三维细胞培养模型研究嗜酸性粒细胞性食管炎中上皮屏障

摘要

在这里，提供了人食管类器官培养和气液界面培养的方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障的影响。

摘要

食管鳞状上皮直接暴露在环境中，不断面对外来抗原，包括食物抗原和微生物。保持上皮屏障的完整性对于预防感染和避免由无害的食物源性抗原引起的炎症至关重要。本文提供了从患者活检生成人食管类器官和气液界面培养物的简化方案，以在组织稳态和疾病的背景下研究食管上皮室。这些方案是过去十年中重要的科学里程碑，描述了来自患者来源的原代细胞、类器官和气液界面培养物的三维器官样结构。它们提供了在三维框架内研究食管上皮中特定细胞因子、生长因子和信号通路功能的可能性，同时保持供体的表型和遗传特性。类器官通过评估细胞因子刺激后的转录组和蛋白质组来提供有关组织微结构的信息。相比之下，气液界面培养允许通过跨上皮阻力 （TEER） 或大分子通量测量来评估上皮屏障的完整性。将这些类器官和气液界面培养物相结合是推进食管上皮屏障受损条件研究的有力工具。

引言

食管炎症会损害上皮屏障的完整性 1,2,3,4,5，^如嗜酸性粒细胞性食管炎 （EoE） 所观察到的那样，这是一种以 Th2 为主的食管慢性炎症性疾病 6。EoE 于 1990 年代首次描述 ^7,8，主要由食物抗原 ^{9,10,11,12,13} 诱导。成人中最常见的 EoE 症状是吞咽困难和食物嵌塞¹⁴。在儿童中，EoE 通常表现为生长迟缓、食物拒绝、呕吐和腹痛¹⁵。全基因组关联研究 （GWAS） 已确定与上皮屏障完整性相关的 EoE....

研究方案

这些程序得到了瑞士西北部和中部伦理委员会（EKNZ;项目ID 2019-00273）。所有患者在内窥镜检查前都提供了实验性使用活检的书面知情同意书。研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 患者来源的食管类器官的细胞分离

注： 表1中提供了用于培养人食管类器官的培养基成分列表。

1. 进行活检。
   注：在本研究中，在食管胃十二指肠镜检查期间，使用具有 2.8 毫米工作通道的胃镜使用活检钳从一个食管段获得两个活检。
2. 将活检转移到市售的角质形成细胞无血清培养基（KSFM;钙²⁺ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 μg/mL BPE）。
   注意：活检可以在冰上储存几个小时直至使用。
3. 用 1 mL 分散酶 I （10 U/mL） 替换 KSFM 培养基，并在室温下孵育活检 10 分钟。
4. 将活检物在室温下以300× g 离心2分钟。
5. 使用 1000 μL 移液管吸出分散酶，而不接触活检和细胞碎片沉淀。
6. 用 1 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 冲洗活检。
7. 将活检物在室温下以300× g 离心2分钟。....

讨论

所提供的程序允许培养患者来源的类器官和 ALI 培养物，成功的可能性很高。类器官方案改编自第一个发表的报告人类食管类器官产生的方案²⁶ 和最近发表的方案³²。Sherill 及其同事描述了 ALI 模型²²。类器官和 ALI 培养模型在研究食管疾病（如 EoE ^5,26）中细胞因子和其他介质对食管上皮屏障的影响方?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254