JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تؤدي إصابة الانقباض المزمن للعصب تحت الحجاج البعيد في الفئران إلى تغييرات في السلوك التلقائي (زيادة نشاط العناية بالوجه) وسلوك nocifensive استجابة للتحفيز اللمسي (فرط الاستجابة لتحفيز الشعر فون فراي) التي هي علامات على الألم المستمر والألم الخيفي وتعمل كنموذج لألم الأعصاب الثلاثي التوائم.

Abstract

تظل النماذج الحيوانية أدوات ضرورية لدراسة آلام الأعصاب. تصف هذه المخطوطة نموذج إصابة انقباض العصب تحت الحجاج المزمن البعيد (DIoN-CCI) لدراسة آلام الأعصاب ثلاثية التوائم في الفئران. وهذا يشمل الإجراءات الجراحية لأداء إصابة الانقباض المزمن والاختبارات السلوكية بعد العملية الجراحية لتقييم التغييرات في السلوك العفوي والمستحضر التي هي علامات على الألم المستمر والألم الخيفي الميكانيكي. تتشابه الطرق والقراءات السلوكية مع نموذج إصابة انقباض العصب المزمن تحت الحجاج (IoN-CCI) في الفئران. ومع ذلك ، هناك تغييرات مهمة ضرورية لتكييف نموذج IoN-CCI مع الفئران. أولا ، يتم استبدال النهج داخل المداري بنهج أكثر منضدة مع شق بين العين ووسادة الشارب. وبالتالي يتم ربط IoN بعيدا خارج التجويف المداري. ثانيا ، نظرا لارتفاع النشاط الحركي في الفئران ، يتم استبدال السماح للفئران بالتحرك بحرية في أقفاص صغيرة بوضع الفئران في أجهزة تقييد مصممة ومبنية خصيصا. بعد ربط DIoN ، تظهر الفئران تغيرات في السلوك التلقائي واستجابة لتحفيز شعر فون فراي الذي يشبه تلك الموجودة في فئران IoN-CCI ، أي زيادة الاستمالة الموجهة للوجه وفرط الاستجابة لتحفيز شعر فون فراي في منطقة إنترنت الأشياء.

Introduction

ينشأ ألم الأعصاب من تلف الجهاز العصبي الحسي الجسدي ، مما يؤدي إلى انتقال غير طبيعي للإشارات الحسية إلى الدماغ. لا يؤدي تلف الأعصاب الحسية الجسدية دائما إلى ألم الأعصاب ، ولكن الانتشار يزداد مع شدة الاعتلال العصبي السريري 1,2. يعاني مرضى آلام الأعصاب من أعراض محددة مثل الأحاسيس العفوية (الحرق ، الدبابيس والإبر ، الأحاسيس الكهربائية) والألم الشديد أو المطول بشكل غير طبيعي إلى التحفيز غير الضار أو الضار الذي يميل إلى أن يصبح مزمنا ومقاوما للعلاج باستخدام مسكنات الألم التقليدية3. ينبع التقدم الكبير في مجال أبحاث آلام الأعصاب من اكتشاف أن الأربطة المقيدة بشكل فضفاض حول العصب الوركي في الفئران تؤدي إلى سلوكيات تشبه حالات آلام الأعصاب البشرية4. تظهر عتبات منخفضة للحرارة والبرودة والتحفيز الميكانيكي ، وتظهر سلوكيات مسببة للألم. على الرغم من الاختلافات البيولوجية المتأصلة في معالجة الألم بين البشر والقوارض ، فإن النماذج الحيوانية هي أداة قيمة لدراسة الآليات الأساسية في تطوير آلام الأعصاب واختبار استراتيجيات العلاج المقترحة حديثا.

تم استخدام نماذج اختبار الألم القائمة على الانعكاس الحسي على نطاق واسع في نماذج آلام الأعصاب ، ولكن قياس الألم المستمر أو الاضطرابات الأخرى المصاحبة بشكل متكرر (اضطراب النوم والاكتئاب والقلق) لم يحظ بالاهتمام الكافي بالنظر إلى أن هذه أعراض سريرية شائعة تؤثر على نوعية الحياة5،6،7،8. تم توثيق سلوك الاستمالة بالوجه في الفئران كمقياس لألم الأعصاب العفوي بعد إصابة الانقباض المزمن (CCI) للعصب تحت الحجاج (IoN)9,10. بالإضافة إلى ذلك ، تطور الفئران أيضا استجابة مفرطة للتحفيز اللمسي الخفيف لمنطقة IoN ، مما يدل على الألم الميكانيكي.

بالمقارنة مع الفئران ، بسبب حجمها الأكبر ، فإن الفئران مناسبة بشكل أفضل للإصابات الجراحية. ومع ذلك ، تقدم الفئران كفاءة التكلفة والمساحة وتتطلب كميات أقل من الأدوية. أيضا ، أدى ظهور التكنولوجيا المعدلة وراثيا إلى زيادة استخدام الفئران11,12. لذلك ، فإن الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء إصابة عصبية تحت الحجاج جراحية في الفئران ، على غرار تلك الموجودة في الفئران ، والتي تحفز تغييرات في السلوك التلقائي والمستحضر لدراسة آلام الأعصاب الثلاثية التوائم.

Protocol

يتم علاج ورعايتها وفقا للمبادئ التوجيهية لأبحاث الألم في الواعية للرابطة الدولية لدراسة الألم وبما يتماشى مع اللوائح الفلمنكية والأوروبية لأبحاث وإرشادات ARRIVE. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية المؤسسية.

1.

  1. استخدم ذكور وإناث الفئران C57BL / 6J (Janvier ، 10 أسابيع من العمر عند الوصول).
  2. إيواء الفئران الذكور والإناث بشكل منفصل في أقفاص الفئران القياسية ذات القاع الصلب في غرفة مستعمرة مع رطوبة 40٪ -60٪ ودرجة حرارة الغرفة (RT) من 21 ± 1 درجة مئوية.
  3. توفير الماء والغذاء حسب الطلب.
  4. احتفظ بالفئران تحت دورة مظلمة / خفيفة طبيعية تبلغ 12:12 ساعة (تضيء الأضواء في الساعة 08:00).

2. الجراحة

  1. لكل فأر ، قم بإعداد قطعة واحدة من رباط الأمعاء الكروم (6-0) بطول 6 سم تقريبا وضعها في محلول ملحي معقم لتجنب الجفاف وتصبح قاسية وهشة.
  2. تخدير الفأر بالكيتامين/الزيلازين (75/15 ملغ/كغ، داخل الصفاق، حجم الحقن 10 مل/كغ). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص الجلد بين أصابع القدم. تأكد من أن الماوس لا يثني ساقه. إذا لزم الأمر ، انتظر حتى يتم تخدير بالكامل و / أو إعطاء الكيتامين / الزيلازين الإضافي.
    ملاحظة: لا ينبغي إعطاء المسكنات التكميلية لتجنب الآثار المسكنة الوقائية التي قد تتداخل مع تطور آلام العصب الثلاثي التوائم.
  3. احلقي الشعر الشدقي برفق بين وسادة الشارب والعين لعمل شق يبلغ حوالي 4 مم فقط إلى الثقبة تحت الحجاج. احرص على عدم إتلاف الشعيرات ، لأن ذلك قد يؤثر على الاختبارات السلوكية.
  4. إصلاح رأس الماوس في إطار التجسيمي أو تثبيت الرأس بطريقة أخرى. ضع الماوس على وسادة ساخنة أو احرص على الحفاظ على درجة حرارة الجسم بخلاف ذلك.
  5. ضع مرهما على كلتا العينين لتجنب الجفاف. فرك منطقة الرأس حلق مع الكحول ، ثم مع betadine. ضع ستارة جراحية تكشف منطقة الرأس المحلوقة.
  6. استخدم مجهرا للخطوات من 2.7 إلى 2.14.
  7. قم بعمل شق جلدي 4 مم عموديا على خط المنتصف في منتصف الطريق تقريبا بين حافة وسادة الشارب والعين ، فقط منقار إلى الثقبة تحت الحجاج ، ويتمركز حول الخط الفاصل بين مركز العين ومركز وسادة الشارب.
  8. فضح إنترنت الأشياء عن طريق فصل النسيج الضام السطحي بصراحة. احرص على تقليل تلف العضلات وتجنب الألياف العصبية الحركية. تأكد من أن جذع IoN (قطره 1-1.5 مم) يمكن الوصول إليه بعمق 3 مم تقريبا بين مكان خروجه من الجمجمة ومكان تفرعه إلى وسادة الشارب (الشكل 1).
  9. باستخدام حركة دوارة ، قم بتمرير رأس أداة مساعدة الربط المعقوف تحت IoN ، مع الحرص على عدم إتلاف العصب.
  10. ضع رباط الأمعاء الكروم من خلال الفتحة الموجودة على طرف أداة مساعدة الربط واسحب أداة مساعدة الربط بحيث يظل الرباط تحت IoN ويكون كلا طرفي الرباط متساويين إلى حد ما عن IoN.
  11. اربط "عقدة الانزلاق" من طرفي الرباط وحرك العقدة ضد IoN. تأكد من أن عقدة الانزلاق تسمح بعمل سلس بحيث يمكن التحكم في درجة الانقباض بدقة. حرك العقدة أكثر وانقبض IoN. تقليل قطر العصب بمقدار ملحوظ4. ضع عقدة عادية فوق عقدة الشق لمنعها من الانزلاق.
  12. قطع نهايات الرباط مع ترك حوالي 1.5 مم من الأطراف الحرة لمنع التراجع عن العقدة.
  13. قم بإجراء الجراحة الوهمية باتباع الخطوات 2.2-2.8.
  14. أغلق شق الجلد باستخدام خيوط اصطناعية قابلة للامتصاص (6-0) واسمح للحيوان بالتعافي على وسادة ساخنة أو تحت مصباح تسخين بالأشعة تحت الحمراء.

3. الاختبار السلوكي

  1. تأقلم الماوس مع ظروف السكن لمدة 8 أيام على الأقل قبل اختبار ما قبل الجراحة.
  2. قبل اختبار ما قبل الجراحة ، تعويد الماوس على إجراء الاختبار مرة واحدة على الأقل يوميا لمدة 3 أيام.
  3. إجراء الاختبار في ظروف الإضاءة العادية. إذا لزم الأمر ، قم بتوفير ضوضاء الخلفية لتقليل الاضطرابات الناتجة عن الضوضاء الخارجية.
  4. مراقبة سلوك الاستمالة بالوجه
    1. احمل فأرا واحدا من السكن إلى غرفة الاختبار في قفص بلاستيكي مغطى بدون أي مواد فراش. تجنب التحفيز الخارجي أثناء نقل.
    2. ضع الماوس في قفص بلاستيكي شفاف مغطى بدون فراش (الطول × العرض × الارتفاع: 12 سم × 12 سم × 17 سم) أمام كاميرا الفيديو. ضع مرآة لعرض وجه عندما يكون ظهره باتجاه الكاميرا.
    3. سجل سلوك الماوس لمدة 10 دقائق. أثناء التسجيل ، تأكد من عدم وجود المجرب في الغرفة.
    4. بعد تسجيل التالي ، قم بتنظيف قفص المراقبة.
    5. اطلب من مراقب أعمى عن الظروف التجريبية للماوس تحليل السلوك المسجل.
    6. لاحظ كل حلقة من حلقات العناية بالوجه أثناء تحليل التسجيل لمدة 10 دقائق. الاستمالة بالوجه هي أنماط الحركة التي يجلب فيها أقدامه الأمامية على اتصال مع مناطق الوجه.
    7. ميز بين سلوكيات العناية بالوجه المعزولة وسلوكيات العناية بالوجه أثناء العناية بالجسم9. إذا لم يكن التسلسل مسبوقا أو متبوعا بالعناية بالجسم ، تصنيف الحلقة على أنها استمالة وجه معزولة. يعرف الاستمالة بالجسم على أنها أنماط الحركة التي تجعل الكفوف أو اللسان أو القواطع ملامسة لمنطقة أخرى من الجسم غير الوجه أو مقدمة القدمين. إذا كان الاستمالة بالجسم موجودا قبل أو بعد تسلسل العناية بالوجه ، تصنيف الحلقة على أنها استمالة للوجه أثناء العناية بالجسم.
    8. حدد عدد حلقات العناية بالوجه من خلال تطبيق معيار القطع 4 ثوان. يتم تعريف الفترة الزمنية بين إجراءات الاستمالة التي تقل عن 4 ثوان على أنها توقف مؤقت داخل حلقة واحدة. يتم تعريف الفترة الزمنية الأكبر من 4 ثوان على أنها انقطاع كامل لإجراءات الاستمالة بين حلقتين.
  5. اختبار التحفيز الميكانيكي
    1. احمل الفئران في مجموعات تصل إلى 6 من السكن إلى غرفة الاختبار في قفص مغطى مع فراش. مرة أخرى ، احرص على تجنب التحفيز الخارجي.
    2. ضع الفئران واحدة تلو الأخرى على طاولة.
      1. ضع ذيل الماوس في مشبك سيليكون ناعم وقم بتوصيل المشبك مغناطيسيا بلوحة معدنية على الطاولة. تمنع مادة السيليكون الذيل من الانزلاق من المشبك مع تقليل الضغط على الذيل.
      2. ضع حاملا بلاستيكيا ثلاثي الجدران (65 مم × 25 مم × 23 مم) فوق بحيث يبرز رأس الماوس فقط من الحاوية. يسمح حجم الحامل بحركات الرأس والمقدمة ولكنه يمنع من الدوران بداخله. أخيرا ، ضع وزنا فوق الحامل لإبقاء الحامل في مكانه (الشكل 2).
    3. استخدم سلسلة متدرجة من أربعة شعيرات فون فراي. القوة المطلوبة لثني الشعر هي 0.02 جم و 0.16 جم و 0.4 جم و 1.0 جم.
    4. تعويد الفئران على ضبط النفس والوصول إلى الحركات لمدة 10 دقائق. كل 30 ثانية ، قم بحركة الوصول لكل.
    5. عندما يكون في حالة استرخاء ، ضع ببطء أخف شعر فون فراي داخل منطقة IoN بالقرب من مركز الاهتزازات حتى ينحني شعر فون فراي. تأكد من أن التحفيز لا يستغرق أكثر من 1 ثانية.
    6. سجل استجابة للتحفيز لتلائم إحدى فئات الاستجابة التالية.
      1. أعط درجة 0 عندما لا يكون هناك رد.
      2. أعط درجة 1 للاكتشاف ، أي أن الفأر يدير رأسه نحو الجسم المحفز ثم يستكشف جسم التحفيز.
      3. أعط درجة 2 لرد فعل الانسحاب ، أي أن الماوس يدير الرأس برفق بعيدا أو يسحبه بسرعة للخلف عند تطبيق التحفيز ؛ في بعض الأحيان ، يحدث مسح وجه واحد مماثل للمنطقة المحفزة.
      4. أعط درجة 3 للهجوم ، أي أن الفأر يهاجم جسم التحفيز ، مما يجعل حركات العض و / أو الإمساك.
      5. أعط درجة 4 للعناية بالوجه غير المتماثل ، أي أن الماوس يعرض سلسلة متواصلة من ثلاث ضربات غسل وجه على الأقل موجهة نحو منطقة الوجه المحفزة.
    7. لكل فأر ، ضع شعر فون فراي بترتيب تصاعدي من الشدة وحفز بشكل عشوائي الجوانب المماثلة والمقابلة. ضع كل شدة تحفيز مرة واحدة على كل جانب.
    8. احسب متوسط الدرجة من الردود على شعيرات فون فراي الأربعة داخل كل. احسب درجات منفصلة للجوانب المماثلة والمقابلة.

النتائج

تظهر فئران DIoN-CCI زيادة قوية بعد العملية الجراحية في الوقت الذي يقضيه في العناية بالوجه المعزول وعدد نوبات العناية بالوجه المعزولة (الشكل 3). تحدث أقوى زيادة خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة ثم تصبح أصغر خلال الأسابيع التالية ولكنها تزداد بشكل ملحوظ لمدة 6 أس...

Discussion

في الفئران ، قيل سابقا أن النهج داخل المداري لإنترنت الأشياء هو الأفضل ، مع الأخذ في الاعتبار أهمية العضلات الدقيقة السليمة التي تتحكم في أنماط الخفقان المعقدة في التمييز الاهتزازي اللمسي والمسافة النسبية لشق منتصف الخط إلى منطقة العصب تحت الحجاج الجلدية10...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

ليس لدى المؤلفين أي اعترافات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromic catgut (6-0)Dynek CG602Dligatures
Cotton applicatorPharmacy
Digital video cameraSonyHDR-CX330E
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)Fine Science Tools11253-25
DuratearsAlcon0037-820ophthalmic ointment
Hooked ligation aidFine Science Tools18062-12
KetalarPfizerketamine (50 mg/mL)
Operation microscopeKapsSOM 62
Precision cotton swabQosina10225
Precision trimmerPhilipsHP6392/00
RompunBayerxylazine (2%)
Scissors - blunt tipsFine Science Tools14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kitStoelting58011
Vicryl RapideEthiconMPVR489Hsutures

References

  1. Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu Rev Neurosci. 32, 1-32 (2009).
  2. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain. 7, 281-289 (2006).
  3. Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
  4. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
  5. Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5, 491-497 (2004).
  6. Basbaum, A. I., Campbell, J. N., et al. Measurrement and New Technologies. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. , (2006).
  7. Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112, 12-15 (2004).
  8. Vierck, C. J., Campbell, J. N., et al. Animal Studies of Pain: Lessons for Drug Development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. , (2006).
  9. Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
  10. Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. J Vis Exp. (103), e53167 (2015).
  11. Mogil, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nat Rev Neurosci. 10 (4), 283-294 (2009).
  12. Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav Brain Res. 125 (1-2), 65-73 (2001).
  13. Ding, W., et al. An improved rodent model of trigeminal neuropathic pain by unilateral chronic constriction injury of distal infraorbital nerve. J Pain. 18 (8), 899-907 (2017).
  14. Hardt, S., Fischer, C., Vogel, A., Wilken-Schmitz, A., Tegeder, I. Distal infraorbital nerve injury: a model for persistent facial pain in mice. Pain. 160 (6), 1431-1447 (2019).
  15. Krzyzanowska, A., Avendaño, C. Behavioral testing in rodent models of orofacial neuropathic and inflammatory pain. Brain Behav. 2 (5), 678-697 (2012).
  16. Martin, Y. B., Malmierca, E., Avendaño, C., Nuñez, A. Neuronal disinhibition in the trigeminal nucleus caudalis in a model of chronic neuropathic pain. Eur J Neurosci. 32 (3), 399-408 (2010).
  17. Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
  18. Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. J Headache Pain. 20 (1), 11 (2019).
  19. Krzyzanowska, A., et al. Assessing nociceptive sensitivity in mouse models of inflammatory and neuropathic trigeminal pain. J Neurosci Methods. 201 (1), 46-54 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DIoN CCI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved