonus des stereotaktischen Geräts, um sicherzustellen, dass die Nasenlöcher frei bleiben. Sichern Sie die Haut, indem Sie sie vorsichtig mit Klebeband über die Bauchflächen beider Ohrmuscheln nach vorne ziehen, am Nasenkonus befestigen und dann den Hals nach dem Fixieren in einem Winkel von etwa 90° biegen. Verabreichen Sie 1,5%-3% Isofluran, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
  4. Strecken Sie den Hals vollständig aus und beginnen Sie direkt zwischen den Ohrmuscheln, und führen Sie die chirurgischen Scherenspitzen mit leichtem Druck über das Hinterhauptbein nach unten.
    HINWEIS: In dieser Mittellinienposition ist eine subtile Vertiefung erkennbar, wenn die Scherenspitzen in den konkaven Bereich über der Cisterna magna eintreten.
  5. Erstellen Sie einen kleinen Mittellinienschnitt von 5-7 mm direkt über der palpierten Konkavität.
  6. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette mit 1-2 mm Spitzen, um sanft Druck auf die Cisterna magna auszuüben. Führen Sie die Spitzen in geschlossener Position ein und öffnen Sie sie, während Sie Druck nach unten auf die Dura ausüben.
  7. Wiederholen Sie den stumpfen Dissektionsvorgang wie in Schritt 6 beschrieben, bis die Duralmembran deutlich erkennbar ist und die zugehörigen Blutgefäße im freiliegenden Bereich sichtbar sind.
  8. Halten Sie die Pinzette offen, um die umgebende Muskulatur zurückzuziehen, und führen Sie eine 27-29 G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, unter die Dura ein, um die Abschrägung sichtbar zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel knapp über die Fase hinausragt. Ziehen Sie den Spritzenkolben allmählich zurück.
  9. Sammeln Sie so viel Liquor wie möglich (normalerweise zwischen 15 und 30 μl), bevor Sie die Maus einschläfern.
    HINWEIS: Die Euthanasie wird nach institutionell anerkannten Protokollen durchgeführt, indem der Proband eskalierenden Konzentrationen von komprimiertem CO2 -Gas ausgesetzt wird. Zum Beispiel wird eine Verdrängungsrate von 30 % bis 70 % des Kammervolumens pro Minute eingesetzt, um Beschwerden oder Stress zu verhindern oder zu reduzieren. Anschließend wird die Einstellung von Herz-Kreislauf- und Atembewegungen durch längere Beobachtung in der Raumluft für mehr als 10 Minuten sichergestellt.
  10. Geben Sie den Liquor aus der Spritze in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.
  11. Schleudern Sie die Probe bei 257 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig (frieren Sie die Maus-Liquorprobe bei Bedarf bei -80 °C für die weitere Analyse ein), ohne das Zellpellet zu stören.
  12. Fügen Sie 500 μl steriles PBS hinzu und waschen Sie das Zellpellet; Wiederholen Sie den Schleudern bei 257 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  13. Resuspendieren Sie Zellen in HMC-konditionierten Medien in einer 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Liquor-CTCs, die in vivo transplantiert und erfolgreich zu LMD gezüchtet wurden, sollten in der Lage sein, wie normale Zellkulturen zu wachsen. Erweitern Sie weiter, indem Sie alle 3 Tage das Medium wechseln. Trypsinisieren Sie Zellen und übertragen Sie sie in einen größeren Zellkultivierungsapparat, wenn die Zellen zusammenfließen. Diese Zellen werden zu den in vivo PD-CSF-CTC-Kulturen. Im aktuellen Bericht gab es eine Erfolgsquote von 100 % mit dem CDX-Modell, und es wurde noch kein PDX M-LMD generiert.

Repräsentative Ergebnisse

Das Verständnis der Voraussetzungen für ein erfolgreiches Wachstum von CSF-CTCs ex vivo ist eine fortlaufende Bemühung. Zu diesem Zweck wird davon ausgegangen, dass die Bereitstellung wesentlicher Faktoren, die die Mikroumgebung des Liquors nachahmen, von entscheidender Bedeutung ist22. Humane Meningealzellen (HMCs) sezernieren eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren in den Liquor, darunter FGF-2, EGF, IGFBP2 und IGFBP6, und sind dafür bekannt, das Wachstum von CTC-Zellen zu unterstützen 12,13,14,23,24. Daher wurde eine humane Zytokin-Array-Analyse auf HMC-konditionierten Medien durchgeführt, um potenziell wichtige Komponenten zu identifizieren, die für das Überleben von CTC erforderlich sind. Tatsächlich wurden mehrere Wachstumsfaktoren in den mit HMCs kultivierten Medien hochreguliert (Abbildung 3A). Zum Beispiel Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), VEGF-A und IGFBPs (IGFBP2, 3, 4 und 6).

Die Liquor-zellulären Bestandteile von Patienten können aus mehreren Zelltypen bestehen, wie z.B. CTCs, Immunzellen und Fibroblasten. Nicht-CTCs werden schließlich aufhören, über die Zeit zu gehen. Im Allgemeinen handelt es sich bei Zellen, die sich erfolgreich vermehren und in der Proliferation verbleiben, um Krebszellen (M-LMD). Die Validierung von wachsenden Zellen in Kultur erfolgt in der Tat bei M-LMD-Zellen, was durch IF-Nachweis der MLANA-Expression und transkriptomische Analysen erfolgen kann, die zuvor gezeigt wurden7.

Als Proof of Concept, um die potenzielle Verwendung und Anwendung etablierter in vitro und in vivo PD-CSF-CTC-Linien zu zeigen, wurde eine Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse (scRNA-seq) durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten mehrere Gene, die angereichert und aus den unkultivierten Liquor-CTCs des Patienten zurückgehalten wurden7. Zwei von ihnen umfassen die Rezeptor-Tyrosin-Protein-Kinase ErbB3 und IGF-1R, die Auswirkungen auf das Fortschreiten des Melanoms und die Chemotherapieresistenz haben 25,26,27.

Um zu testen, ob sie eine Rolle beim Überleben von Liquor-CTCs spielten, wurde ein Kristallviolett-Proliferationsassay an PD-CSF-CTCs durchgeführt, die mit den von der FDA zugelassenen Medikamenten Tucatinib und Ceritinib behandelt wurden, die auf ErbB28 bzw. IGF-1R 7,29 abzielen. Als Positivkontrolle wurde ein Anti-IGFBP2-Antikörper eingeschlossen, der das Wachstum von PD-CSF-CTC-Kulturen behindern sollte. Die Ergebnisse zeigten, dass das Fehlen von IGFBP2 oder IGF-1R die Proliferation von PD-CSF-CTCs wirksam reduzierte (Abbildung 3B). Da die MAPK-Signalübertragung dem IGF-1R nachgeschaltet ist, wurden auch Calcein-AM-Lebendzellfärbungen und MTT-Zellüberlebensassays in drei M-LMD-PD-CSF-CTC-Linien durchgeführt, indem sie mit Ceritinib oder den MAPK-Inhibitoren, Dabrafenib und Trametinib oder einer Kombination aller drei behandelt wurden. Die Daten zeigten, dass die Lebensfähigkeit aller drei Zelllinien durch Ceritinib signifikant reduziert war, während Dabrafenib und Trametinib gemischte Wirkungen hatten (Abbildung 3C). Das Ergebnis der Behandlung mit Debrafenib und Trametinib war überraschend. Alle drei PD-CSF-CTC-Linien wurden von M-LMD-Patienten abgeleitet, die eine BRAFV600E Mutation7 aufwiesen. Dies könnte auf einen erworbenen Chemoresistenzeffekt von CSF-CTCs hindeuten, der in Zukunft untersucht werden soll.

Als nächstes wurden als Beispiel dafür, wie PD-CSF-CTCs in vivo verwendet werden können, murine M-LMD-Modelle erstellt, indem intrathekal mit einer unterschiedlichen Anzahl von PD-CSF-CTCs inokuliert wurde. Die medianen Überlebenszeiten bei Mäusen wurden bestimmt (Abbildung 3D). Um die M-LMD-Progression zu visualisieren, wurden PD-CSF-CTC-Linien mit einem biolumineszierenden Marker, wie dem NL-Reportersystem21, markiert und von BLI erfasst (Abbildung 2C). Die Lokalisation der LMD-Metastasen wurde auch mittels Immunhistochemie mit dem Protein Melan-A (MLANA)30 als Marker der Melanomzellen nachgewiesen (Abbildung 3E). Als Wirksamkeitsnachweis zur Erprobung therapeutischer Strategien gegen M-LMD in vivo erhielten murin-M-LMD-Kohorten täglich eine orale Monotherapie mit Ceritinib oder Trametinib oder einer Kombination aus Dabrafenib und Trametinib oder Ceritinib und Trametinib. Die (unbehandelte) Kontrollkohorte erhielt zum Vergleich orale Kochsalzlösung. Die Ergebnisse zeigten ein signifikant verlängertes Überleben (Abbildung 3F) und eine verzögerte Krankheitserkennung (Abbildung 3G) in der Kohorte, die mit Ceritinib und Trametinib behandelt wurde (unbehandeltes M-LMD-Medianüberleben: 28,5 Tage vs. mit Ceritinib und Trametinib behandeltes medianes M-LMD-Überleben: 38,5 Tage; P-Wert = 0,0052). Diese Daten unterstreichen den potenziellen Nutzen der entwickelten M-LMD PD-CSF-CTC-Linien für die Durchführung präklinischer Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika.

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Abbildung 1: Ein schematischer Überblick über den Prozess der Etablierung von patientenabgeleiteten Liquor-zirkulierenden Tumorzellen (PD-CSF-CTCs). Liquor von Patienten kann über eine Lumbalpunktion, ein Ommaya-Reservoir oder eine schnelle Autopsie entnommen werden. Durch eine Reihe von in vitro und in vivo Vermehrungen wird in jedem Schritt eine intermediäre CSF-CTC-Kultur erzeugt (d. h. Patienten-CSF-CTCs, in vitro Kultur, in vivo Kultur), bis eine PD-CSF-CTC-Linie etabliert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Beispiele für die in vitro und in vivo Kultivierung von Liquor-CTCs von M-LMD-Patienten. (A) Repräsentative Hellfeldbilder, die das in vitro Wachstum einer M-LMD CSF-CTC-Kolonie nach 6 Wochen und 9 Wochen in HMC-konditionierten Medien zeigen. Maßstabsbalken: 1000 μm. (B) MRT-Bilder nach 4 Wochen und 8 Wochen nach intrathekaler Inokulation mit PD-CSF-CTCs; eine erfolgreiche Etablierung eines murinen Modells von M-LMD. Gelbe Pfeile deuten auf vergrößerte Ventrikel und eine mögliche Hydrozephalie bei dieser M-LMD-Maus hin. (C) Repräsentative BLI-Visualisierung der M-LMD-Entwicklung bei Mäusen. Die Abbildung ist eine Adaption von Law et al.7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: PD-CSF-CTC-Linien werden in verschiedenen präklinischen Experimenten zur Untersuchung von M-LMD verwendet. (A) Ein humanes Zytokin-Array, das einen Anstieg verschiedener sekretierter Wachstumsfaktoren (d.h. IGFBPs, VEGF-A und GM-CSF) in Kulturmedien (MenCM) in Gegenwart von humanen Meningealzellen (HMCs) zeigt. (B) Ein gescanntes Bild eines Kristallviolettzellproliferationsassays zur Bestimmung der Wirksamkeit von Anti-IGFBP2-Antikörpern, Tucatinib und Ceritinib gegen eine der PD-CSF-CTC-Linien. Die Kontrollbedingung wurde einer Vehikelbehandlung unterzogen. Das Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. (C) Zellüberlebensassay von drei verschiedenen etablierten PD-CSF-CTC-Linien (von Patienten 09, 12 und 16) in vitro. Die Zellen wurden entweder mit Ceritinib (cer), einer Kombination aus Dabrafenib (dab) + Trametinib (tra), cer + tra oder allen dreien behandelt. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Behandlung entnommen. Die Calcein-AM-Färbung wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen sichtbar zu machen, und ein MTT-Assay wurde verwendet, um das Überleben der Zellen zu bestimmen. Für die statistische Analyse wurde ein gepaarter Stichproben-t-Test verwendet. Maßstabsbalken: 20 μm. (D) Eine Überlebenskurve eines murinen M-LMD-Modells. NSG-Mäuse wurden intrathekal (über die Cisterna magna) mit einer der PD-CSF-CTC-Linien bei 10.000, 20.000 und 50.000 Zellen inokuliert. Das mediane Überleben von M-LMD-Mäusen wurde bestimmt. (E) IHC-Nachweis für MLANA, einen Marker für Melanom, in den Gehirnschnitten von M-LMD-Mäusen. Positives MLANA wurde in den Hirnhäuten gefunden (rot gefärbt; mit gelben Pfeilen angedeutet), während das normale (gesunde) Gehirn kein Krebswachstum zeigte (negativ für MLANA). Maßstabsbalken: 200 μm. (F) Ein repräsentatives Wirksamkeitsexperiment von murinen M-LMD-Kohorten, die entweder täglich orale Kochsalzlösung, cer, tra, dab/tra oder cer/tra erhielten. Das Überleben der Mäuse wurde bestimmt. Für die statistische Analyse wurde der Logarithmus-Rang-Test (Mantel-Cox) verwendet. (G) Repräsentative BLI-Bilder des M-LMD-Fortschreitens in 5 Wochen im Vergleich der behandelten Kontroll- (Kochsalzlösung) mit der Therapie. cer/tra-behandelte murine M-LMD-Kohorten. Das Panel (C) der Abbildung ist eine Adaption von Law et al.7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der klinischen Liquor-CTCs, die für ex vivo-Kulturen bei M-LMD-Patienten erhalten wurden. Eine Übersichtstabelle von 11 M-LMD-Patienten, deren Liquor-CTCs versucht wurden, zu vermehren. Die Patienten in der Tabelle wurden zuvor in Law et al.7 charakterisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

M-LMD ist eine verheerende, universell tödliche Krankheit, und es besteht ein dringender Bedarf, bessere Behandlungsstrategien zu finden. Eines der Haupthindernisse für die Untersuchung von M-LMD ist die Unfähigkeit, genügend Liquor-CTCs für die Durchführung molekularer und funktioneller Studien zu erwerben 1,7. Obwohl es Methoden gibt, CTCs aus peripherem Blut und Liquor anderer Krebsarten wie Brust- und Eierstockkrebs zu kultivieren 11,31,32, sind diese CTC-Vermehrungsmethoden in der Regel kurzfristig, und es wurde kein Erfolg bei der Kultivierung von Liquor-CTCs aus Melanomen berichtet. Darüber hinaus existieren die aktuellen Methoden zur Vermehrung von CTCs in kurzfristigen ex vivo-Umgebungen und haben noch kein in vivo LMD-Modell hervorgebracht, das von LMD-Zellen von Patienten abgeleitet wurde. Hier wird ein neuartiges Protokoll vorgestellt, um diese Zellen in vitro und in vivo zu kultivieren, was zu einzigartigen patienteneigenen Zelllinien führt. Derzeit gab es bei 11 M-LMD-Patienten in der Studie eine Erfolgschance von etwa 60 % (7 von 11) bei der Vermehrung von M-LMD CSF-CTCs in vitro, während diese chance in vivo mit der cdx-methode auf ~20 % (2 von 11) gesenkt wurde7.

Es ist klar, dass die In-vitro-Bedingungen die Mikroumgebung des Liquors nicht rekapitulieren. Allerdings wurden bereits proteomische Ansätze durchgeführt, um Proteinkomponenten im Liquor zu untersuchen, und lieferten einige Einblicke in Schlüsselfaktoren, die für das CTC-Wachstum ex vivo erforderlich waren 3. So wurde beispielsweise festgestellt, dass einer der Hauptsignalwege, der das CTC-Überleben bei M-LMD-Patienten fördert, mit erhöhten IGF-bezogenen Aktivitäten verbunden ist 3,7. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Leptomeninge eine Vielzahl von Zytokinen/Wachstumsfaktoren in den Liquor sezernieren, darunter FGF-2, EGF, GM-CSF und Proteine, die mit der IGF-Signalgebung in Verbindung stehen12. In der Tat wurde dies in den mit HMCs kultivierten Medien rekapituliert, was eine mögliche Rolle dieser Wachstumsfaktoren bei der Förderung des CSF-CTC-Wachstums unterstützt.

Ein großer Vorteil bei der Generierung eines PDX- (oder CDX-) Modells ist die Möglichkeit, tiefere Einblicke in die Pathologie von Krankheiten zu gewinnen, etwas, das In-vitro-Bedingungen fehlen. Im Idealfall wird ein PDX-Ansatz bevorzugt, da die Liquor-CTCs ohne ex vivo-Kultivierung direkt von Patienten stammen. Zunächst wurden Versuche unternommen, M-LMD mit diesem Ansatz zu erstellen, aber sie waren bisher nicht erfolgreich. Die Schwierigkeit bei der Generierung von PDX-Mäusen hängt möglicherweise mit der Fülle und Integrität des Ausgangsmaterials zusammen (d.h. sehr wenige lebensfähige CTCs im Liquor der Patienten bei der routinemäßigen Entnahme in der Klinik). Dies könnte erklären, warum wir bei der Züchtung von CTCs aus Liquor, die bei der Autopsie7 entnommen wurden, überdurchschnittlichen Erfolg hatten. Um die Wahrscheinlichkeit einer In-vivo-Vermehrung zu erhöhen, wurde dieses Protokoll modifiziert, um einen alternativen CDX-Ansatz bereitzustellen. CSF-CTCs können zunächst in vitro erweitert werden (Schritt 3), um PD-CSF-CTC-Linien zu erzeugen, die ein langfristiges und größeres Wachstumspotenzial aufweisen. Diese Zellen werden dann in Mäusen geimpft, um M-LMD zu erzeugen. Obwohl die derzeitige Methode eine begrenzte Anzahl von in vivo CDX M-LMD-Modellen (~ 20%) erzeugte, könnte dies die transkriptionelle Diversität von Liquor-CTCs, die Komplexität der Liquor-Mikroumgebung und die Schwierigkeit bei der Kultivierung dieser Zellen im Allgemeinen widerspiegeln. Wir gehen davon aus, dass die zukünftige Entwicklung eines humanisierten Mausmodells die Erfolgsrate der Transplantation erhöhen könnte, da die Mikroumgebung für die Unterstützung der Lebensfähigkeit von Krebszellen wichtig ist33.

Eine Einschränkung des CDX-Ansatzes besteht darin, dass nur bestimmte Klone aus Patientenproben ausgewählt wurden und die genetische Drift von Krebszellen durch Ex-vivo-Kultivierung möglicherweise nicht mehr das Transkriptionsprofil der ursprünglichen Quelle widerspiegelt. Es wurde jedoch berichtet, dass PD-CSF-CTC-Linien trotz In-vitro-Kultivierung eine Ähnlichkeit der Genexpression von etwa 97 % mit isolierten, nicht kultivierten Patienten-CSF-CTCsbeibehielten 7. In dieser Studie zeigten scRNA-seq-Analysen überlappende angereicherte Gensignaturen zwischen nicht kultivierten in vitro PD-CSF-CTCs und in vivo PD-CSF-CTCs wie SOX9, ErbB3 und IGF-1R7, was darauf hindeutet, dass dies potenzielle therapeutische Ziele sein könnten. Darüber hinaus sind diese häufig angereicherten Gene an biologischen Signalwegen beteiligt, die mit der Transkriptionsregulation und dem Stoffwechsel verbunden sind7. Insgesamt unterstreicht dies den translationalen Wert von PD-CSF-CTC-Kulturen für ein besseres Verständnis der Biologie von M-LMD, die Identifizierung zielgerichteter molekularer Mechanismen und Signalwege, die die Krankheit antreiben, und die Entwicklung rationaler Therapien in zukünftigen Studien.

Obwohl die derzeitige Methodik nach wie vor unvollkommen ist, da es keine Möglichkeit gibt, den Status und die Lebensfähigkeit von Liquor-CTCs bei M-LMD-Patienten im Voraus zu bestimmen, wurden mehrere Beobachtungen gemacht, die die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen würden, da die CTCs in der Anzahl gering und recht fragil sind. Zu diesen kritischen Schritten gehört die Koordination mit der Klinik, um Liquorproben sofort nach der Entnahme auf Eis zu legen und sie schnell ins Labor zu transportieren, um die zelluläre Integrität zu erhalten. Anschließend sollten CSF-CTCs sofort aufbereitet werden, entweder durch Plattieren in Kultur oder durch Kryokonservierung der Zellen.

Insgesamt war die Kultivierung und Erweiterung von CSF-CTCs ein Trial-and-Error-Prozess, aber die Etablierung dieses Protokolls zur Erzeugung von M-LMD-Zellen von Patienten wird den Forschern die erforderlichen Ressourcen zur Verfügung stellen, um Experimente mit Patientenproben durchzuführen, die zuvor nicht möglich waren. Ein wichtiges Ziel für die Zukunft ist die Verwendung von M-LMD, PD-CSF-CTCs zur Durchführung molekularer Charakterisierung, Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings und In-vivo-Studien zur Wirksamkeit von Medikamenten, um rationale Therapien zur Behandlung von M-LMD zu entwickeln. Es wird angenommen, dass dieser Ansatz zu Behandlungsstrategien führen wird, die die Morbidität und Mortalität, die mit diesem derzeit tödlichen Aspekt des fortgeschrittenen metastasierten Melanoms verbunden sind, stark reduzieren werden.

Offenlegungen

Peter Forsyth ist Mitglied des Beirats von Abvie Inc, Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen und Ziopharm, außerhalb der eingereichten Arbeiten. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten uns bei Patienten und Angehörigen für ihre außergewöhnliche Großzügigkeit bei der Gewebespende für diese wissenschaftliche Studie bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt: Zuschüsse P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (an KSMS und PAF), K99 CA226679 (an IS). Moffitt Foundation Research Acceleration Fund (nach BC und PAF), Moffitt Chemical Biology & Molecular Medicine Program (PAF und DD), Moffitt Foundation (PAF). Die Molecular Genomics, Tissue, and Bioinformatics & Biostatistics Shared Resource Cores bei Moffitt werden teilweise vom National Cancer Institute durch einen Cancer Center Support Grant (P30-CA076292) und die Moffitt Foundation unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe 27 - 29 G needlesAny vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubesAny vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubesAny vendorn/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) miceCharles RiverMales optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR)Zoopharm DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS)ScienCell#0010
Gas inhalation anestehsia systemVeteEquip#901812COMPAC5
Hamilton microliter syringesHamilton10, 25, 50, and 100ml30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)Milipore Sigma (or any vender)#F0291
Human epidermal growth factor (EGF)Milipore Sigma (or any vender)#SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeningesScienCell#1400
IVIS 200 imaging systemCaliper Life Sciencesn/a
Magnifying glass with lightAny vendorn/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM)ScienCell#1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS)ScienCell#1452
MRI imagingBrukerBioSpec seriesOptional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solutionScienCell (or any vender)#0503
Phosphate buffered saline (PBS)Any vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps)Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes 
Sterile blue paper/ drape coveringAny vendorn/an/a
Sterile cotton sticksAny vendorn/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)

Referenzen

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