JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.

Аннотация

Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.

Введение

Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13. Наиболее часто встречающимися симптомами ЭоЭ у взрослого населения являются дисфагия и пищевая имперация14. У детей ЭоЭ обычно проявляется отставанием в росте, отказом от пищи, рвотой и болью в животе15. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили гены риска EoE, участвующие в целостности эпителиального барьера, переместив эпителий в центр исследований EoE 16,17,18. Транскриптомика EoE также показала, что нарушение процесса дифференцировки и гиперплазия реактивной базальной зоны вызывают нарушение барьерной функции эпителия пищевода 3,5,19,20,21,22. Раннее понимание того, что ЭоЭ является Th2-опосредованнымзаболеванием6, привело к открытию IL-13 в качестве движущего медиатора, нарушающего целостность эпителия 3,4,21,23. Экспериментальные системы, позволяющие препарировать цитокин-опосредованные эффекты на целостность эпителия от нарушения внутреннего барьера через генетическую предрасположенность, дают возможность изучить сложное взаимодействие между иммунными клетками и эпителием в ЭоЭ. Пищеводные органоиды человека и культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ) были предложены в качестве ценных инструментов для анализа влияния цитокиновой стимуляции на целостность эпителия5.

Первый протокол для получения взрослых тканеспецифических стволовых клеток (ASC) пищеводных органоидов был разработан через пять лет после первых опубликованных сообщений о кишечных органоидах в 2009 году с использованием кишечных Lgr5+ ASC, повторяющих эпителиальный компартмент тонкой кишки24. ДеВард и др. первыми получили органоиды из эпителиальных клеток пищевода мышей25. В 2018 году Kasagi et al. получили органоиды пищевода человека из иммортализованной клеточной линии плоского эпителия пищевода человека EPC2-hTERT и первичных клеток, полученных от пациента26. В том же году Zhang et al. успешно получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из органоидов пищевода. Они определили значение ингибирования TGFβ и костного морфогенетического белка (BMP) для развития клеток-предшественников пищевода (EPC) и решающую роль передачи сигналов Notch в дифференцировке стратифицированного плоского эпителия26,27. Трисно и его коллеги дополнили эти результаты, определив Sox2 в качестве ингибитора Wnt, который направляет судьбу развития в сторону дифференцировки пищевода. Последующее усовершенствование протоколов, состава среды и условий культивирования увеличило скорость образования органоидов и сделало возможным субкультивирование и восстановление органоидов после криоконсервации 26,29,30,31,32. Несмотря на то, что эти органоиды являются мощными инструментами для изучения архитектуры тканей и экспрессии потенциальных генов-мишеней после стимуляции цитокинами, органоиды пищевода не дают возможности измерить трансэпителиальную резистентность (TEER) или поток макромолекул в качестве прямых измерений целостности барьера. Как ранее было описано Шерриллом и коллегами22, культуры ALI, моделирующие дифференцировкуэпителия4, позволяют напрямую оценить целостность эпителия. Объединение органоидов, полученных от пациента, и культур ALI является мощным инструментом для исследования архитектуры тканей и целостности эпителиального барьера в EoE.

Ниже приведены процедуры с инструкциями по выделению жизнеспособных клеток из биопсии пищевода и созданию органоидов пищевода и культур ОПЛ, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения влияния цитокинов на целостность барьера.

протокол

Процедуры были одобрены комитетом по этике Северо-Западной и Центральной Швейцарии (EKNZ; Идентификатор проекта 2019-00273). Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на экспериментальное использование биопсии до проведения эндоскопического исследования. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выделение клеток для органоидов пищевода, полученных от пациента

Примечание: Список составляющих среды для культивирования органоидов пищевода человека приведен в таблице 1.

  1. Получите биопсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании две биопсии из одного сегмента пищевода получены во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием биопсийных щипцов с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм.
  2. Перенос биопсии в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия может храниться на льду в течение нескольких часов до использования.
  3. Замените среду KSFM 1 мл Dispase I (10 Ед/мл) и инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  5. Аспирируйте диспазу с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.
  6. Промойте биопсию 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
  7. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  8. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.
  9. Биопсию инкубируют с 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут, встряхивая при 800 об/мин.
  10. Выполняйте механическое разрушение путем многократного пипетирования вверх и вниз до получения одноклеточной суспензии.
  11. Отфильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 70 мкм с помощью резиновой головки поршня туберкулинового шприца.
  12. Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл).
  13. Отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр 35 μм с защелкивающейся крышкой на полистирольной трубке объемом 5 мл с круглым дном.
  14. Переложите раствор одиночных клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.
  15. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  16. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.
  17. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл среды КСФМ.
  18. Смешайте 10 μL трипанового синего с 10 μL клеточной суспензии.
  19. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.

2. Культура органоидов, полученных от пациента

  1. Добавьте 1-2 мл КСФМ в клеточную суспензию после подсчета.
  2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл, не повреждая клеточную гранулу.
  4. Ресуспендируйте клеточную гранулу в гидрогелевой матрице экстракта базальной мембраны (BME) (40 μL BME на 20 000 клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления BME держите клетки на льду, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание BME.
  5. Отрежьте наконечник пипетки объемом 200 мкл, чтобы аспирировать вязкую смесь суспензии BME-клеток.
  6. Сформируйте капли объемом 40 мкл в предварительно нагретой (37 °C) суспензионной клеточной культуральной тарелке.
  7. Инкубируйте планшет без среды в течение 20-30 минут при 37 °C для обеспечения затвердевания капель BME.
  8. Добавьте предварительно подогретую среду КСФМ-С с добавлением 10 мкМ Y27632 (ингибитор ROCK) в течение первых двух дней посева.
  9. Заменяйте среду на новую среду KSFM-C (без интересующего Y27632 и +/- цитокина) через день.
  10. Отсадите среду и соскребите капли с помощью наконечника пипетки, непрерывно добавляя в лунку 1 мл Dispase II (1,5 Ед/мл).
  11. Перелейте смесь BME-dispase в центрифужную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте ее в течение 20 минут при 37 °C на водяной бане для расщепления BME.
  12. Центрифугируйте при 250 x g в течение 3 мин при 4 °C и аспирируйте Dispase II.
  13. Действуйте в соответствии с протоколом интересующего вас считывания (например, выделение РНК, выделение белка или фиксация 4% PFA для гистологии).

3. Выделение клеток для культур воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)

  1. Получите биопсию. Во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм берутся две биопсии из одного сегмента пищевода с помощью биопсийных щипцов.
  2. Поместите биопсию в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) и хранить на льду в течение нескольких часов до использования.
  3. Замените КСФМ на 1 мл диспазы (10 Ед/мл). После этого инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  5. Удалите Dispase с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.
  6. Промойте биопсию 1 мл DPBS.
  7. При комнатной температуре биопсию можно замедлить при 300 x g в течение 2 минут.
  8. Отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
  9. Инкубируйте биопсию в 500 мкл Trypsin-EDTA (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут и непрерывно перемешивайте при 800 об/мин во время инкубации.
  10. Механическое прерывание биопсии с помощью повторяющегося пипетирования вверх и вниз до получения суспензии одиночных клеток.
  11. Пропустите диссоциированные клетки через клеточный фильтр 70 мкм с резиновой головкой поршня из туберкулинового шприца и соберите клетки в коническую трубку объемом 50 мл.
  12. Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл), чтобы удалить оставшиеся клетки из ситечка.
  13. Отфильтруйте ячейки с помощью защелкивающегося колпачка из сетчатого фильтра 35 мкм в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
  14. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
  15. Центрифуга при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  16. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.
  17. Ресуспендировать клеточную таблетку в 4 мл среды КСФМ (Ca2+ 0,09 мМ), в том числе 10 мкМ Y27632.
  18. Перенесите клетки в колбу для клеточных культур T25.
  19. Чтобы увеличить первичные кератиноциты, культивируйте клетки до слияния 60%-80% в течение примерно 1 недели.
    Примечание: Пассаж (P)0 образует островковые клеточные конгломераты и не является монослоем. Первичные кератиноциты образуют монослои, начиная с P1.
  20. Пассаж при конфлюенции 60%-80% и повторный посев P1 в 2-3 колбы T25 или 1-2 колбы с клеточными культурами T75.
  21. Пассаж Р1 снова, когда кератиноциты образуют монослой с конфлюенсацией 60%-80%.

4. Культура воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)

  1. Посев первичных кератиноцитов P2 на трансвелловые вкладыши для культуры ALI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Засейте 400 000 клеток в 12 луночных вставок (200 000 кератиноцитов на 0,6 см2) в 500 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    1. Засемените 150 000 клеток в 24 луночные вставки (155 000 кератиноцитов на 0,5 см2) в 100 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    2. В качестве альтернативы можно заморозить в среде KSFM (Ca2 + 0,09 мМ + 10% ДМСО) при температуре -80 °C в течение 24 часов, а затем перенести замороженные элементы в жидкий азот для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании замороженных флаконов проведите еще раз после размораживания перед использованием клеток для культуры ALI.
  2. Добавьте среду в нижнюю лунку под вставкой транслуночной питательной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 12-луночных планшетов: 1,5 мл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE). Для 24-луночных планшетов: 600 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
  3. Замените KSFM со средним и высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) через 2 дня.
  4. Меняйте среду с высоким содержанием кальция КСФМ через день до 7 дня.
  5. На 7-й день выполните эрлифтинг, отасунув среду из верхней камеры и заменив среду в нижней камере на KSFM с высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE), содержащим 10 нг/мл KGF (=FGF7), 75 мкг/мл аскорбиновой кислоты (АК).
    1. Необязательно: Добавьте в среду интересующий цитокин в желаемой концентрации.
  6. Меняйте носитель каждый второй день до 14 дня.

5. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)

  1. Простерилизовать электрод измерителя TEER, погрузив его в лунку 24-луночного планшета с 5% гипохлоритом натрия на 10-15 мин.
  2. Смойте 5% гипохлорит натрия, погрузив электрод в 4 последовательные лунки со стерильным ddH,2O и дав электроду высохнуть на воздухе.
  3. Установите заготовку, поместив один электрод в лунку, а второй электрод в транслунную вставку, заполнив ее PBS и измерив TEER.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые объемы для измерений TEER: Для планшета с 12 лунками (1900 μL в лунке и 900 μL во вкладыше). Для 24-луночного планшета (750-1000 μL в лунке и 250 μL во вкладыше).
  4. Замените среду культур ALI стерильной PBS комнатной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите среду из нижнего луночного отверстия и, на втором этапе, из вкладыша через колодец. Аналогичным образом добавьте PBS сначала во вкладыш, а затем в нижнюю лунку, чтобы предотвратить отслоение культуры ALI от трансвелловой мембраны.
  5. Поместите электроды счетчика TEER в экспериментальные лунки с культурами ALI и выполните измерение TEER1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте измерения TEER каждые два дня перед сменой среды.

6. Макромолекулярный поток

  1. Разбавить исходный раствор ФИТК-декстрана (3-5 кДа) до рабочей концентрации 1 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда защищайте FITC-Dextran от воздействия света.
  2. Подготовьте ряд для разбавления с уменьшающейся концентрацией FITC (от 1000 мкг/мл до 0,25 мкг/мл) в качестве стандарта для считывания.
  3. Добавьте 500 мкл раствора FITC-декстрана (1 мг/мл) в верхнюю камеру трансвелла и 1,5 мл среды (+/- интересующий цитокин) в нижний отсек и поместите планшет в инкубатор.
  4. Соберите 120 мкл среды из нижнего отсека в соответствующие моменты времени (например, 0 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин и 180 мин).
  5. Пипетка дублирует (50 мкл/лунку) каждого временного момента в черную 96-луночную прозрачную пластину с плоским дном.
  6. Возбуждайте FITC-декстран на длине волны 490 нм и считывайте излучение на длине волны 520 нм с помощью считывателя пластин.
  7. Рассчитайте количество потока высокомолекулярных соединений в соответствии со стандартом.

Результаты

Органоиды пищевода будут расти из первичных клеток, извлеченных из биопсии пациента в соответствии с инструкциями предоставленного протокола, как задокументировано с помощью инвертированного светлопольного микроскопа (Рисунок 1). Эпителиальные ASC начинают образовыва...

Обсуждение

Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Ссылки

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены