Ex Vivo （体外 ）黑色素瘤患者脑脊髓液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关的软脑膜疾病

摘要

本文描述了一种从黑色素瘤相关软脑膜病 （M-LMD） 患者收集的脑脊髓液循环肿瘤细胞 （CSF-CTC） 的增殖方案，以开发研究 M-LMD 的临床前模型。

摘要

黑色素瘤相关软脑膜病 （M-LMD） 发生在循环肿瘤细胞 （CTC） 进入脑脊髓液 （CSF） 并定植于脑膜（保护大脑和脊髓的膜层）时。一旦确定，M-LMD 患者的预后很差，总生存期从数周到数月不等。这主要是由于我们对这种疾病的了解不足，因此缺乏有效的治疗方案。定义 M-LMD 的基础生物学将显著提高为 M-LMD 治疗调整可用疗法或为这种普遍致命的疾病设计新型抑制剂的能力。然而，一个主要障碍在于从患者来源的 CCF （CSF-CTC） 中获得足够数量的 CTC 以进行临床前实验，例如分子表征、功能分析和 体内 疗效研究。 体外 培养 CSF-CTC 也被证明是具有挑战性的。为了解决这个问题，开发了一种用于 体外 和 体内 培养患者来源的 M-LMD CSF-CTC 的新方案。发现掺入人脑膜细胞 （HMC） 产生的条件培养基对该程序至关重要。细胞因子阵列分析显示，HMC 产生的因子，如胰岛素样生长因子结合蛋白 （IGFBP） 和血管内皮生长因子-A （VEGF-A），在支持 CSF-CTC 离体存活方面很重要。在这里，分离的患者来源的 CSF-CTC 细胞系在确定靶向胰岛素样生长因子 （IGF） 和丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路的抑制剂的疗效方面得到了证明。此外，还显示了在 体内 鞘内接种这些细胞以建立 M-LMD 小鼠模型的能力，该模型可用于已批准或新疗法的临床前测试。这些工具可以帮助揭示驱动脑膜中 CSF-CTC 建立的潜在生物学因素，并确定降低与 M-LMD 相关的发病率和死亡率的新疗法。

引言

当循环肿瘤细胞 （CTC） 播散到脑脊髓液 （CSF） 中并在脑膜（大脑和脊髓周围的膜）中建立时，就会发生软脑膜病 （LMD） ^1,2。LMD 可发生在多种癌症中，但在黑色素瘤中尤其普遍。在黑色素瘤的晚期，大约 5% 的患者会出现与黑色素瘤相关的 M-LMD ^2,3。虽然相对于其他转移部位相对较低，但 M-LMD 的后果是毁灭性的，总生存期从数周到数月不等，并且是导致患者发病率的重要因素 ^1,3,4。这主要是由于缺乏有效的治疗方案，以及我们对软脑膜如何被黑色素瘤细胞定植的知识存在重大差距²。因此，了解 M-LMD 的生物学将有助于设计新的疗法以改善临床结果。

最近的报告显示了 CTC 如何在独特的 CSF 微环境中定植。例如，补体 C3 通过脉络丛促进肿瘤细胞侵入脑脊液，脉络丛是大脑每个脑室中错综复杂的血管网络⁵。此外，为了应对 CSF 中稀缺的微量营养素，CTC 可以上调脂质运载蛋白-2（一种铁清除蛋白）及其受体SLC22A17以提高生存率⁶。使用基于组学的 CSF 分析，我们小组还发现 CSF 富含调节胰岛素样生长因子 （IGF） 信号传导以及先天免疫的蛋白质³。总之，这些数据强调了液体活检中 CSF-CTC 对研究 M-LMD 的价值。

虽然有时可以通过腰椎穿刺、Ommaya 储液器或快速尸检对患者 CSF 进行采样来识别 CSF-CTC，但一个主要限制是获得足够数量的这些稀有和脆弱细胞 ^1,7。例如，使用 CTC 计数技术，每个患者 CSF 样本只能识别数百到数千个肿瘤细胞⁷，这使得在体外或体内进行分子和功能分析变得困难。尽管有报道称从外周血（即乳腺癌 CTC）中短暂生长出体外 CTC 的成功^8,9,10，但这些细胞通常只在短期内生长，并且没有报道能够在 CSF 中培养黑色素瘤 CTC 的病例。因此，寻找传播黑色素瘤 CSF-CTC 或一般 CTC 的方法将非常有利于研究 M-LMD^{的生物学 7,11}。

首次描述了一种从体外 M-LMD 患者繁殖 CSF-CTC 的新技术。在本报告的此处，制定了一个详细的方案，允许从 M-LMD 患者培养和扩增 CSF-CTC。由于脑膜分泌多种生长因子，如 FGF、IGF、VEGF-A 和 IGFBP，这些因子支持其周围环境的生长 12,13,14,15,16，因此 CSF-CTC 可能需要这些成分在离体条件下生长是合理的。因此，该方案使用通过在体外培养人脑膜细胞 - （HMC-） 产生的条件培养基。对于体内接种，将患者来源的细胞接种到免疫缺陷小鼠中，以产生患者来源的 CSF-CTC （PD-CSF-CTC） 系。患者来源的 M-LMD 细胞的可用性将支持细胞、分子和功能测定，以研究 M-LMD 并为这种致命疾病提出新的治疗策略。

研究方案

南佛罗里达大学机构审查委员会 （IRB） （MCC 50103、50172 和 19332） 批准了去识别化患者 CSF 标本的采集。M-LMD 患者的诊断方式多种多样，包括 CSF 细胞学阳性、脑部和/或脊柱特征性磁共振成像 （MRI） 或临床表现与提示性 MRI 结果的组合。这些 M-LMD 患者的 CSF 作为其标准临床护理的一部分被常规收集。除非有临床指征，否则不进行任何手术。获得患者的知情同意，用于样本采集并将其用于研究和发表。 体内 小鼠-LMD 模型的生成已获得南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC# IS00010398） 的批准。该协议的总体方案总结在 图 1 中。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. HMC 条件培养基的制备

1. 用 2 μg/cm² 的聚-L-赖氨酸预涂 T175 培养瓶。
2. 将烧瓶置于 37 °C 培养箱中 1 小时。
3. 使用无菌血清移液管吸出聚-l-赖氨酸溶液。它不需要冲洗培养瓶，可用于 HMC 培养。
4. 在 30 mL 完全脑膜培养基 （MenCM） 中培养大约 1.0 x 10⁶ 个 HMC，每个烧瓶含有 5% 胎牛血清、1% 脑膜细胞生长补充剂和 100 I.U./mL 青霉素-链霉素抗生素溶液。在细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 的标准组织培养条件下培养细胞。
5. 每 3 天更换一次媒体。
6. 当细胞达到大约 75%-80% 汇合时，收集并保存在 50 mL 锥形管中 HMC 培养基。
7. 如果需要更多的 HMC 培养基，将 HMC 分液到新的 T175 培养瓶和新鲜的完全 MenCM 中。
8. 向 HMC 培养培养基中，添加 1：1 比例的完整 MenCM。
9. 添加 20 ng/mL 成纤维细胞生长因子 （FGF） 和 20 ng/mL 表皮生长因子 （EGF），它们将成为 CSF-CTC 的 HMC 条件培养基。
   注：建议在 CTC 准备好进行培养时添加新鲜的 FGF 和 EGF。
10. 将 HMC 条件培养基以 50 mL 等分试样储存在 4 °C 下。
    注：建议将等分试样的 HMC 条件培养基储存在 4 °C 但不要超过 4 周。

2. CSF 的采集和样本处理

1. 将其设置为 4 °C 预冷离心机。
2. 从患者身上抽取后，立即将 CSF 样品放入冰上的 15 mL 锥形管中以保持冷却。
   注意：我们的 IRB 批准的方案允许从同意的患者中提取 7.5 mL CSF。
3. 将 CSF 在 4 °C 下以 257 x g 离心 5 分钟。
4. 去除、保存和制备 CSF 上清液的等分试样，而不会干扰底部的细胞沉淀。如果需要，CSF 上清液等分试样可以在 -80 °C 下冷冻保存以供进一步分析。
   注意：肉眼可能无法看到颗粒;因此，建议在试管底部留下 ~40-50 μL。
5. 在同一管中，加入 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以重悬和冲洗细胞，并在 4 °C 下以 257 x g 重复旋转 5 分钟。
   注：（可选）如果样品中含有血液污染，则进行红细胞 （RBC） 裂解。但是，请记住，在此过程中可能会丢失一些细胞，包括 CTC。CTC 可以在没有 RBC 裂解程序的情况下繁殖。
6. 去除并丢弃 PBS，不干扰细胞沉淀，在底部留下 ~50 μL。
7. 进行细胞计数以确定细胞活力。从这里开始，有两种选择可以继续培养 CSF-CTC： 体外 培养（第 3 步）或尝试 体内 患者来源的异种移植扩增（第 4 步）。
   注：如果稍后要培养 CSF-CTC，请将细胞冷冻保存在细胞培养冷冻培养基中，直到准备好繁殖。细胞培养冻存培养基可以使用 90% FBS + 10% DMSO 制成。如果有过量的 CSF（即，从患者那里收集了不止一个 CSF 或在尸检时收集了 CSF），可以通过提交样本进行 CTC 计数测定¹⁷ 或黑色素瘤标志物（即抗 MLANA）的免疫荧光 （IF） 染色来评估 CTC，这可能提供有关 CTC 数量和活力的见解。进行这些实验后无法回收细胞。因此，如果没有患者的后备 CSF 样本，则不建议这样做。

3. CSF-CTCs 的 体外 培养和扩增

1. 在 HMC 条件培养基中重悬 CSF-CTC。如果 CSF-CTC 被冷冻保存，请解冻细胞，旋转它们，然后用 PBS 轻轻洗涤它们。
2. 将所有细胞分成一式三份的孔，在 96 孔板中，每孔体积为 150 μL。只有活细胞会在一夜之间轻轻粘附在表面。
   注意：每个患者样本的 CSF-CTC 数量可能差异很大（表 1）。对于 CTC 计数低的患者，以 96 孔板作为培养起点，由于担心丢失 CTC，不计数即可将整个沉淀板接种。但是，如果有大量 CSF（即从尸检中获得），则可以对细胞进行计数。并非所有肿瘤细胞都可以在 体外生长;有些会在变成静止之前缓慢膨胀几次。目前， 离体 培养黑色素瘤 CSF-CTC 的成功几率约为 60%⁷。
3. 每 3 天加入新鲜的 HMC 条件培养基加满，或将移液器吸头放在孔的一侧轻轻去除培养基，留下一些液体而不干扰孔底，然后用新鲜的 HMC 条件培养基更换。
4. 当 离体 CSF-CTC 扩增并达到 90% 汇合时，胰蛋白酶消化并将整个孔转移到 24 孔板中的新孔中。当 24 孔中的孔汇合时，将其转移到 12 孔板，然后转移到 6 孔板，依此类推。
   注：胰蛋白酶消化后，考虑在细胞培养冷冻培养基 （10% DMSO + 90% FBS） 中冷冻保存一小部分 CTC 作为备用。
5. 继续培养 CTC。一些细胞可能会短期繁殖并最终变成静态的。然而，一个或多个克隆可能会呈指数级转化和扩增（图 2A）。选择这些克隆，它们将成为 体外 患者来源的 CSF-CTC （PD-CSF-CTC） 培养物。
   注：如果这些克隆变得过度拥挤或成簇，请将细胞胰蛋白酶消化并重新接种在新鲜的组织培养板/培养瓶中。

4. CSF-CTC 体内接种以生成细胞系来源的异种移植物 （CDX） 或患者来源的异种移植物 （PDX） 模型

注意：PDX模型涉及直接从癌症患者植入癌细胞（无需 离体 培养），而CDX模型使用癌细胞系，或者在这种情况下，使用已经繁殖和永生化的CTC¹⁸。

1. 使用 6-8 周雌性免疫缺陷型 NOD SCID γ （NSG） 小鼠接种 CSF-CTCs。使用 NSG 是因为它们存在严重的免疫缺陷，并且对人肿瘤细胞植入的接受性很强¹⁹。由于免疫缺陷，这些小鼠应饲养在严格控制的卫生环境中，并应与其他小鼠品系隔离饲养。渲染 murine-LMD 的方法已在其他地方详细描述^{过 20}。
   注意：离 体 细胞（仅在步骤 2 中处理且未培养的患者 CSF-CTC）用于生成 PDX 模型;需要对动物进行物理观察和脑部 MRI 以确定 LMD 进展。另一方面，使用体外 CDX 模型 ， 可以用荧光素酶报告基因标记 PD-CSF-CTC，并且可以通过生物发光成像 （BLI） 评估 LMD 的状态。本报告中使用的细胞标记系统是利用呋喃嗪作为底物的 NanoLuc （NL） 报告基因，它已被证明可以提高与肿瘤生长成比例的敏感性²¹。未观察到 NL 表达对 CTC 细胞生长 （体外 或 体内） 的干扰。
2. 使用以下方法检查 LMD 进展的迹象：身体观察：体重减轻、头部倾斜和驼背。MRI：脑室扩大和脑积水迹象（图2B）。BLI：CNS 区域的阳性生物发光信号（图 2C）。

5. 从具有 LMD 的小鼠中收集 CSF 用于后续克隆扩增

1. 用含 4% 异氟醚的 LMD 麻醉 NSG 小鼠（遵循机构批准的方案），直到它没有显示扶正反射的迹象。
2. 通过剃掉头部整个腹面的皮毛来准备小鼠，并使用无菌技术准备皮肤。
3. 使用立体定向装置的改良 L 形鼻锥定位鼻子，确保鼻孔畅通无阻。用胶带轻轻地将皮肤向前拉过两个耳廓的腹面，将其固定在鼻锥上，然后在固定后将颈部弯曲成大约 90° 角，从而固定皮肤。施用 1.5%-3% 异氟醚以维持麻醉。
4. 完全伸展颈部并从耳廓之间开始，以轻微的压力引导手术剪刀尖端向下穿过枕骨。
   注意：在这个中线位置，当剪刀尖端进入大水箱上方的凹陷区域时，可以辨别出一个微妙的凹陷。
5. 在触诊的凹面上方创建一个 5-7 毫米的小中线切口。
6. 使用带有 1-2 毫米尖端的钝头镊子轻轻地对大池施加压力。将尖端置于闭合位置并打开它们，同时对硬脑膜施加向下的压力。
7. 重复步骤 6 中概述的钝性解剖过程，直到清晰可辨出硬脑膜，并且在暴露区域内可以看到相关的血管。
8. 在保持镊子打开以缩回周围肌肉组织的同时，将一根 27-29 G 针头插入硬脑膜下方的 1 mL 注射器上，以观察斜面。确保针头刚好穿透斜面。逐渐缩回注射器柱塞。
9. 在小鼠安乐死之前，尽可能多地收集 CSF（通常在 15-30 μL 之间）。
   注意：安乐死是按照机构批准的协议完成的，方法是将对象暴露在浓度不断升高的压缩 CO₂ 气体中。例如，将采用每分钟腔室容积的 30% 到 70% 的位移率来防止或减少不适或痛苦。然后通过在室内空气中长时间观察超过 10 分钟，确保心血管和呼吸运动停止。
10. 将注射器中的 CSF 部署到微量离心管中，并将其放在冰上。
11. 将样品在 4 °C 下以 257 x g 旋转 5 分钟，然后轻轻除去液体（如果需要进一步分析，将小鼠 CSF 样品在 -80 °C 下冷冻），而不会干扰细胞沉淀。
12. 加入 500 μL 无菌 PBS 并洗涤细胞沉淀;在室温下以 257 x g 重复旋转 5 分钟。
13. 在 96 孔板中的 HMC 条件培养基中重悬细胞。
    注意：已在 体内 植入并成功生长到 LMD 中的 CSF-CTC 应该能够像正常细胞培养物一样生长。通过每 3 天更换一次媒体来继续扩展。当细胞汇合时，用胰蛋白酶消化细胞并将其转移到更大的细胞培养装置中。这些细胞将成为 体内 PD-CSF-CTC 培养物。在目前的报告中，CDX 模型的成功率为 100%，并且尚未生成 PDX M-LMD。

讨论

M-LMD 是一种具有破坏性的、普遍致命的疾病，迫切需要找到更好的治疗策略。研究 M-LMD 的主要障碍之一是无法获得足够的 CSF-CTC 来进行分子和功能研究 ^1,7。尽管有现有的方法可以从其他癌症类型（如乳腺癌和卵巢癌）的外周血和 CSF 中培养 CTC 11,31,32，^但这些 CTC 繁殖方法通常是短期的，并且尚未报告从黑色素瘤中培养 CSF-CTC 的成功。此外，目前增殖 CTC 的方法存在于短期离体环境中，尚未产生源自患者 LMD 细胞的体内 LMD 模型。在这里，提出了一种新的方案来在体外和体内培养这些细胞，从而产生独特的患者来源的细胞系。目前，在研究中的 11 名 M-LMD 患者中，大约有 60% （11 名中的 7 名） 在体外成功繁殖 M-LMD CSF-CTCs，而使用 CDX 方法在体内成功繁殖的机会降低到 ~20% （11 名中的 2 名）⁷。

很明显，体外条件并不能概括 CSF 微环境。然而，之前已经进行了蛋白质组学方法来研究 CSF 中的蛋白质成分，并提供了一些关于 CTC 离体生长所需关键因素的见解 ³。例如，已确定促进 M-LMD 患者 CTC 存活的主要途径之一与 IGF 相关活动增加有关 ^3,7。此外，研究表明，软脑膜将多种细胞因子/生长因子分泌到 CSF 中，包括 FGF-2、EGF、GM-CSF 和与 IGF 信号转导相关的蛋白质¹²。事实上，这在用 HMC 培养的培养基中得到了概括，支持这些生长因子在促进 CSF-CTC 生长方面的潜在作用。

生成 PDX（或 CDX）模型的一个主要优势是能够更深入地了解疾病的病理学，这是 体外 条件所缺乏的。理想情况下，首选 PDX 方法，因为 CSF-CTC 将直接来自没有 离体 培养的患者。最初，人们尝试使用这种方法创建 M-LMD，但到目前为止尚未成功。生成 PDX 小鼠的困难可能与起始材料的丰度和完整性有关（即，在临床常规采集时，患者 CSF 中很少有活的 CTC）。这可以解释为什么我们在尸检⁷ 中收集的 CSF 中培养 CTC 取得了卓越的成功。为了增加 体内传播 的可能性，该协议被修改以提供另一种 CDX 方法。CSF-CTC 可以首先 在体外 扩增（第 3 步）以产生具有长期和更大生长潜力的 PD-CSF-CTC 系。然后将这些细胞接种到小鼠中以产生 M-LMD。尽管目前的方法生成的 体内 CDX M-LMD （~ 20%） 模型数量有限，但这可能反映了 CSF-CTC 的转录多样性、CSF 微环境的复杂性以及一般培养这些细胞的难度。鉴于微环境在支持癌细胞活力方面的重要性，我们认为人源化小鼠模型的未来开发可能会提高植入成功率³³。

CDX 方法的一个局限性是仅从患者样本中选择某些克隆，并且通过 离体 培养的癌细胞遗传漂变可能不再反映原始来源的转录谱。然而，据报道，尽管 进行了体外 培养，PD-CSF-CTC 系仍保留了与分离的未培养患者 CSF-CTCs 约 97% 的基因表达相似性⁷。在该研究中，scRNA-seq 分析揭示了未培养的 体外 PD-CSF-CTC 和 体内 PD-CSF-CTC 之间的重叠富集基因特征，例如 SOX9、ErbB3 和 IGF-1R⁷，表明这些可能是潜在的治疗靶点。此外，这些通常富集的基因参与与转录调控和代谢相关的生物途径⁷。总的来说，这突出了 PD-CSF-CTC 培养物的转化价值，有助于更好地了解 M-LMD 的生物学特性，确定驱动疾病的靶向分子机制和途径，以及在未来研究中设计合理的疗法。

尽管目前的方法仍然不完善，因为无法预先确定 M-LMD 患者 CSF-CTC 的状态和活力，但已经进行了一些观察，这将增加成功的可能性，因为 CTC 数量少且相当脆弱。这些关键步骤包括与诊所协调，在抽取 CSF 样本后立即将其置于冰上，并迅速将其运送到实验室，以保持细胞完整性。随后，应立即处理 CSF-CTC，将其接种在培养物中或冻存细胞。

总体而言，培养和扩增 CSF-CTC 是一个反复试验的过程，但建立这种生成患者来源的 M-LMD 细胞的方案将为研究人员提供使用患者样本进行实验所需的资源，这在以前是无法完成的。未来的一个主要目标是利用 M-LMD PD-CSF-CTCs 进行分子表征、高通量药物筛选和 体内 药物疗效研究，以设计治疗 M-LMD 的合理疗法。据信，这种方法将导致治疗策略，从而大大降低与晚期转移性黑色素瘤目前致命的方面相关的发病率和死亡率。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe 27 - 29 G needles	Any vendor	n/a	0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubes	Any vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubes	Any vendor	n/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) mice	Charles River		Males optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR)	Zoopharm		DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS)	ScienCell	#0010
Gas inhalation anestehsia system	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Hamilton microliter syringes	Hamilton	10, 25, 50, and 100ml	30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	Milipore Sigma (or any vender)	#F0291
Human epidermal growth factor (EGF)	Milipore Sigma (or any vender)	#SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeninges	ScienCell	#1400
IVIS 200 imaging system	Caliper Life Sciences	n/a
Magnifying glass with light	Any vendor	n/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM)	ScienCell	#1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS)	ScienCell	#1452
MRI imaging	Bruker	BioSpec series	Optional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solution	ScienCell (or any vender)	#0503
Phosphate buffered saline (PBS)	Any vendor	n/a	0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps)	Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes
Sterile blue paper/ drape covering	Any vendor	n/a	n/a
Sterile cotton sticks	Any vendor	n/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)