Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Özofagusun skuamöz epiteli doğrudan çevreye maruz kalır ve sürekli olarak gıda antijenleri ve mikroplar dahil olmak üzere yabancı antijenlerle karşı karşıya kalır. Epitel bariyerinin bütünlüğünün korunması, enfeksiyonları önlemek ve zararsız gıda kaynaklı antijenlerin neden olduğu iltihaplanmayı önlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, doku homeostazı ve hastalığı bağlamında özofagusun epitel kompartmanını incelemek için hasta biyopsilerinden insan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, son on yılda, hastadan türetilen birincil hücrelerden, organoidlerden ve hava-sıvı arayüz kültürlerinden üç boyutlu organ benzeri yapıları tanımlayan önemli bilimsel kilometre taşları olmuştur. Donörün fenotipik ve genetik özelliklerini korurken, özofagus epitelinde spesifik sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının işlevini üç boyutlu bir çerçeve içinde araştırma imkanı sunarlar. Organoidler, sitokin stimülasyonu sonrası transkriptom ve proteomu değerlendirerek doku mikromimarisi hakkında bilgi sağlar. Buna karşılık, hava-sıvı arayüz kültürleri, transepitelyal direnç (TEER) veya makromolekül akı ölçümleri yoluyla epitel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verir. Bu organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürlerini birleştirmek, bozulmuş özofagus epitel bariyeri koşullarında araştırmaları ilerletmek için güçlü bir araçtır.

Giriş

Özofagus iltihabı, özofagusun Th2 baskın kronik inflamatuar bir hastalığı olan eozinofilik özofajitte (EoE) gözlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü 1,2,3,4,5 tehlikeye atar 6. EoE ilk olarak 1990'larda 7,8 tanımlanmıştır ve ağırlıklı olarak gıda antijenleri 9,10,11,12,13 tarafından indüklenmiştir. Yetişkin popülasyonda en sık görülen EoE semptomları disfaji ve gıda etkisidir14. Çocuklarda, EoE tipik olarak gelişememe, gıda reddi, kusma ve karın ağrısı ile kendini gösterir15. Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), epitel bariyer bütünlüğünde yer alan EoE risk genlerini tanımlamış ve epiteli EoE araştırmasının odak noktasına taşımıştır 16,17,18. EoE transkriptomikleri ayrıca, bozulmuş bir farklılaşma sürecinin ve reaktif bir bazal bölge hiperplazisinin, özofagus epitelinin 3,5,19,20,21,22 bozulmuş bariyer fonksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. EoE'nin Th2 aracılı bir hastalık6 olduğunun erken anlaşılması, epitel bütünlüğünü bozarak IL-13'ün itici bir aracı olarak keşfedilmesine yol açmıştır 3,4,21,23. Epitel bütünlüğü üzerindeki sitokin aracılı etkilerin genetik yatkınlık yoluyla içsel bariyer bozukluğundan diseksiyonuna izin veren deneysel sistemler, EoE'deki immün hücreler ve epitel arasındaki karmaşık etkileşimi inceleme imkanı sağlar. İnsan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri, sitokin stimülasyonunun epitel bütünlüğü üzerindeki sonucunu analiz etmek için değerli araçlar olarak önerilmiştir5.

Yetişkin dokuya özgü kök hücre (ASC) türevi özofagus organoidlerinin üretilmesi için ilk protokol, 2009 yılında bağırsak organoidlerinin ilk yayınlanan raporlarından beş yıl sonra, ince bağırsağın epitel bölmesini özetleyen bağırsak Lgr5 + ASC'leri kullanılarak oluşturulmuştur24. DeWard ve ark. murin özofagus epitel hücrelerinden organoidlerin üretilmesine öncülük etti25. 2018'de Kasagi ve ark. ölümsüzleştirilmiş insan özofagus skuamöz epitel hücre hattı EPC2-hTERT ve birincil hasta kaynaklı hücrelerden insan özofagus organoidleri üretti26. Aynı yıl, Zhang ve ark. indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi özofagus organoidlerini başarıyla üretti. Özofagus progenitör hücre (EPC) gelişimi için TGFβ ve kemik morfogenetik protein (BMP) inhibisyonunun önemini ve tabakalı skuamöz epitelin farklılaşmasında Notch sinyallemesinin kritik rolünü tanımladılar26,27. Trisno ve meslektaşları, Sox2'yi gelişimsel kaderi özofagus farklılaşmasına yönlendiren bir Wnt inhibitörü olarak tanımlayarak bu bulguları tamamladılar28. Protokollerin, ortam bileşiminin ve kültür koşullarının müteakip iyileştirmeleri, organoid oluşum oranını arttırdı ve kriyoprezervasyondan sonra organoidlerin alt kültürlenmesini ve geri kazanılmasını mümkün kıldı 26,29,30,31,32. Bu organoidler, sitokinlerle stimülasyondan sonra doku mimarisini ve potansiyel hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için güçlü araçlar olmasına rağmen, özofagus organoidleri, bariyer bütünlüğü için doğrudan ölçümler olarak transepitelyal direnci (TEER) veya makromolekül akısını ölçme imkanı sunmayacaktır. Sherrill ve meslektaşları22 tarafından daha önce tanımlandığı gibi, epitelyal farklılaşmayımodelleyen ALI kültürleri 4, epitel bütünlüğünün doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Hasta kaynaklı organoidleri ve ALI kültürlerini birleştirmek, EoE'de doku mimarisini ve epitel bariyer bütünlüğünü araştırmak için güçlü bir araçtır.

Burada, özofagus biyopsilerinden canlı hücrelerin izole edilmesi ve sitokinlerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemek için daha fazla kullanılabilecek özofagus organoid ve ALI kültürlerinin oluşturulması için talimatlar içeren prosedürler verilmiştir.

Protokol

Prosedürler Kuzeybatı ve Orta İsviçre etik komitesi (EKNZ; Proje Kimliği 2019-00273). Tüm hastalar endoskopik incelemeden önce biyopsilerin deneysel kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hasta kaynaklı özofagus organoidleri için hücre izolasyonu

NOT: İnsan özofagus organoidlerinin kültürlenmesi için ortam bileşenlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.

  1. Biyopsileri alın.
    NOT: Bu çalışmada, biyopsi forseps ile özofagogastroduodenoskopi sırasında 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınmıştır.
  2. Biyopsileri ticari olarak temin edilebilen keratinosit serumsuz ortama aktarın (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    NOT: Biyopsiler kullanılana kadar birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.
  3. KSFM ortamını 1 mL Dispas I (10 U / mL) ile değiştirin ve biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  4. Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  5. Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı aspire edin.
  6. Biyopsileri 1 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile durulayın.
  7. Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  8. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.
  9. Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca 800 rpm'de çalkalarken inkübe edin.
  10. Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak mekanik bozulma gerçekleştirin.
  11. Bir tüberkülin şırıngasının kauçuk piston kafasını kullanarak hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  12. Süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.
  13. Hücreleri, 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüp üzerinde geçmeli kapaklı 35 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  14. Tek hücreli çözeltiyi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  15. 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  16. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.
  17. Hücreleri 100 μL KSFM ortamında yeniden süspanse edin.
  18. 10 μL tripan mavisini 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın.
  19. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.

2. Hasta kaynaklı organoid kültür

  1. Saydıktan sonra hücre süspansiyonuna 1-2 mL KSFM ekleyin.
  2. 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  3. Hücre peletini bozmadan süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.
  4. Hücre peletini Bodrum membran ekstraktı (BME) hidrojel matrisinde (20.000 hücre başına 40 μL BME) yeniden süspanse edin.
    NOT: BME'yi ekledikten sonra, BME'nin erken katılaşmasını önlemek için hücreleri buz üzerinde tutun.
  5. Viskoz BME hücreli süspansiyon karışımını aspire etmek için 200 μL'lik bir pipet ucunu kesin.
  6. Önceden ısıtılmış (37 °C) bir süspansiyon hücre kültürü plakasında 40 μL damlacıklar oluşturun.
  7. BME damlacıklarının katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 ° C'de 20-30 dakika besiyeri olmadan inkübe edin.
  8. Kültürün ilk iki günü için 10 μM Y27632 (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış KSFM-C ortamı ekleyin.
  9. Ortamı her gün yeni KSFM-C ortamıyla (Y27632 ve +/- ilgilenilen sitokin olmadan) değiştirin.
  10. Ortamı aspire edin ve kuyuya sürekli olarak 1 mL Dispase II (1.5 U / mL) eklerken pipet ucuyla damlacıkları kazıyın.
  11. BME-dispas karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve BME'yi sindirmek için çalkalayan bir su banyosunda 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  12. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve Dispase II'yi aspire edin.
  13. İlgi okumasının protokolüne göre ilerleyin (ör., RNA izolasyonu, protein izolasyonu veya histoloji için% 4 PFA ile fiksasyon).

3. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri için hücre izolasyonu

  1. Biyopsileri alın. 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak özofagogastroduodenoskopi sırasında biyopsi forsepsleri ile bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınır.
  2. Biyopsileri piyasada bulunan keratinosit serumu içermeyen ortama (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ve kullanıma kadar birkaç saat buz üzerinde saklayın.
  3. KSFM'yi 1 mL Dispase (10 U/mL) ile değiştirin. Daha sonra biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  4. Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  5. Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı çıkarın.
  6. Biyopsileri 1 mL DPBS ile yıkayın.
  7. Oda sıcaklığında, biyopsileri 2 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  8. Süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.
  9. Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) içinde 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında 800 rpm'de sürekli karıştırın.
  10. Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrarlanan yukarı ve aşağı pipetleme ile biyopsileri mekanik olarak bozun.
  11. Ayrışmış hücreleri, bir tüberkülin şırıngasından kauçuk bir piston kafası ile 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
  12. Süzgeçten kalan hücreleri çıkarmak için süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.
  13. Hücreleri 35 μm hücre süzgeci geçmeli kapakla 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe süzün.
  14. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  15. 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  16. Süpernatanı 1.000 μL'lik bir pipetle çıkarın.
  17. Hücre peletini 10 μM Y27632 dahil olmak üzere 4 mL KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM) yeniden süspanse edin.
  18. Hücreleri bir T25 hücre kültürü şişesine aktarın.
  19. Birincil keratinositleri genişletmek için, hücreleri yaklaşık 1 hafta boyunca% 60 -% 80 birleşene kadar kültürleyin.
    NOT: Geçiş (P)0, adacık benzeri hücre konglomeraları oluşturur ve tek katmanlı değildir. Primer keratinositler P1'den itibaren tek tabakalar oluştururlar.
  20. % 60 -% 80 birleşmede geçiş ve 2-3 T25 veya 1-2 T75 hücre kültürü şişelerinde P1'i yeniden tohumlayın.
  21. Keratinositler% 60 -% 80 birleşme ile bir tek tabaka oluşturduğunda tekrar P1 geçişi.

4. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürü

  1. ALI kültürü için P2 birincil keratinositlerini transwell eklere tohumlayın.
    NOT: 500 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 12 kuyulu ekte (0.6cm2 başına 200.000 keratinosit) 400.000 hücre tohumlayın.
    1. 100 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 24 kuyucuklu ekte (0.5cm2 başına 155.000 keratinosit) 150.000 hücre tohumlayın.
    2. Alternatif olarak, KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM + %10 DMSO) -80 °C'de 24 saat dondurun ve ardından donmuş hücreleri daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojene aktarın.
      NOT: Dondurulmuş şişeleri kullanırken, ALI kültürü için hücreleri kullanmadan önce çözüldükten sonra bir kez daha geçin.
  2. Transwell kültür plakasının ekinin altındaki alt kuyuya orta ekleyin.
    NOT: 12 oyuklu plaka için: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). 24 kuyucuklu plaka için: 600 μL KSFM (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Orta ila yüksek kalsiyumlu KSFM'yi (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 2 gün sonra değiştirin.
  4. Yüksek kalsiyumlu KSFM ortamını 7. güne kadar her iki günde bir değiştirin.
  5. 7. günde, ortamı üst odadan aspire ederek ve alt odadaki ortamı 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL askorbik asit (AA) içeren yüksek kalsiyumlu KSFM (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ile değiştirerek hava ikmali gerçekleştirin.
    1. İsteğe bağlı: Ortama istenen konsantrasyonda ilgilenilen sitokin ekleyin.
  6. Ortamı 14. güne kadar her iki günde bir değiştirin.

5. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü

  1. TEER ölçüm cihazının elektrodunu, 10-15 dakika boyunca% 5 sodyum hipoklorit içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak sterilize edin.
  2. Elektrodu steril ddH2O ile ardışık 4 kuyuya daldırarak ve elektrotun kurumasını sağlayarak %5 sodyum hipokloriti yıkayın.
  3. Bir elektrotu kuyuya ve ikinci elektrotu transwell ekine yerleştirerek, PBS ile doldurarak ve TEER'i ölçerek boşluğu ayarlayın.
    NOT: TEER ölçümleri için önerilen hacimler: 12 kuyulu plaka için (kuyuda 1900 μL ve ekte 900 μL). 24 kuyulu plaka için (kuyuda 750-1000 μL ve ekte 250 μL).
  4. ALI kültürlerinin ortamını oda sıcaklığında steril PBS ile değiştirin.
    NOT: Ortamı alt kuyudan ve ikinci adımda transwell ekinden çıkarın. Benzer şekilde, ALI kültürünün transwell membranından ayrılmasını önlemek için PBS'yi önce eke ve ardından alt kuyucuğa ekleyin.
  5. TEER metre elektrotlarını ALI kültürleri ile deney kuyularına yerleştirin ve TEER ölçümünügerçekleştirin 1.
    NOT: Ortam değiştirilmeden önce her iki günde bir TEER ölçümleri yapın.

6. Makromoleküler akı

  1. FITC-Dextran (3-5 kDa) stok çözeltisini çalışan 1 mg / mL konsantrasyona seyreltin.
    NOT: FITC-DEXTRAN'ı her zaman ışığa maruz kalmaktan koruyun.
  2. Okuma için standart olarak azalan FITC konsantrasyonuna (1000 μg/mL ila 0.25 μg/mL) sahip bir seyreltme sırası hazırlayın.
  3. Transwell'in üst bölmesine 500 μL FITC-dekstran çözeltisi (1 mg / mL) ve alt bölmeye 1.5 mL ortam (+/- ilgilenilen sitokin) ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin.
  4. İlgili zaman noktalarında alt bölmeden 120 μL ortam toplayın (örn. 0 dk, 15 dk, 30 dk, 60 dk, 90 dk, 120 dk, 150 dk ve 180 dk).
  5. Pipet, her zaman noktasının kopyalarını (50 μL/oyuk) siyah 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı bir plakaya dönüştürür.
  6. FITC-dekstran'ı 490 nm'de uyarın ve bir plaka okuyucu kullanarak emisyonu 520 nm dalga boyunda okuyun.
  7. Standarda göre makromoleküler akı miktarını hesaplayın.

Sonuçlar

Özofagus organoidleri, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile belgelendiği gibi, sağlanan protokolün talimatlarına göre hasta biyopsilerinden ekstrakte edilen birincil hücrelerden büyüyecektir (Şekil 1). Epitelyal ASC'ler, izole edilen hücreleri bazal membran ekstraktında tohumladıktan sonra kültürün ilk iki günü içinde kendi kendini organize eden bir şekilde hücre kümeleri oluşturmaya başlar ve bir iskele görevi görür. Ters çevrilmiş parlak alan mikrosk...

Tartışmalar

Sağlanan prosedürler, başarı olasılığı yüksek olan hasta kaynaklı organoidlerin ve ALI kültürlerinin yetiştirilmesine izin verir. Organoid protokolü, insan özofagus organoidlerinin26 oluşumunu bildiren ilk yayınlanan protokolden ve yakın zamanda yayınlanan bir protokolden32 uyarlanmıştır. Sherill ve meslektaşları ALI model22'yi tanımladılar. Organoidler ve ALI kültür modelleri, EoE 5,26

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

SNSF'nin J.H.N.'ye verdiği 310030_219210 no'lu hibe, bu el yazmasının herhangi bir kısıtlama olmaksızın yayınlanmasını destekledi. Şekil 1 , BioRender.com yardımıyla oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Referanslar

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler 3 Boyutlu H cre K lt rzofagus OrganoidleriHava S v Aray z K lt rleriEpitel BariyeriEozinofilik zofajitDoku HomeostazSitokinlerB y me Fakt rleriSinyal YolaklarTranskriptomProteomTransepitelyal DirenMakromolek l Ak s

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır