Modèles de culture cellulaire tridimensionnels pour étudier la barrière épithéliale dans l’œsophagite à éosinophiles

Résumé

Ici, un protocole pour la culture d’organoïdes œsophagiens humains et la culture d’interface air-liquide est fourni. La culture de l’interface air-liquide des organoïdes œsophagiens peut être utilisée pour étudier l’impact des cytokines sur la barrière épithéliale œsophagienne.

Résumé

L’épithélium squameux de l’œsophage est directement exposé à l’environnement, faisant continuellement face à des antigènes étrangers, y compris des antigènes alimentaires et des microbes. Le maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale est essentiel pour prévenir les infections et éviter l’inflammation causée par des antigènes inoffensifs d’origine alimentaire. Cet article fournit des protocoles simplifiés pour générer des organoïdes œsophagiens humains et des cultures d’interface air-liquide à partir de biopsies de patients afin d’étudier le compartiment épithélial de l’œsophage dans le contexte de l’homéostasie tissulaire et de la maladie. Ces protocoles ont constitué des jalons scientifiques importants au cours de la dernière décennie, décrivant des structures tridimensionnelles ressemblant à des organes à partir de cellules primaires dérivées de patients, d’organoïdes et de cultures d’interface air-liquide. Ils offrent la possibilité d’étudier la fonction de cytokines, de facteurs de croissance et de voies de signalisation spécifiques dans l’épithélium de l’œsophage dans un cadre tridimensionnel tout en conservant les propriétés phénotypiques et génétiques du donneur. Les organoïdes fournissent des informations sur la microarchitecture tissulaire en évaluant le transcriptome et le protéome après stimulation par cytokines. En revanche, les cultures d’interface air-liquide permettent d’évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale par des mesures de résistance transépithéliale (TEER) ou de flux de macromolécules. La combinaison de ces organoïdes et des cultures d’interface air-liquide est un outil puissant pour faire avancer la recherche sur les altérations de la barrière épithéliale œsophagienne.

Introduction

L’inflammation de l’œsophage compromet l’intégrité de la barrière épithéliale ^1,2,3,4,5, comme observé dans l’œsophagite à éosinophiles (EoE), une maladie inflammatoire chronique de l’œsophage⁶ dominée par Th2. L’œsophage à éosinophile a été décrit pour la première fois dans les années 1990 ^7,8 et est principalement induit par des antigènes alimentaires ^{9,10,11,12,13}

Protocole

Les procédures ont été approuvées par la Commission d’éthique de la Suisse du Nord-Ouest et centrale (EKNZ ; N° de projet 2019-00273). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit pour l’utilisation expérimentale des biopsies avant l’examen endoscopique. Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement cellulaire pour les organoïdes œsophagiens dérivés de patients

REMARQUE : Le tableau 1 présente une liste des constituants du milieu pour la culture des organoïdes œsophagiens humains.

Discussion

Les procédures fournies permettent la culture d’organoïdes dérivés de patients et de cultures ALI avec de fortes chances de succès. Le protocole des organoïdes a été adapté à partir du premier protocole publié rapportant la génération d’organoïdes œsophagiens humains²⁶ et d’un protocole récemment publié³². Sherill et ses collègues ont décrit le modèle^{ALI 22}. Les organoïdes et les modèles de culture ALI s’entraident dans .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254