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Résumé

Ici, un protocole pour la culture d’organoïdes œsophagiens humains et la culture d’interface air-liquide est fourni. La culture de l’interface air-liquide des organoïdes œsophagiens peut être utilisée pour étudier l’impact des cytokines sur la barrière épithéliale œsophagienne.

Résumé

L’épithélium squameux de l’œsophage est directement exposé à l’environnement, faisant continuellement face à des antigènes étrangers, y compris des antigènes alimentaires et des microbes. Le maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale est essentiel pour prévenir les infections et éviter l’inflammation causée par des antigènes inoffensifs d’origine alimentaire. Cet article fournit des protocoles simplifiés pour générer des organoïdes œsophagiens humains et des cultures d’interface air-liquide à partir de biopsies de patients afin d’étudier le compartiment épithélial de l’œsophage dans le contexte de l’homéostasie tissulaire et de la maladie. Ces protocoles ont constitué des jalons scientifiques importants au cours de la dernière décennie, décrivant des structures tridimensionnelles ressemblant à des organes à partir de cellules primaires dérivées de patients, d’organoïdes et de cultures d’interface air-liquide. Ils offrent la possibilité d’étudier la fonction de cytokines, de facteurs de croissance et de voies de signalisation spécifiques dans l’épithélium de l’œsophage dans un cadre tridimensionnel tout en conservant les propriétés phénotypiques et génétiques du donneur. Les organoïdes fournissent des informations sur la microarchitecture tissulaire en évaluant le transcriptome et le protéome après stimulation par cytokines. En revanche, les cultures d’interface air-liquide permettent d’évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale par des mesures de résistance transépithéliale (TEER) ou de flux de macromolécules. La combinaison de ces organoïdes et des cultures d’interface air-liquide est un outil puissant pour faire avancer la recherche sur les altérations de la barrière épithéliale œsophagienne.

Introduction

L’inflammation de l’œsophage compromet l’intégrité de la barrière épithéliale 1,2,3,4,5, comme observé dans l’œsophagite à éosinophiles (EoE), une maladie inflammatoire chronique de l’œsophage6 dominée par Th2. L’œsophage à éosinophile a été décrit pour la première fois dans les années 1990 7,8 et est principalement induit par des antigènes alimentaires 9,10,11,12,13. Les symptômes les plus fréquents de l’œsophage à éosinophiles dans la population adulte sont la dysphagie et la fématologie alimentaire14. Chez les enfants, l’œsophage à éosinophile se manifeste généralement par un retard de croissance, un refus de nourriture, des vomissements et des douleurs abdominales15. Les études d’association à l’échelle du génome (GWAS) ont identifié des gènes de risque d’œsophage à éosinophile impliqués dans l’intégrité de la barrière épithéliale, plaçant l’épithélium au centre de la recherche sur l’œstroïdeà éosinophiles 16,17,18. La transcriptomique de l’EoE a en outre révélé qu’un processus de différenciation altéré et une hyperplasie réactive de la zone basale sont à l’origine de la fonction barrière compromise de l’épithélium œsophagien 3,5,19,20,21,22. La compréhension précoce de l’œsophagite à éosinophile comme étant une maladie médiée par Th26 a conduit à la découverte de l’IL-13 en tant que médiateur moteur en perturbant l’intégrité épithéliale 3,4,21,23. Les systèmes expérimentaux permettant de dissectionr les effets médiés par les cytokines sur l’intégrité épithéliale à partir d’une altération de la barrière intrinsèque par prédisposition génétique offrent la possibilité d’étudier l’interaction complexe entre les cellules immunitaires et l’épithélium dans l’œsophage à éosinophiles. Des organoïdes œsophagiens humains et des cultures d’interface air-liquide (ALI) ont été proposés comme des outils précieux pour analyser les conséquences de la stimulation des cytokines sur l’intégrité épithéliale5.

Le premier protocole de génération d’organoïdes œsophagiens dérivés de cellules souches spécifiques aux tissus (ASC) adultes a été établi cinq ans après les premiers rapports publiés sur les organoïdes intestinaux en 2009 utilisant des ASC intestinales Lgr5+ récapitulant le compartiment épithélial de l’intestin grêle24. DeWard et al. ont été les pionniers de la génération d’organoïdes à partir de cellules épithéliales œsophagiennesmurines 25. En 2018, Kasagi et al. ont généré des organoïdes œsophagiens humains à partir de la lignée cellulaire épithéliale épidermoïde de l’œsophage humain immortalisée EPC2-hTERT et de cellules primaires dérivées de patients26. La même année, Zhang et al. ont réussi à générer des organoïdes œsophagiens dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ils ont souligné l’importance de l’inhibition du TGFβ et de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) pour le développement des cellules progénitrices de l’œsophage (EPC) et le rôle crucial de la signalisation Notch dans la différenciation de l’épithélium épidermoïde stratifié26,27. Trisno et ses collègues ont complété ces résultats en identifiant Sox2 comme un inhibiteur de Wnt qui oriente le destin du développement vers la différenciation œsophagienne28. Les améliorations ultérieures des protocoles, de la composition du milieu et des conditions de culture ont augmenté le taux de formation d’organoïdes et ont rendu possible la sous-culture et la récupération d’organoïdes après cryoconservation 26,29,30,31,32. Bien que ces organoïdes soient des outils puissants pour étudier l’architecture tissulaire et l’expression de gènes cibles potentiels après stimulation par des cytokines, les organoïdes œsophagiens n’offriront pas la possibilité de mesurer la résistance transépithéliale (TEER) ou le flux de macromolécules comme mesures directes de l’intégrité de la barrière. Comme décrit précédemment par Sherrill et ses collègues22, les cultures ALI modélisant la différenciation épithéliale4 permettent des évaluations directes de l’intégrité épithéliale. La combinaison d’organoïdes dérivés de patients et de cultures ALI est un outil puissant pour étudier l’architecture tissulaire et l’intégrité de la barrière épithéliale dans l’œsémination à éosinophiles.

Voici des procédures avec des instructions pour isoler des cellules viables à partir de biopsies œsophagiennes et établir des cultures d’organoïdes œsophagiens et d’ALI qui peuvent être utilisées pour étudier les effets des cytokines sur l’intégrité de la barrière.

Protocole

Les procédures ont été approuvées par la Commission d’éthique de la Suisse du Nord-Ouest et centrale (EKNZ ; N° de projet 2019-00273). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit pour l’utilisation expérimentale des biopsies avant l’examen endoscopique. Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement cellulaire pour les organoïdes œsophagiens dérivés de patients

REMARQUE : Le tableau 1 présente une liste des constituants du milieu pour la culture des organoïdes œsophagiens humains.

  1. Obtenez les biopsies.
    REMARQUE : Dans la présente étude, deux biopsies d’un segment de l’œsophage sont obtenues lors d’une œsophagogastroduodénoscopie à l’aide d’une pince à biopsie à l’aide d’un gastroscope avec un canal fonctionnel de 2,8 mm.
  2. Transférez les biopsies dans un milieu sans sérum de kératinocytes disponible dans le commerce (KSFM ; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    REMARQUE : Les biopsies peuvent être conservées sur de la glace pendant plusieurs heures jusqu’à leur utilisation.
  3. Remplacez le milieu KSFM par 1 mL de Dispase I (10 U/mL) et incubez les biopsies pendant 10 min à température ambiante.
  4. Centrifuger les biopsies à température ambiante à 300 x g pendant 2 min.
  5. Aspirez la Dispase à l’aide d’une pipette de 1000 μL sans toucher les biopsies et la pastille de débris cellulaires.
  6. Rincer les biopsies avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
  7. Centrifuger les biopsies à température ambiante à 300 x g pendant 2 min.
  8. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
  9. Incuber les biopsies avec 500 μL de trypsine-EDTA (0,05 %) à 37 °C pendant 10 min tout en agitant à 800 tr/min.
  10. Effectuer une perturbation mécanique par pipetage répété de haut en bas jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire.
  11. Filtrez les cellules à travers une passoire de cellules de 70 μm à l’aide de la tête de piston en caoutchouc d’une seringue à tuberculine.
  12. Lavez la passoire avec 2 à 4 mL d’inhibiteur de trypsine de soja (250 μg/mL).
  13. Filtrez les cellules à travers une crépine de 35 μm avec un capuchon encliquetable sur un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
  14. Transférez la solution unicellulaire dans un tube conique de 15 ml.
  15. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
  16. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
  17. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de milieu KSFM.
  18. Mélangez 10 μL de bleu trypan avec 10 μL de suspension cellulaire.
  19. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.

2. Culture d’organoïdes dérivée du patient

  1. Ajouter 1 à 2 mL de KSFM à la suspension cellulaire après le comptage.
  2. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
  3. Aspirer le surnageant avec une pipette de 1000 μL sans perturber la pastille de cellule.
  4. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans une matrice d’hydrogel à l’extrait de membrane basale (40 μL de BME pour 20 000 cellules).
    REMARQUE : Après avoir ajouté le BME, gardez les cellules sur de la glace pour éviter la solidification prématurée du BME.
  5. Coupez une pointe de pipette de 200 μL pour aspirer le mélange de suspension visqueuse BME-cellule.
  6. Former des gouttelettes de 40 μL dans une plaque de culture cellulaire en suspension préchauffée (37 °C).
  7. Incuber la plaque sans milieu pendant 20-30 min à 37 °C pour assurer la solidification des gouttelettes BME.
  8. Ajouter un milieu KSFM-C préchauffé complété par 10 μM de Y27632 (inhibiteur de ROCK) pendant les deux premiers jours de culture.
  9. Remplacez le milieu par un nouveau milieu KSFM-C (sans Y27632 et +/- cytokine d’intérêt) tous les deux jours.
  10. Aspirez le milieu et grattez les gouttelettes avec la pointe de la pipette tout en ajoutant continuellement 1 mL de Dispase II (1,5 U/mL) dans le puits.
  11. Transvasez le mélange BME-dispase dans un tube à centrifuger de 15 mL et incubez-le pendant 20 min à 37 °C dans un bain-marie agité pour digérer le BME.
  12. Centrifuger à 250 x g pendant 3 min à 4 °C et aspirer la Dispase II.
  13. Procéder selon le protocole de lecture d’intérêt (p. ex., isolement de l’ARN, isolement des protéines ou fixation avec 4 % de PFA pour l’histologie).

3. Isolement cellulaire pour les cultures d’interface air-liquide (ALI) dérivées de patients

  1. Obtenez les biopsies. Lors d’une œsophagogastroduodénoscopie à l’aide d’un gastroscope avec un canal fonctionnel de 2,8 mm, deux biopsies sont prélevées sur un segment de l’œsophage à l’aide d’une pince à biopsie.
  2. Placez les biopsies dans un milieu sans sérum de kératinocytes disponible dans le commerce (KSFM ; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL d’EGF, 50 μg/mL de BPE) et conserver sur glace pendant plusieurs heures jusqu’à utilisation.
  3. Remplacez KSFM par 1 mL de Dispase (10 U/mL). Ensuite, incubez les biopsies pendant 10 minutes à température ambiante.
  4. Centrifuger les biopsies à température ambiante à 300 x g pendant 2 min.
  5. Retirez la dispase à l’aide d’une pipette de 1000 μL sans toucher les biopsies et les débris cellulaires.
  6. Lavez les biopsies avec 1 mL de DPBS.
  7. À température ambiante, faire tourner les biopsies à 300 x g pendant 2 min.
  8. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
  9. Incuber les biopsies dans 500 μL de Trypsine-EDTA (0,05 %) à 37 °C pendant 10 min et mélanger continuellement à 800 tr/min pendant l’incubation.
  10. Perturber mécaniquement les biopsies par des pipetages répétés de haut en bas jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire.
  11. Faites passer les cellules dissociées à travers une passoire de cellules de 70 μm avec une tête de piston en caoutchouc à partir d’une seringue à tuberculine et collectez les cellules dans un tube conique de 50 mL.
  12. Lavez la passoire avec 2 à 4 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja (250 μg/mL) pour retirer les cellules restantes de la passoire.
  13. Filtrez les cellules à l’aide d’un capuchon à crépine de 35 μm dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml.
  14. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL.
  15. Centrifugeuse à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
  16. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
  17. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de milieu KSFM (Ca2+ 0,09 mM), y compris 10 μM Y27632.
  18. Transférez les cellules dans une fiole de culture cellulaire T25.
  19. Pour développer les kératinocytes primaires, cultivez les cellules jusqu’à une confluence de 60 à 80 % pendant environ 1 semaine.
    REMARQUE : Le passage (P)0 forme des conglomérats cellulaires en forme d’îlots et n’est pas une monocouche. Les kératinocytes primaires forment des monocouches à partir de P1.
  20. Passage à 60%-80% de confluence et réensemencement de P1 dans 2-3 flacons de culture cellulaire T25 ou 1-2 T75.
  21. Passage P1 à nouveau lorsque les kératinocytes forment une monocouche avec une confluence de 60 % à 80 %.

4. Culture d’interface air-liquide (ALI) dérivée du patient

  1. Ensemencer les kératinocytes primaires P2 sur des inserts transpuits pour la culture ALI.
    REMARQUE : Ensemencer 400 000 cellules dans 12 puits (200 000 kératinocytes par 0,6 cm2) dans 500 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL d’EGF, 50 μg/mL de BPE).
    1. Ensemencer 150 000 cellules dans 24 puits (155 000 kératinocytes par 0,5cm2) dans 100 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL d’EGF, 50 μg/mL de BPE).
    2. Vous pouvez également congeler dans le milieu KSFM (Ca2+ 0,09 mM + 10 % de DMSO) à -80 °C pendant 24 h, puis transférer les cellules congelées dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Lors de l’utilisation de flacons congelés, passez une fois de plus après la décongélation avant d’utiliser les cellules pour la culture ALI.
  2. Ajouter le milieu dans le puits inférieur sous l’insert de la plaque de culture transwell.
    REMARQUE : Pour les plaques à 12 puits : 1,5 mL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL de BPE). Pour 24 plaques à puits : 600 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL d’EGF, 50 μg/mL de BPE).
  3. Remplacer le KSFM de calcium moyen à élevé (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) après 2 jours.
  4. Changez le milieu KSFM à haute teneur en calcium tous les deux jours jusqu’au jour 7.
  5. Effectuer le transport aérien le jour 7 en aspirant le milieu de la chambre supérieure et en remplaçant le milieu dans la chambre inférieure par du KSFM à haute teneur en calcium (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL de BPE) contenant 10 ng/mL de KGF (=FGF7), 75 μg/mL d’acide ascorbique (AA).
    1. Facultatif : Ajouter la cytokine d’intérêt à la concentration souhaitée dans le milieu.
  6. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’au 14e jour.

5. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)

  1. Stérilisez l’électrode du TEER en l’immergeant dans un puits d’une plaque de 24 puits avec de l’hypochlorite de sodium à 5% pendant 10-15 min.
  2. Lavez l’hypochlorite de sodium à 5 % en immergeant l’électrode dans 4 puits consécutifs avec du ddH2O stérile et en laissant l’électrode sécher à l’air.
  3. Réglez l’ébauche en plaçant une électrode dans le puits et la deuxième électrode dans l’insert de transpuits, en le remplissant de PBS et en mesurant le TEER.
    REMARQUE : Volumes recommandés pour les mesures TEER : Pour une plaque à 12 puits (1900 μL dans le puits et 900 μL dans l’insert). Pour plaque à 24 puits (750-1000 μL dans le puits et 250 μL dans l’insert).
  4. Remplacer le milieu des cultures ALI par du PBS stérile à température ambiante.
    REMARQUE : Retirez le fluide du puits inférieur et, dans un deuxième temps, de l’insert de transpuits. De même, ajoutez d’abord du PBS dans l’insert, puis dans le puits inférieur pour éviter le détachement de la culture ALI de la membrane du transwell.
  5. Placez les électrodes du compteur TEER dans les puits expérimentaux avec des cultures ALI et effectuez la mesure TEER1.
    REMARQUE : Effectuez des mesures FEER tous les deux jours avant de changer de support.

6. Flux macromoléculaires

  1. Diluer la solution mère de FITC-Dextran (3-5 kDa) à une concentration de travail de 1 mg/mL.
    REMARQUE : Protégez toujours FITC-Dextran de l’exposition à la lumière.
  2. Préparez une rangée de dilution avec une concentration FITC décroissante (1000 μg/mL à 0,25 μg/mL) comme norme pour la lecture.
  3. Ajouter 500 μL de solution de FITC-dextran (1 mg/mL) dans la chambre supérieure du puits transwell et 1,5 mL de milieu (+/- cytokine d’intérêt) dans le compartiment inférieur et placer la plaque dans l’incubateur.
  4. Prélever 120 μL de fluide dans le compartiment inférieur aux points de temps respectifs (p. ex., 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min et 180 min).
  5. La pipette duplique (50 μL/puits) de chaque point temporel dans une plaque à fond plat transparent noire de 96 puits.
  6. Excité le FITC-dextran à 490 nm et lecture de l’émission à une longueur d’onde de 520 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
  7. Calculez la quantité de flux macromoléculaire selon la norme.

Résultats

Les organoïdes œsophagiens se développeront à partir de cellules primaires extraites des biopsies des patients conformément aux instructions du protocole fourni, tel que documenté avec un microscope à fond clair inversé (Figure 1). Les ASC épithéliales commencent à former des amas de cellules de manière auto-organisée dans les deux premiers jours de culture après l’ensemencement des cellules isolées dans l’extrait de membrane basale, servant d’échafaudage. La taille et ...

Discussion

Les procédures fournies permettent la culture d’organoïdes dérivés de patients et de cultures ALI avec de fortes chances de succès. Le protocole des organoïdes a été adapté à partir du premier protocole publié rapportant la génération d’organoïdes œsophagiens humains26 et d’un protocole récemment publié32. Sherill et ses collègues ont décrit le modèleALI 22. Les organoïdes et les modèles de culture ALI s’entraident dans ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La subvention FNS 310030_219210 accordée à J.H.N. a soutenu la publication de ce manuscrit sans restriction. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Références

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