A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم توفير بروتوكول لثقافة عضويات المريء البشري وثقافة واجهة الهواء السائل. يمكن استخدام ثقافة واجهة الهواء السائل لعضويات المريء لدراسة تأثير السيتوكينات على الحاجز الظهاري المريئي.

Abstract

تتعرض ظهارة المريء الحرشفية مباشرة للبيئة ، وتواجه باستمرار المستضدات الأجنبية ، بما في ذلك مستضدات الطعام والميكروبات. يعد الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري أمرا بالغ الأهمية للوقاية من العدوى وتجنب الالتهاب الناجم عن المستضدات المشتقة من الغذاء غير الضارة. توفر هذه المقالة بروتوكولات مبسطة لتوليد عضويات المريء البشرية وثقافات واجهة الهواء السائل من خزعات المريض لدراسة المقصورة الظهارية للمريء في سياق توازن الأنسجة والمرض. كانت هذه البروتوكولات معالم علمية مهمة في العقد الماضي ، حيث وصفت الهياكل الشبيهة بالأعضاء ثلاثية الأبعاد من الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، والمواد العضوية ، وثقافات واجهة الهواء والسائل. إنها توفر إمكانية التحقيق في وظيفة السيتوكينات المحددة وعوامل النمو ومسارات الإشارات في ظهارة المريء في إطار ثلاثي الأبعاد مع الحفاظ على الخصائص الظاهرية والجينية للمتبرع. توفر المواد العضوية معلومات عن العمارة المجهرية للأنسجة من خلال تقييم النسخ والبروتين بعد تحفيز السيتوكين. في المقابل ، تسمح ثقافات واجهة الهواء السائل بتقييم سلامة الحاجز الظهاري من خلال المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو قياسات تدفق الجزيئات. يعد الجمع بين هذه الكائنات العضوية وثقافات واجهة الهواء السائل أداة قوية لتطوير البحث في ظروف الحاجز الظهاري المريئي الضعيف.

Introduction

يضر التهاب المريء بسلامة الحاجز الظهاري1،2،3،4،5 ، كما لوحظ في التهاب المريء اليوزيني (EoE) ، وهو مرض التهابي مزمن يهيمن عليه Th2 في المريء6. تم وصف EoE لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين7،8 ويتم تحريضه في الغالب بواسطة مستضدات الغذاء9،10،11،12،13. الأعراض الأكثر ش....

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في شمال غرب ووسط سويسرا (EKNZ; معرف المشروع 2019-00273). قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام التجريبي للخزعات قبل الفحص بالمنظار. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. عزل الخلايا لعضويات المريء المشتقة من المريض

ملاحظة: ترد في الجدول 1 قائمة بالمكونات المتوسطة لزراعة عضويات المريء البشري.

  1. الحصول على الخزعات.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم الحصول على خزعتين من جزء واحد من المريء أثناء تنظير المريء والمعدة والاثني عشر باستخدام ملقط خزعة باستخدام منظار المعدة مع قن....

النتائج

ستنمو عضويات المريء من الخلايا الأولية المستخرجة من خزعات المريض وفقا لتعليمات البروتوكول المقدم ، كما هو موثق باستخدام مجهر برايت فيلد المقلوب (الشكل 1). تبدأ ASCs الظهارية في تكوين مجموعات الخلايا بطريقة ذاتية التنظيم خلال اليومين الأولين من الثقافة بعد بذر الخلايا المعز?.......

Discussion

تسمح الإجراءات المقدمة بزراعة المواد العضوية المشتقة من المريض وثقافات ALI مع احتمالات عالية للنجاح. تم تكييف بروتوكول العضوي من أول بروتوكول منشور يبلغ عن توليد عضويات المريء البشري26 ومن بروتوكول32 المنشور مؤخرا. وصف شيريل وزملاؤه نموذج ALI22. تساعد ال.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

دعمت منحة SNSF 310030_219210 إلى J.H.N. نشر هذه المخطوطة دون قيود. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

References

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved