好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル

要約

ここでは、ヒト食道オルガノイドの培養と気液界面培養のプロトコールを提供します。食道オルガノイドの気液界面培養は、サイトカインが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究するために使用できます。

要約

食道の扁平上皮は環境に直接さらされ、食物抗原や微生物などの外来抗原に絶えず直面しています。上皮バリアの完全性を維持することは、感染を予防し、無害な食品由来抗原によって引き起こされる炎症を避けるために重要です。この記事では、患者の生検からヒト食道オルガノイドおよび気液界面培養物を生成するための簡略化されたプロトコルを提供し、組織の恒常性と疾患の文脈で食道の上皮コンパートメントを研究します。これらのプロトコルは、過去10年間で重要な科学的マイルストーンであり、患者由来の初代細胞、オルガノイド、および気液界面培養からの3次元臓器様構造を記述しています。彼らは、ドナーの表現型および遺伝的特性を維持しながら、食道上皮における特定のサイトカイン、成長因子、およびシグナル伝達経路の機能を三次元フレームワーク内で調査する可能性を提供します。オルガノイドは、サイトカイン刺激後のトランスクリプトームとプロテオームを評価することにより、組織の微細構造に関する情報を提供します。対照的に、気液界面培養では、経上皮抵抗性(TEER)または高分子フラックス測定を通じて上皮バリアの完全性を評価できます。これらのオルガノイドと気液界面培養を組み合わせることで、食道上皮バリア障害疾患の研究を進めるための強力なツールとなります。

概要

食道の炎症は、Th2優位の食道の慢性炎症性疾患である好酸球性食道炎(EoE)で観察されるように、上皮バリアの完全性1,2,3,4,5を損なう6。EoEは1990^{年代に初めて}報告され^7,8、主に食物抗原^{9,10,11,12,13}によって誘導されます。成人集団で最も頻繁に発生するEoEの症状は、嚥下障害と食物宿便^です14。小児では、EoEは通常、成長の失敗、食物拒否、嘔吐、および腹痛を伴って現れます¹⁵。ゲノムワイド関連解析(GWAS....

プロトコル

この手続きは、北西および中央スイスの倫理委員会(EKNZ;Project-ID 2019-00273)。すべての患者は、内視鏡検査の前に生検の実験的使用について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. 患者由来の食道オルガノイドの細胞単離

注:ヒト食道オルガノイドを培養するための培地成分のリストを 表1に示します。

1. 生検を取得します。
   注: 本研究では、2.8 mm のワーキング チャネルを備えた胃鏡を使用して、生検鉗子を使用した食道胃十二指腸内視鏡検査中に、1 つの食道セグメントから 2 つの生検が取得されます。
2. 生検を市販のケラチノサイト無血清培地(KSFM;Ca²⁺ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)。
   注:生検は、使用まで数時間氷上に保存できます。
3. KSFM培地を1 mLのディスパーゼI(10 U/mL)と交換し、生検を室温で10分間インキュベートします。
4. 生検を室温で300 x g で2分間遠心分離します。
5. 1000 μLピペットを使用して、生検や細....

ディスカッション

提供される手順により、患者由来のオルガノイドとALI培養の培養が可能になり、成功の見込みが高いです。オルガノイドプロトコルは、ヒト食道オルガノイド²⁶の生成を報告した最初に公開されたプロトコルから、および最近発表されたプロトコル³²から適応された。Sherill氏らは、ALIモデル²²について説明しました。オルガノイドとALI培養.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254