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Resumen

En este artículo se describe un protocolo para la propagación de células tumorales circulantes por líquido cefalorraquídeo (CTC-LCR) recolectadas de pacientes con enfermedad leptomeníngea asociada a melanoma (M-LMD) para desarrollar modelos preclínicos para estudiar la M-LMD.

Resumen

La enfermedad leptomeníngea asociada al melanoma (M-LMD, por sus siglas en inglés) ocurre cuando las células tumorales circulantes (CTC, por sus siglas en inglés) ingresan al líquido cefalorraquídeo (LCR) y colonizan las meninges, las capas de membrana que protegen el cerebro y la médula espinal. Una vez establecido, el pronóstico para los pacientes con M-LMD es sombrío, con una supervivencia general que oscila entre semanas y meses. Esto se debe principalmente a la escasez de conocimientos sobre la enfermedad y, como consecuencia, a la disponibilidad de opciones de tratamiento eficaces. La definición de la biología subyacente de la M-LMD mejorará significativamente la capacidad de adaptar las terapias disponibles para el tratamiento de la M-LMD o diseñar nuevos inhibidores para esta enfermedad universalmente mortal. Sin embargo, un obstáculo importante radica en la obtención de cantidades suficientes de CTC a partir del LCR derivado del paciente (CSF-CTC) para realizar experimentos preclínicos, como la caracterización molecular, el análisis funcional y los estudios de eficacia in vivo . El cultivo ex vivo de CTC-CSF también ha demostrado ser un desafío. Para abordar esto, se desarrolla un nuevo protocolo para el cultivo de M-LMD CSF-CTC derivadas del paciente ex vivo e in vivo . Se ha encontrado que la incorporación de medios condicionados producidos por células meníngeas humanas (HMC) es fundamental para el procedimiento. El análisis de la matriz de citocinas revela que los factores producidos por las HMC, como las proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP) y el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), son importantes para apoyar la supervivencia ex vivo de CSF-CTC. Aquí, se demuestra la utilidad de las líneas aisladas de CSF-CTC derivadas del paciente para determinar la eficacia de los inhibidores que se dirigen a las vías de señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Además, se muestra la capacidad de inocular intratecalmente estas células in vivo para establecer modelos murinos de M-LMD que pueden emplearse para pruebas preclínicas de terapias aprobadas o novedosas. Estas herramientas pueden ayudar a desentrañar la biología subyacente que impulsa el establecimiento de LCR-CTC en las meninges e identificar nuevas terapias para reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con la M-LMD.

Introducción

La enfermedad leptomeníngea (LMD) ocurre cuando las células tumorales circulantes (CTC) se diseminan en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y se establecen en las meninges, la membrana que rodea el cerebro y la médula espinal 1,2. La LMD puede ocurrir en varios tipos de cáncer, pero es particularmente prevalente en el melanoma. En estadios avanzados de melanoma, aproximadamente el 5% de los pacientes desarrollarán M-LMDasociado al melanoma 2,3. Aunque relativamente bajas en comparación con otros sitios de metástasis, las consecuencias de la M-LMD son devastadoras, con una supervivencia global que oscila entre semanas y meses, y contribuyen significativamente a la morbilidad de los pacientes 1,3,4. Esto se debe principalmente a la escasez de opciones de tratamiento efectivas combinada con importantes lagunas en nuestro conocimiento sobre cómo las leptomeninges son colonizadas por las células de melanoma2. Por lo tanto, la comprensión de la biología de la M-LMD facilitará el diseño de nuevas terapias para mejorar los resultados clínicos.

Informes recientes han demostrado cómo las CTC colonizan el microambiente único del LCR. Por ejemplo, el complemento C3 promueve la invasión de células tumorales en el líquido cefalorraquídeo a través del plexo coroideo, una intrincada red de vasos sanguíneos en cada ventrículodel cerebro. Además, en respuesta a los escasos micronutrientes en el líquido cefalorraquídeo, las CTC pueden aumentar la lipocalina-2, una proteína que elimina el hierro, y su receptor SLC22A17 paramejorar la supervivencia. Utilizando análisis ómicos del LCR, nuestro grupo también descubrió que el LCR está enriquecido con proteínas que regulan la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), así como la inmunidad innata3. En conjunto, estos datos enfatizan el valor de las CTC de LCR de las biopsias líquidas para estudiar la M-LMD.

Si bien las CTC-LCR a veces se pueden identificar mediante la toma de muestras de LCR del paciente a través de punción lumbar, reservorio Ommaya o autopsias rápidas, una limitación importante es obtener un número suficiente de estas células raras y frágiles 1,7. Por ejemplo, utilizando la técnica de enumeración de CTC, solo se pueden identificar entre varios cientos y varios miles de células tumorales por muestra de LCRdel paciente 7, lo que dificulta la realización de análisis moleculares y funcionales in vitro o in vivo. A pesar de que ha habido reportes de éxito en el crecimiento breve de CTCs ex vivo a partir de sangre periférica (es decir, CTCs de cáncer de mama)8,9,10, estas células generalmente solo crecen a corto plazo, y no se han reportado casos de poder desarrollar CTC de melanoma en el LCR. Por lo tanto, encontrar formas de propagar las CTC de LCR del melanoma, o las CTC en general, será muy beneficioso para estudiar la biología de la M-LMD 7,11.

Por primera vez, se describe una técnica novedosa para propagar ex vivo las CTC de LCR-CSC a partir de pacientes con M-LMD. Aquí, en este informe, se desarrolló un protocolo detallado que permite el cultivo y la expansión de CTC-LCR de pacientes con M-LMD. Dado que las meninges secretan una variedad de factores de crecimiento como FGF, IGF, VEGF-A e IGFBP que apoyan el crecimiento que rodea su entorno 12,13,14,15,16, se racionalizó que las CTC de LCR pueden requerir estos componentes para crecer en condiciones ex vivo. Por lo tanto, este protocolo utiliza medios condicionados generados por el cultivo de células meníngeas humanas (HMCs) in vitro. Para la inoculación in vivo, las células derivadas del paciente se inoculan en ratones inmunodeficientes para generar líneas de CTC-CTC-CTC-CSP derivadas del paciente. La disponibilidad de células M-LMD derivadas de pacientes respaldará ensayos celulares, moleculares y funcionales para estudiar la M-LMD y proponer nuevas estrategias de tratamiento para esta enfermedad mortal.

Protocolo

La colección de muestras de LCR de pacientes no identificados fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad del Sur de Florida (MCC 50103, 50172 y 19332). Los pacientes con M-LMD pueden ser diagnosticados de varias maneras, incluyendo una citología positiva en el LCR, una resonancia magnética nuclear (RMN) característica del cerebro o la columna vertebral, o una combinación de hallazgos clínicos con hallazgos sugestivos de la RMN. El líquido cefalorraquídeo de estos pacientes con M-LMD se recolectó de forma rutinaria como parte de su atención clínica estándar. No se realiza ningún procedimiento a menos que exista una indicación clínica. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para la recolección de muestras y su uso para la investigación y publicación. La generación de modelos murinos-LMD in vivo fue aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de Florida (IACUC# IS00010398). El esquema general de este protocolo se resume en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de medios acondicionados con HMC

  1. Precubra un matraz T175 con poli-l-lisina a 2 μg/cm2.
  2. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante 1 h.
  3. Aspire la solución de poli-l-lisina con una pipeta serológica estéril. No es necesario enjuagar el matraz y está listo para el cultivo de HMC.
  4. Cultive aproximadamente 1,0 x 106 HMC en 30 mL de medio de cultivo meníngeo completo (MenCM), que contiene 5% de suero fetal bovino, 1% de suplemento de crecimiento de células meníngeas y 100 U.I./mL de solución antibiótica de penicilina-estreptomicina por matraz. Cultive las células en la incubadora de cultivo celular en condiciones estándar de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de CO2.
  5. Cambie los medios cada 3 días.
  6. Cuando las células alcancen aproximadamente el 75%-80% de confluencia, recoja y guarde los medios cultivados de HMC en un tubo cónico de 50 mL.
  7. Divida las HMC en matraces T175 nuevos y MenCM completo nuevo si se necesitan más medios cultivados con HMC.
  8. A los medios cultivados de HMC, agregue una proporción de 1:1 de MenCM completo.
  9. Agregue 20 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se convertirán en el medio acondicionado por HMC para CSF-CTC.
    NOTA: Se recomienda agregar FGF y EGF frescos cuando los CTC estén listos para el cultivo.
  10. Almacene los medios acondicionados con HMC en alícuotas de 50 ml a 4 °C.
    NOTA: Se recomienda que los medios acondicionados con HMC en alícuotas se almacenen a 4 °C, pero no más de 4 semanas.

2. Recogida de líquido cefalorraquídeo y procesamiento de muestras

  1. Enfríe previamente la centrífuga ajustándola a 4 °C.
  2. Una vez extraída del paciente, coloque la muestra de líquido cefalorraquídeo en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo inmediatamente para mantenerlo frío.
    NOTA: Nuestro protocolo aprobado por la IRB permite extraer 7.5 mL de LCR del paciente con consentimiento.
  3. Centrifugar el líquido cefalorraquídeo a 257 x g durante 5 min a 4 °C.
  4. Extraiga, guarde y haga alícuotas del sobrenadante del LCR sin alterar la pelita de la celda en la parte inferior. Las alícuotas de sobrenadante del LCR pueden almacenarse congeladas a -80 °C si es necesario para su posterior análisis.
    NOTA: Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista; por lo tanto, se sugiere dejar ~ 40-50 μL en el fondo del tubo.
  5. En el mismo tubo, agregue 1 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para resuspender y enjuagar las células, y repita el centrifugado a 257 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: (Opcional) Realice la lisis de glóbulos rojos (RBC) si la muestra contiene contaminación sanguínea. Sin embargo, tenga en cuenta que algunas células podrían perderse durante el proceso, incluidas las CTC. Las CTC se pueden propagar sin el procedimiento de lisis de glóbulos rojos.
  6. Retire y deseche el PBS sin alterar el pellet de la celda y deje ~ 50 μL en el fondo.
  7. Realice el recuento de células para determinar la viabilidad de las células. A partir de aquí, hay dos opciones para proceder con el cultivo de CTC de LCR: cultivo in vitro (paso 3) o intentar la expansión in vivo del xenoinjerto derivado del paciente (paso 4).
    NOTA: Si las CTC de LCR se van a cultivar en un momento posterior, criopreservar las células en medios de congelación de cultivo celular hasta que estén listas para la propagación. Los medios de congelación de cultivos celulares se pueden fabricar utilizando 90% FBS + 10% DMSO. Si se dispone de un exceso de líquido cefalorraquídeo (es decir, se recoge más de una muestra de líquido cefalorraquídeo de los pacientes o se recoge líquido cefalorraquídeo en la autopsia), las CTC se pueden evaluar enviando la muestra para el ensayo de enumeración de CTC17, o la tinción con inmunofluorescencia (IF) para el marcador de melanoma (es decir, anti-MLANA), que puede proporcionar información sobre la cantidad y la viabilidad de las CTC. Las células no se pueden recuperar después de realizar estos experimentos. Por lo tanto, no se recomienda si no hay muestras de LCR de respaldo del paciente.

3. Cultivo in vitro y expansión de CTCs en LCR

  1. Vuelva a suspender los CTC de CSF en medios acondicionados por HMC. Si los CTC de LCR son criopreservados, descongele las células, gírelas y lávelas suavemente con PBS.
  2. Divida todas las celdas en pocillos triplicados en una placa de 96 pocillos con un volumen de 150 μL por pocillo. Solo las células viables se adherirán ligeramente a la superficie durante la noche.
    NOTA: El número de CTC-LCR puede variar mucho por muestra de paciente (Tabla 1). Para los pacientes con recuentos bajos de CTC, se utiliza una placa de 96 pocillos como punto de partida para el cultivo, y toda la pellets se cubre sin contar por temor a perder CTC. Sin embargo, si hay una cantidad mayor de líquido cefalorraquídeo (es decir, obtenido de una autopsia), es posible contar las células. No todas las células tumorales pueden crecer ex vivo; Algunos se expandirán lentamente durante varios pasajes antes de que se vuelvan estáticos. En la actualidad, la probabilidad de éxito del cultivo ex vivo de CTC de LCR para melanoma es de aproximadamente el 60%7.
  3. Cada 3 días, rellene añadiendo medios nuevos acondicionados con HMC o retire suavemente los medios colocando la punta de la pipeta en el lateral del pocillo, dejando un poco de líquido sin alterar el fondo del pocillo, y luego reemplácelo con medios nuevos acondicionados con HMC.
  4. Cuando los CTC-CSC ex vivo se expanden y se vuelven confluentes en un 90%, se tripsinizan y transfieren todo el pocillo a un nuevo pocillo en una placa de 24 pocillos. Cuando el pozo en un pozo de 24 pocillos es confluente, transfiéralo a una placa de 12 pocillos, luego a una placa de 6 pocillos y así sucesivamente.
    NOTA: Después de la tripsinización, considere criopreservar un pequeño subconjunto de CTC en medios de congelación de cultivos celulares (10% DMSO + 90% FBS) antes de colocar la siembra como respaldo.
  5. Continuar cultivando CTCs. Algunas células pueden propagarse a corto plazo y eventualmente volverse estáticas. Sin embargo, uno o más clones pueden transformarse y expandirse exponencialmente (Figura 2A). Seleccione estos clones, que se convertirán en los cultivos in vitro de CSF-CTC (PD-CSF-CTC) derivados del paciente.
    NOTA: Si estos clones se superpoblan o se agrupan, tripsinícelos y vuelva a colocar las células en una placa/matraz de cultivo de tejidos frescos.

4. Inoculación in vivo de CTCs de LCR-para generar un modelo de xenoinjerto derivado de línea celular (CDX) o xenoinjerto derivado del paciente (PDX)

NOTA: Un modelo PDX implica el injerto de células cancerosas directamente de un paciente con cáncer (sin cultivo ex vivo ), mientras que el modelo CDX utiliza líneas celulares cancerosas o, en este caso, CTC que se han propagado e inmortalizado18.

  1. Utilice ratones hembra inmunodeficientes NOD SCID gamma (NSG) de 6 a 8 semanas para la inoculación de LCR-CTC. Las NSG se utilizan porque son gravemente inmunodeficientes y son muy receptivas al injerto de células tumorales humanas19. Debido a sus deficiencias inmunológicas, estos ratones deben mantenerse en un entorno higiénico estrictamente controlado y deben estar aislados de otras cepas de ratones. El método para representar la LMD murina se ha descrito en detalle en otra parte20.
    NOTA: para generar el modelo PDX se utilizan células ex vivo (CTC-CSC de los pacientes que solo se han procesado en el paso 2 sin cultivar); La observación física del animal y la resonancia magnética del cerebro son necesarias para determinar la progresión de la LMD. Por otro lado, con el modelo CDX utilizado in vitro, las PD-CSF-CTC se pueden marcar con un indicador de luciferasa, y el estado de LMD se puede evaluar mediante imágenes bioluminiscentes (BLI). El sistema de marcaje celular utilizado en este informe es un reportero NanoLuc (NL) que utiliza furimazina como sustrato, lo que ha demostrado aumentar la sensibilidad en proporción al crecimiento tumoral21. No se observó una interferencia del crecimiento de células CTC (in vitro o in vivo) por la expresión de NL.
  2. Verifique si hay signos de progresión de la LMD usando estos métodos: observación física: pérdida de peso, inclinación de la cabeza y espalda encorvada. Resonancia magnética: ventrículos agrandados y signos de hidrocefalia (Figura 2B). BLI: señales bioluminiscentes positivas en la región del SNC (Figura 2C).

5. Recolección de LCR de ratones con LMD para la posterior expansión de clones

  1. Anestesiar al ratón NSG con LMD con isoflurano al 4% (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) hasta que no muestre signos del reflejo de enderezamiento.
  2. Prepare el ratón afeitando el pelaje de toda la superficie ventral de la cabeza y prepare la piel con técnica estéril.
  3. Coloque la nariz usando un cono nasal modificado en forma de L del aparato estereotáctico, asegurándose de que las fosas nasales permanezcan sin obstrucciones. Asegure la piel tirando suavemente de ella hacia adelante a través de las superficies ventrales de ambos pabellón auricular con cinta adhesiva, fijándola al cono de la nariz y luego doblando el cuello en un ángulo de aproximadamente 90° después de asegurarla. Administrar isoflurano al 1,5%-3% para mantener la anestesia.
  4. Extendiendo completamente el cuello y comenzando justo entre los pabellón auricular, guíe las puntas de las tijeras quirúrgicas hacia abajo a través del hueso occipital con una ligera presión.
    NOTA: En esta posición de la línea media, se percibe una depresión sutil a medida que las puntas de las tijeras ingresan al área cóncava sobre la cisterna magna.
  5. Cree una pequeña incisión en la línea media de 5-7 mm justo por encima de la concavidad palpada.
  6. Utilice pinzas de punta roma con puntas de 1-2 mm para aplicar presión suavemente sobre la cisterna magna. Introduzca las puntas en posición cerrada y ábralas mientras ejerce presión hacia abajo sobre la duramadre.
  7. Repita el proceso de disección roma como se describe en el paso 6 hasta que la membrana dural sea claramente discernible y los vasos sanguíneos asociados sean visibles dentro del área expuesta.
  8. Mientras mantiene las pinzas abiertas para retraer la musculatura circundante, inserte una aguja de 27-29 G unida a una jeringa de 1 ml debajo de la duramadre para visualizar el bisel. Asegúrese de que la aguja penetre justo más allá del bisel. Retraiga gradualmente el émbolo de la jeringa.
  9. Recoja la mayor cantidad posible de líquido cefalorraquídeo (generalmente entre 15 y 30 μL) antes de la eutanasia con ratones.
    NOTA: La eutanasia se lleva a cabo, siguiendo protocolos aprobados institucionalmente, exponiendo al sujeto a concentraciones crecientes de gas CO2 comprimido. Por ejemplo, se empleará una tasa de desplazamiento del 30% al 70% del volumen de la cámara por minuto para prevenir o reducir la incomodidad o la angustia. A continuación, se garantiza el cese de los movimientos cardiovasculares y respiratorios mediante una observación prolongada en el aire ambiente durante más de 10 minutos.
  10. Despliega el líquido cefalorraquídeo de la jeringa a un tubo de microcentrífuga y colócalo sobre hielo.
  11. Girar la muestra a 257 x g durante 5 min a 4 °C y retirar suavemente el líquido (congelar la muestra de líquido cefalorraquídeo de ratón a -80 °C si es necesario para un análisis posterior) sin alterar el pellet de la célula.
  12. Agregue 500 μL de PBS estéril y lave el pellet de celda; Repita el centrifugado a 257 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  13. Vuelva a suspender las células en medios acondicionados con HMC en una placa de 96 pocillos.
    NOTA: Las CTC-CSC que se han injertado in vivo y se han convertido con éxito en LMD deberían poder crecer como los cultivos celulares normales. Continúe expandiéndose cambiando los medios cada 3 días. Tripsinizar y transferir células a un aparato de cultivo celular más grande cuando las células son confluentes. Estas células se convertirán en los cultivos in vivo de PD-CSF-CTC. En el informe actual, hubo una tasa de éxito del 100% con el modelo CDX y aún no se ha generado un PDX M-LMD.

Resultados Representativos

Comprender los requisitos para el éxito del crecimiento ex vivo de los CTC-CSF es un esfuerzo continuo. Con ese fin, se cree que es de vital importancia proporcionar factores esenciales que imiten el microambiente del LCR22. Las células meníngeas humanas (HMC) secretan una variedad de factores de crecimiento en el LCR, incluidos FGF-2, EGF, IGFBP2 e IGFBP6, y se sabe que apoyan el crecimiento de las células CTC 12,13,14,23,24. Por lo tanto, se realizó un análisis de matriz de citocinas humanas en medios acondicionados con HMC para identificar los componentes potencialmente importantes necesarios para la supervivencia de CTC. De hecho, varios factores de crecimiento fueron regulados al alza en los medios cultivados con HMC (Figura 3A). Por ejemplo, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), VEGF-A e IGFBP (IGFBP2, 3, 4 y 6).

Los componentes celulares del LCR de los pacientes pueden consistir en varios tipos de células, como CTC, células inmunitarias y fibroblastos. Con el tiempo, los que no son CTC dejarán de pasar las horas extras. Por lo general, las células que se propagan con éxito y permanecen en proliferación son células cancerosas (M-LMD). La validación de las células en crecimiento en cultivo es de hecho células M-LMD, que se puede realizar mediante la detección de FI de la expresión de MLANA y análisis transcriptómicos, que se han demostrado previamente7.

Como prueba de concepto para mostrar el uso potencial y la aplicación de las líneas PD-CSF-CTC establecidas in vitro e in vivo, se utilizó el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), y los resultados revelaron varios genes que se enriquecieron y retuvieron de las CSF-CTC del paciente no cultivado7. Dos de ellos son el receptor tirosina-proteína quinasa ErbB3 e IGF-1R, que tienen implicaciones en la progresión del melanoma y en la resistencia a la quimioterapia 25,26,27.

Para probar si desempeñaban un papel en la supervivencia de la CTC en LCR-LCR, se realizó un ensayo de proliferación de violeta cristalino en PD-CSF-CTC tratados con los medicamentos aprobados por la FDA, tucatinib y ceritinib, que se dirigen a ErbB28 e IGF-1R 7,29 respectivamente. Se incluyó el anticuerpo anti-IGFBP2 como control positivo que debería dificultar el crecimiento de los cultivos de PD-CSF-CTC. Los resultados mostraron que la ausencia de IGFBP2 o IGF-1R fue efectiva para reducir la proliferación de PD-CSF-CTC (Figura 3B). Dado que la señalización de MAPK se produce en la fase posterior del IGF-1R, también se realizaron ensayos de tinción de células vivas con calceína-AM y de supervivencia de células MTT en tres líneas M-LMD PD-CSF-CTC tratándolas con ceritinib o los inhibidores de MAPK, dabrafenib y trametinib o una combinación de los tres. Los datos demostraron que la viabilidad de las tres líneas celulares se redujo significativamente con ceritinib, mientras que dabrafenib y trametinib tuvieron efectos mixtos (Figura 3C). El resultado de los tratamientos con debrafenib y trametinib fue sorprendente. Las tres líneas PD-CSF-CTC se derivaron de pacientes con M-LMD que albergaban una mutación BRAFV600E 7. Esto puede sugerir un efecto de quimiorresistencia adquirida de las CTC de LCR-PCR, que es algo que se investigará en el futuro.

A continuación, como ejemplo de cómo se pueden utilizar las PD-CSF-CTC in vivo, se establecieron modelos murinos M-LMD inoculados inocularmente con un número variable de PD-CSF-CTC. Se determinaron los tiempos medios de supervivencia en ratones (Figura 3D). Para visualizar la progresión M-LMD, las líneas PD-CSF-CTC se marcaron con un marcador bioluminiscente, como el sistema reportero NL21, y se capturaron mediante BLI (Figura 2C). La localización de las metástasis de LMD también se demostró mediante inmunohistoquímica con la proteína melan-A (MLANA)30 como marcador de las células de melanoma (Figura 3E). Como prueba de concepto para probar estrategias terapéuticas contra M-LMD in vivo, se administró monoterapia oral diaria con ceritinib o trametinib, o una combinación de dabrafenib y trametinib o ceritinib y trametinib. La cohorte de control (no tratada) recibió solución salina oral como comparación. Los resultados mostraron una supervivencia significativamente prolongada (Figura 3F) y una detección tardía de la enfermedad (Figura 3G) en la cohorte tratada con ceritinib y trametinib (mediana de supervivencia de M-LMD no tratada: 28,5 días frente a la mediana de supervivencia de M-LMD tratada con ceritinib y trametinib: 38,5 días; Valor de p = 0,0052). Estos datos subrayan la utilidad potencial de las líneas M-LMD PD-CSF-CTC desarrolladas para la realización de estudios preclínicos que determinen la eficacia de nuevas terapias.

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Figura 1: Una descripción esquemática del proceso de establecimiento de células tumorales circulantes de LCR derivadas del paciente (PD-CSF-CTC). El líquido cefalorraquídeo de los pacientes se puede muestrear mediante punción lumbar, reservorio Ommaya o autopsias rápidas. A través de una serie de propagaciones in vitro e in vivo , cada paso genera un cultivo intermedio de LCR-CTC (es decir, LCR-CTC del paciente, cultivo in vitro , cultivo in vivo ) hasta establecer una línea de PD-CSF-CTC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ejemplos de cultivo in vitro e in vivo de CTCs de LCR-derivados de pacientes con M-LMD. (A) Imágenes representativas de campo claro que muestran el crecimiento in vitro de una colonia M-LMD CSF-CTC a las 6 semanas y a las 9 semanas en medios acondicionados con HMC. Barra de escala: 1000 μm. (B) Imágenes de resonancia magnética a las 4 semanas y 8 semanas después de inoculadas intratecalmente con PD-CSF-CTC; un establecimiento exitoso de un modelo murino de M-LMD. Las flechas amarillas apuntan a ventrículos agrandados y posible hidrocefalia en este ratón M-LMD. (C) Visualización representativa BLI del desarrollo de M-LMD en ratones. La figura es una adaptación de Law et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Las líneas PD-CSF-CTC se utilizan en varios experimentos preclínicos para estudiar M-LMD. (A) Una matriz de citocinas humanas que muestra un aumento de diferentes factores de crecimiento secretados (es decir, IGFBP, VEGF-A y GM-CSF) en medios de cultivo (MenCM) en presencia de células meníngeas humanas (HMC). (B) Una imagen escaneada de un ensayo de proliferación de células de color violeta cristalino para determinar la eficacia del anticuerpo anti-IGFBP2, tucatinib y ceritinib contra una de las líneas PD-CSF-CTC. A la condición de control se le dio tratamiento vehicular. El experimento se realizó por triplicado. (C) Ensayo de supervivencia celular de tres líneas diferentes establecidas de PD-CSF-CTC (de pacientes 09, 12 y 16) in vitro. Las células se trataron con ceritinib (cer), una combinación de dabrafenib (dab) + trametinib (tra), cer + tra, o los tres. Las células se recolectaron a las 72 h después del tratamiento. Se utilizó la tinción con calceína-AM para visualizar la viabilidad celular, y se utilizó un ensayo MTT para determinar la supervivencia celular. Para el análisis estadístico se utilizó una prueba t de muestras pareadas. Barras de escala: 20 μm. (D) Una curva de supervivencia de un modelo M-LMD murino. Los ratones NSG fueron inoculados intratecalmente (a través de la cisterna magna) con una de las líneas PD-CSF-CTC a 10.000, 20.000 y 50.000 células. Se determinó la mediana de supervivencia de los ratones M-LMD. (E) Detección de IHQ para MLANA, un marcador de melanoma, en las secciones cerebrales de ratones M-LMD. Se encontró MLANA positivo en las meninges (teñidas en rojo; señaladas con flechas amarillas), mientras que el cerebro normal (sano) no mostró crecimiento de cáncer (negativo para MLANA). Barras de escala: 200 μm. (F) Un experimento representativo de eficacia de cohortes murinos M-LMD a las que se les administró solución salina oral diaria, cer, tra, dab/tra o cer/tra. Se determinó la supervivencia de los ratones. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). (G) Imágenes BLI representativas de la progresión de la M-LMD en 5 semanas, comparando el control (solución salina) tratado vs. Cohortes murinas de M-LMD tratadas con cer/tra. El panel (C) de la figura es una adaptación de Law et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Resumen de las CTC-LCR clínicas obtenidas para cultivo ex vivo en pacientes con M-LMD. Tabla resumen de 11 pacientes con M-LMD, a los que se ha intentado propagar con CTC-LCR. Los pacientes de la Tabla fueron previamente caracterizados en Law et al.7. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La M-LMD es una enfermedad devastadora y universalmente mortal, y existe una necesidad urgente de encontrar mejores estrategias de tratamiento. Una de las principales barreras para el estudio de la M-LMD es la incapacidad de adquirir suficientes CTC-LCR para realizar estudios moleculares y funcionales 1,7. Aunque existen métodos para cultivar CTC de sangre periférica y LCR de otros tipos de cáncer, como los cánceres de mama y ovario 11,31,32, estos métodos de propagación de CTC suelen ser a corto plazo, y no se ha reportado éxito en el cultivo de CTC-LCR a partir de melanoma. Además, las metodologías actuales para propagar CTC existen en entornos ex vivo a corto plazo y aún no han producido un modelo de LMD in vivo derivado de células LMD de pacientes. Aquí, se presenta un protocolo novedoso para cultivar estas células in vitro e in vivo, lo que conduce a líneas celulares únicas derivadas del paciente. Actualmente, de 11 pacientes con M-LMD en el estudio, había aproximadamente un 60% (7 de 11) de posibilidades de éxito en la propagación de M-LMD CSF-CTC in vitro, y mientras esto se redujo a ~20% (2 de 11) in vivo utilizando el método CDX7.

Está claro que las condiciones in vitro no recapitulan el microambiente del LCR. Sin embargo, se han realizado previamente enfoques proteómicos para estudiar los componentes de las proteínas en el LCR y proporcionaron algunos conocimientos sobre los factores clave que se requerían para el crecimiento ex vivode CTC 3. Por ejemplo, se identificó que una de las principales vías que promueven la supervivencia de la CTC en pacientes con M-LMD se asoció con un aumento de las actividades relacionadas con el IGF 3,7. Además, los estudios han demostrado que las leptomeninges secretan una variedad de citocinas/factores de crecimiento en el LCR, incluyendo FGF-2, EGF, GM-CSF y proteínas relacionadas con la señalización de IGF12. De hecho, esto se recapituló en los medios de comunicación cultivados con las HMC, lo que respalda un papel potencial de estos factores de crecimiento en la promoción del crecimiento de la CSF-CTC.

Una gran ventaja en la generación de un modelo PDX (o CDX) es la capacidad de obtener información más profunda sobre la patología de la enfermedad, algo de lo que carecen las condiciones in vitro . Idealmente, se prefiere un enfoque PDX, ya que las CTC-LCR serían directamente de pacientes sin cultivo ex vivo . Inicialmente, se hicieron intentos de crear M-LMD utilizando este enfoque, pero hasta ahora no han tenido éxito. La dificultad en la generación de ratones PDX posiblemente se asocie con la abundancia e integridad del material de partida (es decir, muy pocas CTC viables en el LCR del paciente en la recolección de rutina en la clínica). Esto puede explicar por qué tuvimos un éxito superior en el cultivo de CTC a partir de LCR recolectada en la autopsia7. Para aumentar la probabilidad de propagación in vivo , este protocolo se modificó para proporcionar un enfoque CDX alternativo. Los CSF-CTC pueden expandirse primero in vitro (paso 3) para generar líneas de PD-CSF-CTC que tienen un mayor potencial de crecimiento a largo plazo. A continuación, estas células se inoculan en ratones para crear M-LMD. Aunque el método actual generó un número limitado de modelos in vivo de CDX M-LMD (~ 20%), esto podría reflejar la diversidad transcripcional de las CTC-LCR, la complejidad del microambiente del LCR y la dificultad de cultivar estas células en general. Postulamos que el desarrollo futuro de un modelo de ratón humanizado puede mejorar la tasa de éxito del injerto, dada la importancia del microambiente en el apoyo a la viabilidad de las células cancerosas33.

Una limitación del enfoque CDX es que solo se seleccionaron ciertos clones de muestras de pacientes, y es posible que la deriva genética de las células cancerosas a través del cultivo ex vivo ya no refleje el perfil transcripcional de la fuente original. Sin embargo, se ha reportado que, a pesar del cultivo in vitro , las líneas PD-CSF-CTC mantuvieron aproximadamente un 97% de similitud en la expresión génica con las CSF-CTC de pacientes aislados y no cultivados7. En ese estudio, los análisis de scRNA-seq revelaron firmas génicas enriquecidas superpuestas entre PD-CSF-CTC in vitro no cultivadas y PD-CSF-CTC in vivo , como SOX9, ErbB3 e IGF-1R7, lo que sugiere que pueden ser posibles objetivos terapéuticos. Además, estos genes comúnmente enriquecidos están involucrados en vías biológicas asociadas con la regulación transcripcional y el metabolismo7. En conjunto, esto pone de manifiesto el valor traslacional de los cultivos PD-CSF-CTC para comprender mejor la biología de la M-LMD, identificar los mecanismos moleculares y las vías que impulsan la enfermedad y diseñar terapias racionales en estudios futuros.

Aunque la metodología actual sigue siendo imperfecta, ya que no hay forma de predeterminar el estado y la viabilidad de las CTC-LCR en pacientes con M-LMD, se han realizado varias observaciones que aumentarían la probabilidad de éxito, ya que las CTC son bajas en número y bastante frágiles. Estos pasos críticos incluyen la coordinación con la clínica para que las muestras de LCR se coloquen en hielo tan pronto como se extraigan y se transporten rápidamente al laboratorio para mantener la integridad celular. Posteriormente, las CTC-LCR deben procesarse inmediatamente, ya sea mediante siembra en cultivo o criopreservando las células.

En general, el cultivo y la expansión de las CTC de LCR fue un proceso de prueba y error, pero el establecimiento de este protocolo para generar células M-LMD derivadas de pacientes proporcionará a los investigadores los recursos necesarios para realizar experimentos con muestras de pacientes, lo que no se podría haber hecho anteriormente. Un objetivo importante en el futuro es utilizar M-LMD PD-CSF-CTC para llevar a cabo la caracterización molecular, el cribado de fármacos de alto rendimiento y los estudios de eficacia de fármacos in vivo para diseñar terapias racionales para tratar la M-LMD. Se cree que este enfoque conducirá a estrategias de tratamiento que reducirán en gran medida la morbilidad y la mortalidad asociadas con este aspecto actualmente mortal del melanoma metastásico avanzado.

Divulgaciones

Peter Forsyth es miembro de los Consejos Asesores de Abvie Inc, Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen y Ziopharm, fuera del trabajo presentado. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los pacientes y a sus familias por su extraordinaria generosidad al donar tejido para este estudio científico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (a KSMS y PAF), K99 CA226679 (a IS). Fondo de Aceleración de la Investigación de la Fundación Moffitt (para Columbia Británica y PAF), Programa de Biología Química y Medicina Molecular de Moffitt (PAF y DD), Fundación Moffitt (PAF). Los núcleos de recursos compartidos de genómica molecular, tejidos, bioinformática y bioestadística de Moffitt cuentan con el apoyo parcial del Instituto Nacional del Cáncer a través de una subvención de apoyo para centros oncológicos (P30-CA076292) y la Fundación Moffitt.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe 27 - 29 G needlesAny vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubesAny vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubesAny vendorn/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) miceCharles RiverMales optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR)Zoopharm DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS)ScienCell#0010
Gas inhalation anestehsia systemVeteEquip#901812COMPAC5
Hamilton microliter syringesHamilton10, 25, 50, and 100ml30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)Milipore Sigma (or any vender)#F0291
Human epidermal growth factor (EGF)Milipore Sigma (or any vender)#SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeningesScienCell#1400
IVIS 200 imaging systemCaliper Life Sciencesn/a
Magnifying glass with lightAny vendorn/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM)ScienCell#1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS)ScienCell#1452
MRI imagingBrukerBioSpec seriesOptional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solutionScienCell (or any vender)#0503
Phosphate buffered saline (PBS)Any vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps)Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes 
Sterile blue paper/ drape coveringAny vendorn/an/a
Sterile cotton sticksAny vendorn/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)

Referencias

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