Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.

Einleitung

Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere ^1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre^{6, beobachtet} wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben ^7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert.

Protokoll

Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle Patienten gaben vor der endoskopischen Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung für den experimentellen Einsatz von Biopsien ab. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellisolierung von patienteneigenen Organoiden der Speiseröhre

ANMERKUNG: Eine Liste der Bestandteile des Mediums für die Kultivierung humaner Organoide der Speiseröhre ist in Tabelle 1 enthalten.

1. Besorge di....

Diskussion

Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet²⁶, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll³² angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell²² beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstüt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254