JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بعض الطرق المعمول بها لتحديد إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) وتنشيط استجابة البروتين غير المطوية (UPR) ، مع التركيز بشكل خاص على عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1. تصف هذه المقالة أيضا مجموعة من البروتوكولات للتحقيق في تأثير إجهاد ER / الاستعراض الدوري الشامل على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1 وعدوى الفيروسات.

Abstract

يمكن أن تسبب العدوى الفيروسية إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) بسبب تراكم البروتين غير الطبيعي ، مما يؤدي إلى استجابة البروتين غير المطوية (UPR). طورت الفيروسات استراتيجيات للتلاعب بالاستعراض الدوري الشامل المضيف ، ولكن هناك نقص في الفهم التفصيلي لتعديل الاستعراض الدوري الشامل وأهميته الوظيفية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في الأدبيات. في هذا السياق ، تصف المقالة الحالية البروتوكولات المستخدمة في مختبرنا لقياس مستويات إجهاد ER و UPR أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الخلايا التائية وتأثير الاستعراض الدوري الشامل على تكاثر الفيروس والعدوى.

تلطيخ Thioflavin T (ThT) هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن إجهاد ER في الخلايا عن طريق الكشف عن مجاميع البروتين. هنا ، أوضحنا بروتوكول تلطيخ ThT في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 للكشف عن إجهاد ER وقياسه. علاوة على ذلك ، تم الكشف عن إجهاد ER أيضا بشكل غير مباشر عن طريق قياس مستويات علامات الاستعراض الدوري الشامل مثل BiP و IRE1 المفسفرة و PERK و eIF2α وربط XBP1 وانقسام ATF6 و ATF4 و CHOP و GADD34 في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، باستخدام النشاف المناعي التقليدي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-PCR). لقد وجدنا أن مضان ThT يرتبط بمؤشرات تنشيط الاستعراض الدوري الشامل. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولات تحليل تأثير إجهاد ER وتعديل الاستعراض الدوري الشامل على تكرار HIV-1 عن طريق تجارب ضربة قاضية وكذلك استخدام الجزيئات الدوائية. تم تحليل تأثير الاستعراض الدوري الشامل على التعبير الجيني / التكاثر الجيني لفيروس العوز المناعي البشري -1 وإنتاج الفيروس بواسطة فحوصات مراسل Luciferase والتقاط مستضد p24 ELISA ، على التوالي ، في حين تم تحليل التأثير على عدوى virion عن طريق تلطيخ خلايا المراسل المصابة. بشكل جماعي ، توفر هذه المجموعة من الأساليب فهما شاملا لمسارات استجابة البروتين غير المطوية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، مما يكشف عن ديناميكياتها المعقدة.

Introduction

تتميز متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) بانخفاض تدريجي في عدد الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + ، مما يؤدي إلى الفشل التدريجي للاستجابة المناعية. فيروس نقص المناعة البشرية -1 (HIV-1) هو العامل المسبب للإيدز. إنه فيروس RNA مغلف ، إيجابي ، مفرد تقطعت به السبل مع نسختين من الحمض النووي الريبي لكل virion وينتمي إلى عائلة retroviridae. إن إنتاج تركيزات عالية من البروتينات الفيروسية داخل الخلية المضيفة يضع ضغطا مفرطا على آلية طي البروتين في الخلية1. ER هو المقصورة الأولى في المسار الإفرازي للخلايا حقيقية النواة. وهي مسؤولة عن إنتاج وتغيير وتوصيل البروتينات إلى المسار الإفرازي والمواقع المستهدفة الفضائية خارج الخلية. تخضع البروتينات للعديد من التغييرات بعد الترجمة وتطوى في شكلها الطبيعي في ER ، بما في ذلك الجليكوزيل المرتبط بالهليون وإنشاء روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئاتوبين الجزيئات 2. لذلك ، توجد تركيزات عالية من البروتينات في تجويف ER وهي عرضة جدا للتجميع والاختلال. تؤدي الحالات الفسيولوجية المختلفة ، مثل الصدمة الحرارية أو العدوى الميكروبية أو الفيروسية ، والتي تتطلب تخليقا محسنا للبروتين أو طفرة في البروتين ، إلى إجهاد ER بسبب زيادة تراكم البروتين في ER ، مما يزعج توازن تجويف ER. ينشط إجهاد ER شبكة من مسارات نقل الإشارات التكيفية المحفوظة للغاية ، استجابة البروتين غير المطوية (UPR) 3. يتم استخدام الاستعراض الدوري الشامل لإعادة الحالة الفسيولوجية الطبيعية للطوارئ من خلال مواءمة عبء البروتين غير المطوي وقدرته على الطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زيادة حجم ER والمرافقين الجزيئيين المقيمين في ER والطيات ، مما يؤدي إلى ارتفاع قدرة طي ER. يقلل الاستعراض الدوري الشامل أيضا من حمل البروتين في ER من خلال التوهين العالمي لتخليق البروتين على المستوى الانتقالي ويزيد من إزالة البروتينات غير المطوية من ER عن طريق تنظيم التحلل المرتبط ب ER (ERAD)4,5.

يتم استشعار إجهاد ER بواسطة ثلاثة بروتينات عبر غشائية مقيمة في ER: بروتين كيناز R (PKR) الشبيه بالشبكة الإندوبلازمية كيناز (PERK) ، وتنشيط عامل النسخ 6 (ATF6) ، والإنزيم الذي يتطلب الإينوزيتول من النوع 1 (IRE1). يتم الاحتفاظ بجميع هذه المستجيبات غير نشطة عن طريق الارتباط بعائلة بروتين الصدمة الحرارية Chaperone A (Hsp70) العضو 5 (HSPA5) ، المعروف أيضا باسم البروتين المرتبط (BiP) / 78-kDa البروتين المنظم للجلوكوز (GRP78). عند إجهاد ER وتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، ينفصل HSPA5 ويؤدي إلى تنشيط هذه المستجيبات ، والتي تنشط بعد ذلك سلسلة من الأهداف النهائية التي تساعد في حل إجهاد ER ، وفي الظروف القاسية ، تعزز موت الخلايا6. عند الانفصال عن HSPA5 ، يتم تنشيط PERK autophosphorylates ، ونشاط الكيناز7. نشاط الكيناز يفسفر eIF2α ، مما يؤدي إلى التوهين الانتقالي ، مما يقلل من حمل البروتين في ER8. ومع ذلك ، في وجود عامل بدء الفوسفو حقيقي النواة 2α (eIF2α) ، تصبح إطارات القراءة المفتوحة غير المترجمة على mRNAs محددة مترجمة بشكل تفضيلي ، مثل ATF4 ، الذي ينظم الجينات التي يسببها الإجهاد. ATF4 و C / EBP البروتين المتماثل (CHOP) هي عوامل النسخ التي تنظم الجينات التي يسببها الإجهاد وتنظم موت الخلايا المبرمج ومسارات موت الخلايا 9,10. أحد أهداف ATF4 و CHOP هو توقف النمو والبروتين المسبب لتلف الحمض النووي (GADD34) ، والذي ، جنبا إلى جنب مع بروتين الفوسفاتيز 1 dephosphorylate peIF2α ويعمل كمنظم تغذية مرتدة للتوهين الانتقالي11. تحت ضغط ER ، ينفصل ATF6 عن HSPA5 ، وتتعرض إشارة توطين Golgi الخاصة به ، مما يؤدي إلى نقلها إلى جهاز Golgi. في جهاز جولجي ، يتم شق ATF6 بواسطة بروتياز الموقع 1 (S1P) وبروتياز الموقع 2 (S2P) لإطلاق الشكل المشقوق من ATF6 (ATF6 P50). ثم يتم نقل ATF6 p50 إلى النواة ، حيث يحفز التعبير عن الجينات المشاركة في طي البروتين ونضجه وإفرازه بالإضافة إلى تدهور البروتين12,13. أثناء إجهاد ER ، ينفصل IRE1 عن HSPA5 ، ومتعدد الميمرات ، والفسفرة التلقائية14. تنشط فسفرة IRE1 مجال RNase الخاص بها ، وتحديدا تتوسط في ربط 26 نيوكليوتيدات من الجزء المركزي من mRNA لبروتين ربط X-box 1 (XBP1) 15,16. هذا يولد نهاية C جديدة تمنح وظيفة التنشيط ، وتوليد بروتين XBP1s وظيفي ، وهو عامل نسخ قوي يتحكم في العديد من الجينات التي يسببها الإجهاد ER17,18. يعمل النشاط المشترك لعوامل النسخ هذه على تشغيل البرامج الجينية التي تهدف إلى استعادة توازن ER.

هناك طرق مختلفة للكشف عن إجهاد ER و UPR. وتشمل هذه الطرق التقليدية لتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل19,20. تشمل الطرق غير التقليدية المختلفة قياس حالة الأكسدة والاختزال للاستعراض الدوري الشامل وتوزيع الكالسيوم في تجويف ER بالإضافة إلى تقييم هيكل ER. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني لمعرفة مدى تضخم تجويف ER استجابة لإجهاد ER في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وتعتمد على توفر المجهر الإلكتروني ، والذي قد لا يكون متاحا لكل مجموعة بحثية. أيضا ، يعد قياس تدفق الكالسيوم وحالة الأكسدة والاختزال في ER أمرا صعبا بسبب توفر الكواشف. علاوة على ذلك ، فإن قراءات هذه التجارب حساسة للغاية وقد تتأثر بعوامل أخرى من التمثيل الغذائي الخلوي.

تتمثل إحدى التقنيات القوية والبسيطة لرصد مخرجات الاستعراض الدوري الشامل في قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل وقد استخدمت لعقود في سيناريوهات إجهاد مختلفة. هذه الطرق التقليدية لقياس تفعيل الاستعراض الدوري الشامل اقتصادية ومجدية وتوفر المعلومات في وقت أقل مقارنة بالطرق الأخرى المعروفة. وتشمل هذه المناعية لقياس التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل على مستوى البروتين ، مثل فسفرة IRE1 و PERK و eIF2α وانقسام ATF6 عن طريق قياس شكل P50 من ATF6 وتعبير البروتين لعلامات أخرى مثل HSPA5 و XBP1 المقسم و ATF4 و CHOP و GADD34 بالإضافة إلى RT-PCR لتحديد مستويات mRNA وكذلك ربط XBP1 mRNA.

توضح هذه المقالة مجموعة من البروتوكولات التي تم التحقق من صحتها وموثوق بها لمراقبة إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل في الخلايا المصابة بفيروس HIV-1 ولتحديد الأهمية الوظيفية للاستعراض الدوري الشامل في تكرار HIV-1 والعدوى. تستخدم البروتوكولات الكواشف المتاحة بسهولة وكذلك الكواشف الاقتصادية وتوفر معلومات مقنعة حول مخرجات الاستعراض الدوري الشامل. إجهاد ER هو نتيجة لتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، والتي تكون عرضة لتشكيل مجاميع البروتين21. نصف هنا طريقة للكشف عن تجمعات البروتين هذه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. تلطيخ Thioflavin T هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن هذه المجاميع البروتينية وقياسها22. وصف بيريولت وويرستوك هذه التقنية للكشف عن مجاميع البروتين وقياسها ، وبالتالي مستويات إجهاد ER في الخلايا الحية. لقد ثبت أن جزيء الفلورسنت الصغير ثيوفلافين T (ThT) يرتبط بشكل انتقائي بمجاميع البروتين ، وخاصة ألياف الأميلويد.

في هذه المقالة ، نصف استخدام ThT للكشف عن إجهاد ER وقياسه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 وربطه بالطريقة التقليدية لمراقبة الاستعراض الدوري الشامل عن طريق قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل.

نظرا لوجود نقص في المعلومات الشاملة المتعلقة بدور الاستعراض الدوري الشامل أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، فإننا نقدم مجموعة من البروتوكولات لفهم دور الاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 وعدوى الفيروسات. تشمل هذه البروتوكولات ضربة قاضية بوساطة فيروس العدس لعلامات الاستعراض الدوري الشامل بالإضافة إلى العلاج بمحفزات الإجهاد ER الدوائية. توضح هذه المقالة أيضا أنواع القراءات التي يمكن استخدامها لقياس التعبير الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، والإنتاج الفيروسي بالإضافة إلى عدوى الفيروسات المنتجة ، مثل مقايسة لوسيفيراز القائمة على التكرار الطرفي الطويل (LTR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم p24 (ELISA) ومقايسة تلطيخ مراسل β جالون على التوالي.

باستخدام غالبية هذه البروتوكولات ، أبلغنا مؤخرا عن الآثار الوظيفية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 على الاستعراض الدوري الشامل في الخلاياالتائية 23 ، وتشير نتائج تلك المقالة إلى موثوقية الطرق الموضحة هنا. وبالتالي ، توفر هذه المقالة مجموعة من الطرق للحصول على معلومات شاملة بشأن تفاعل HIV-1 مع إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل.

Protocol

ملاحظة: خطوط الخلايا المستخدمة هنا هي HEK-293T و Jurkat J6 (خط خلية CD4 + T) ، والتي تم الحصول عليها من مستودع الخلايا ، NCCS ، بيون ، الهند ؛ تم الحصول على TZM-bl ، وهو خط خلايا مشتق من HeLa يحتوي على نسخ متكاملة من جينات β-galactosidase و luciferase تحت مروج التكرار الطرفي الطويل لفيروس نقص المناعة البشرية -1 (LTR)24 و CEM-GFP (خط خلية مراسل CD4 + T آخر) 25 من مستودع الإيدز NIH ، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. إعداد مخزون فيروس العوز المناعي البشري -1 وتخزينه

  1. إعداد مخزون فيروس العوز المناعي البشري -1
    ملاحظة: ينصح بممارسة المبادئ التوجيهية الدولية المتعلقة بالسلامة الأحيائية على النحو المتاح في دليل منظمة الصحة العالمية (WHO) أو مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) في جميع التجارب التي تنطوي على HIV-1. يجب أن يتم التعامل مع الفيروس وأي تجربة مع الفيروس الحي فقط في خزانة السلامة البيولوجية المناسبة الموجودة في مختبر احتواء على مستوى BSL2 على الأقل. يتم وصف إنتاج جزيئات فيروس العوز المناعي البشري -1 المعدية باستخدام مجموعة نقل فوسفات الكالسيوم في الثدييات في هذا الجزء من البروتوكول.
    1. بذور خلايا HEK-293T في أطباق 90 مم مع 10 مل كاملة (تستكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) في خزانة السلامة الحيوية من النوع الثاني A2 واحتفظ بها لمدة 12 ساعة تقريبا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية بحيث يكون التقاء الخلايا بين 50٪ -60٪.
    2. في اليوم التالي ، اصنع مزيج النقل: قم بإعداد المحلول A الذي يحتوي على 25 ميكروغرام من pNL4.3 (استنساخ جزيئي لفيروس نقص المناعة البشرية -1) الحمض النووي البلازميد في محلول معقم ، 86.8 ميكرولتر من 2 M CaCl2 ، والماء المعقم المتبقي لجعل الحجم النهائي 700 ميكرولتر لكل لوحة. تحضير محلول B يحتوي على 700 ميكرولتر من 2x محلول ملحي مخزن HEPES (HBS) للوحة 1. ثم اضبط الحساب لإجمالي عدد اللوحات.
    3. أضف الآن الحل B إلى الحل A بطريقة قطرة مع الدوامة المستمرة للحل A. يصبح الحجم الكلي لمزيج النقل الآن 1.4 مل للوحي الواحد.
      ملاحظة: تؤدي الإضافة الدقيقة للمحلول B إلى المحلول A بينما تؤدي الدوامة المستمرة إلى تكوين مجمعات نقل مثالية.
    4. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الخليط ببطء إلى كل طبق يحتوي على 9 مل طازجة من DMEM الكامل وانقل الألواح إلى حاضنة CO2 . بعد 8-10 ساعات ، قم بتغيير الوسائط الحالية ب 10 مل جديدة من DMEM الكامل.
    5. بعد 24 ساعة من تغيير الوسائط ، اجمع المادة الطافية (التي تحتوي على جزيئات الفيروس) من جميع اللوحات في أنابيب مخروطية. أجهزة طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي منضدية منخفض السرعة (جدول المواد) لإزالة حطام الخلية.
    6. انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق polyallomer وضعها في الدوار المتأرجح لجهاز الطرد المركزي الفائق (جدول المواد). تحقق من أوزان حاملات الأنابيب للتأكد من توازنها واضبطها باستخدام وسيط معقم إذا لزم الأمر.
    7. أجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 1،41،000 × جم لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، أخرج الأنابيب بعناية وصب المادة الطافية ببطء داخل خزانة السلامة الحيوية.
    8. إلى الحبيبات (وهو الفيروس المركز الآن) في كل أنبوب ، أضف 1 مل من متوسط RPMI غير المكتمل (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 وقم بسحب قوي لإزاحة الحبيبات.
      ملاحظة: الحبيبات بعد أجهزة الطرد المركزي الفائقة تكاد تكون غير مرئية للعين المجردة. لذلك ، يجب التأكد من إضافة RPMI 1640 في منتصف الأنبوب حتى يتم إزاحة الحبيبات بشكل صحيح.
    9. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من 1 M HEPES pH 7.4 إلى 1 مل من تعليق الفيروس. Aliquot 50 ميكرولتر من التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية على الفور للتخزين على المدى الطويل.
  2. القياس الكمي لتركيز الفيروس وعدوى الفيروس
    ملاحظة: لحساب عدوى الفيروس ، من الضروري أولا تحديد تركيزه ، والذي يتم بواسطة p24 Antigen Capture ELISA (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وبالتالي لا يتم وصفه هنا ؛ انظر جدول المواد). تعطي هذه العملية تركيز الفيروس بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) من المخزون ، والذي يستخدم بعد ذلك لتحديد رقم virion المعدي في المخزون من خلال التجربة التالية في خلايا مراسل TZM-bl26.
    1. عد وبذر 0.1 × 106 خلايا TZM-bl في صفيحة بئر 24 باستخدام 500 ميكرولتر من DMEM الكامل لكل بئر واحتفظ بها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10-12 ساعة.
    2. تأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 50٪ -60٪ قبل البدء في الإصابة بكمية الفيروس. قم بتغيير الوسائط الموجودة باستخدام 250 ميكرولتر من DMEM الكامل الجديد لكل بئر.
      ملاحظة: حافظ على تحكم إيجابي جيدا لاستبعاد أي خطأ تجريبي.
    3. احسب كمية فيروس المخزون اللازمة للعدوى من 1 نانوغرام و 0.1 نانوغرام و 0.01 نانوغرام في التكرارات. أضف الكمية المناسبة من الفيروس إلى الآبار واحتفظ باللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    4. اغسل الخلايا مرتين ب 500 ميكرولتر من DMEM غير المكتمل ثم أضف 500 ميكرولتر من DMEM الكامل.
    5. تابع إجراء تلطيخ β جالون بعد 36 ساعة من تغيير الوسائط.
      1. تخلص من الوسائط الموجودة واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإصلاح الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول التثبيت (0.25٪ جلوتارالدهيد في PBS) إلى كل بئر واحتضانها في RT داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 5-7 دقائق.
      2. تحضير محلول تلطيخ كما هو موضح في الجدول 1. احفظه بعيدا عن الضوء لأن X-gal حساس للضوء.
      3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. قم بتراكب الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول التلوين الطازج واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 2-18 ساعة.
      4. لإيقاف التفاعل بعد ذلك ، اشطف الخلايا ب 500 ميكرولتر من 3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في PBS مرتين ثم احتفظ بالخلايا في 500 ميكرولتر من PBS الطازج.
      5. عد الخلايا المصابة باللون الأزرق (كما هو موضح في الشكل 1 أ) تحت المجهر بتكبير 10x ل 5 حقول عشوائية. خذ متوسط عدد الحقول ال 5 واضربه في عامل المجال وعامل التخفيف. هذا يحدد جزيئات virion المعدية في مخزون الفيروس.
        ملاحظة: بالنسبة للوحة 24 بئر ، يكون عامل المجال هو 75.
مكوناتاعدادالحجم المطلوب
برنامج تلفزيونيقم بإعداد 1x PBS من مخزون 10x PBS14 مل
البوتاسيوم فيري فيرو سيانيدقم بإذابة 0.82 جم من فيريسيانيد البوتاسيوم و 1.06 جم من فيروسيانيد البوتاسيوم في 25 مل من 1x PBS0.75 مل
كلوريد المغنيسيوم1 م في 1 مل من 1x PBS15 ميكرولتر
إكس غاليذوب 30 مجم في 0.6 مل من N، N-dimethyl formamide (في الظلام)0.3 مل
المجموع = 15 مل

الجدول 1: قائمة المكونات المطلوبة لتلطيخ β غال في خلايا TZM-bl.

2. عدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1 من خطوط الخلايا التائية

  1. ذوبان الجليد وثقافة خط الخلايا التائية الخالدة. استخدمت هذه الدراسة خط خلايا CEM-GFP المزروع في وسط RPMI 1640 الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، و 500 ميكروغرام / مل G418.
  2. عد وخذ 2 مليون خلية لكل نقطة زمنية (غير مصابة ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، 72 ساعة ، و 96 ساعة). احصد الخلايا غير المصابة على الفور عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وأضف محلول تحلل الخلية (50 مللي متر Tris-HCl pH 7.4 ، 0.12 M NaCl ، 5 mM EDTA ، 0.5٪ NP40 ، 0.5 mM NaF ، 1 mM DTT) ، مع استكمال كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني ، 0.5 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ومثبط فوسفاتيز واحد (50 ميكرولتر ل 1-3 مليون خلية) أو التحلل في كاشف Trizol (1 مل ل 1-3 مليون خلية) لعزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على بوليبرين (5 ميكروغرام / مل) عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الكامل.
    ملاحظة: Polybrene هو بوليمر كاتيوني يستخدم لتعزيز العدوى الفيروسية القهقرية في خلايا الثدييات.
  4. إعادة تعليق 8 ملايين خلية في 1 مل من البوليبرين تحتوي على وسط كامل. الآن احسب حجم المخزون الفيروسي المطلوب ل 4 ملايين جسيم فيريون ، وأضف مخزون الفيروس ، وشكل الحجم الإجمالي إلى 2 مل عن طريق إضافة وسائط كاملة. هذا يجعلها MOI من 0.5.
  5. احتفظ بالخلايا داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، مع النقر المتقطع كل 30-45 دقيقة.
  6. بعد 4 ساعات ، قم بتدوير الخلايا وتخلص من المادة الطافية بعناية داخل خزانة السلامة البيولوجية بطرق التخلص المناسبة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بطرد الخلايا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  7. اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من الوسط غير المكتمل. أعد تعليق الخلايا في 8 مل من الوسط الكامل ، مما يجعلها 1 مليون خلية / مل.
  8. في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار ، قم بزرع عدد متساو من الخلايا في العدد المطلوب من الآبار واحتفظ بالصفيحة في حاضنة CO2 التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية.
  9. لمدة 4 أيام القادمة ، احصد الخلايا كل 24 ساعة عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحلل الخلية. أيضا ، اجمع المادة الطافية وانقلها على الفور إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
  10. للتحقق مما إذا كانت العدوى قد حدثت ، تابع التقاط مستضد p24 ELISA لجميع النقاط الزمنية. قم بإجراء التخفيفات المناسبة للنقاط الزمنية ، أي تخفيف أقل للنقاط الزمنية الأولية وأعلى للنقاط اللاحقة التي تتراوح من 1:50 إلى 1:500. ارسم القراءات في رسم بياني يصور تطور العدوى (الشكل 1 ب).

3. تلطيخ ثيوفلافين T لتحديد إجهاد ER

  1. إصلاح 1 مليون خلية غير مصابة و 0.5 خلية مصابة ب CEM-GFP (تؤخذ 72 ساعة من الخلايا المصابة) مع 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT.
  2. قم برش الخلايا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وعالج ب 500 ميكرولتر من 0.1 متر جليكاين لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالغسيل ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS.
  3. قم بتجميع الشرائح الزجاجية وبطاقات الترشيح وغرف العينات. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها إلى غرف العينة وقم بتدوير الخلايا عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق للصق الخلايا بالشرائح في جهاز طرد مركزي خلوي (جدول المواد).
    ملاحظة: لن يكون هناك ما يكفي من الخلايا التي يتم تجميدها على الشريحة بعد الطرد المركزي للطرد المركزي الخلوي إذا كان تعليق الخلية مخففا جدا. من المحتمل أن تتجمع الخلايا ويتم توزيعها بشكل سيئ بعد جهاز الطرد المركزي الخلوي ، إذا كان تعليق الخلية شديد التركيز.
  4. قم بتخلل الخلايا لمدة 10 دقائق باستخدام قطرات من 0.1٪ Triton-X-100 في PBS (يكفي لتغطية المنطقة التي التصقت بها الخلايا) وغسل الخلايا مرتين عن طريق وضع برنامج تلفزيوني قطرة ومسح PBS بالأنسجة عن طريق إمالة الشريحة.
  5. احتضان الخلايا مع 10 ميكرولتر من 5 ميكرومتر ثيوفلافين T لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لا تغسل بعد الحضانة مع ThT.
  6. قم بتركيب الشرائح باستخدام 5 ميكرولتر من وسائط التركيب (80٪ جلسرين v / v ، 20٪ PBS v / v ، و 8 مجم / مل 1،4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان [DABCO]) ، ضع غطاء الغطاء وأغلق غطاء الغطاء باستخدام طلاء الأظافر. اترك الشرائح حتى تجف.
    ملاحظة: في كل هذه الخطوات ، تأكد من أن الخلايا لا تجف.
  7. التقط صورا متحدة البؤر للخلايا الثابتة باستخدام عدسة غمر الجلسرين 63x على مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). اضبط إعدادات الإثارة والانبعاثات التالية: GFP (على سبيل المثال 494 نانومتر ، Em. 519 نانومتر) و ThT (على سبيل المثال 458 نانومتر ، Em. 480-520 نانومتر).
    ملاحظة: يجب تصوير كل قناة فلورية بالتتابع ، بدلا من تصويرها في وقت واحد ، لتجنب تداخل القنوات. تم أخذ GFP كمؤشر على الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 حيث أن خلايا CEM-GFP لديها GFP تحت تنظيم مروج LTR ، والذي يطلق النار على عدوى HIV-125.
  8. قم بتحويل صور الفلورسنت إلى 8 بت قبل القياس الكمي عن طريق تحليل العتبة. حدد كثافة كل خلية يدويا باستخدام برنامج مثل Image J (~ 50 خلية) 27. ارسم الرسم البياني بكثافة كل خلية كنقاط على المحور Y مقابل المعايير غير المصابة والمصابة.
  9. لإثبات فعالية هذا البروتوكول ، خذ تحكما إيجابيا ، على سبيل المثال ، علاج Thapsigargin (محفز الإجهاد ER المعروف) في هذه الحالة28. عالج مليون خلية CEM-GFP ، كل منها يحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO (التحكم في السيارة) و 100 نانومتر من Thapsigargin لمدة 12 ساعة.
  10. حصاد الخلايا وعملية تلطيخ ThT كما هو مذكور للعينات المصابة (الخطوات 3.1-3.8).
    ملاحظة: بالنسبة لهذه العينات، لا يلزم مضان GFP. وبالتالي ، يتم التقاط مضان ThT فقط في الفحص المجهري متحد البؤر.

4. تحديد تفعيل والتعبير عن مختلف علامات الاستعراض الدوري الشامل

ملاحظة: لتحديد التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل يتم استخدام طريقتين: النشاف المناعي و RT-PCR. بالنسبة للنشاف المناعي ، احصد 0.5 خلية مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 من MOI في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة (24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة) وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول التحلل (كما هو مذكور في الخطوة 2.2). بالتناوب ، بالنسبة ل RT-PCR ، يتم تحليل كريات الخلايا في كاشف Trizol (1 مل لكل 1-3 مليون خلية) (انظر جدول المواد). يمكن تخزين الخلايا المعاد تعليقها في محلول التحلل وكاشف Trizol عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

  1. النشاف المناعي لتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل.
    1. احتفظ بالخلايا المعاد تعليقها في مخزن التحلل على الثلج لمدة 45 دقيقة مع الخلط المتقطع باستخدام دوامة.
    2. قم بإنزال الخلايا عند 18000 × جم لمدة 15 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة على الطاولة (انظر جدول المواد). جمع طاف في أنبوب جديد.
    3. حدد تركيز البروتين في كل عينة باستخدام برادفورد أو كاشف مشابه.
    4. خذ تركيزا متساويا من البروتين لكل عينة وقم بإعداد عينات البروتين في محلول Laemmli (6x buffer: 250 mM Tris-Cl pH 6.8 ، 10٪ SDS ، 30٪ Glycerol ، و 0.02٪ Bromophenol blue ؛ 5٪ β-Mercaptoethanol).
      ملاحظة: بالنسبة للنشاف المناعي لكل علامة UPR ، تم استخدام ما لا يقل عن 60-80 ميكروغرام من البروتين.
    5. تغلي عينات البروتين على حرارة 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعطي دورة قصيرة.
    6. حل عينات البروتين على هلام SDS-PAGE 10٪ -12٪ ونقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (انظر جدول المواد).
    7. احصله على 5٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم أو ألبومين مصل الأبقار (BSA) لمدة 1-2 ساعة ، واغسله مرتين باستخدام TBST (20 mM Tris pH7.4 و 0.137 M NaCl ؛ 0.1٪ Tween 20) ، ودقق في الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالبروتين ضد علامات الاستعراض الدوري الشامل (انظر جدول المواد) في الروك ، طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي بعد غسل البقع مرتين باستخدام TBST ، قم بالتحقيق مع الأجسام المضادة الثانوية المعنية لمدة 1.5 ساعة.
    8. اغسل البقع مرة أخرى باستخدام TBST وتصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة للكشف عن التلألؤ الكيميائي (انظر جدول المواد) في أداة تصوير اللطخة الغربية.
  2. RT PCR
    1. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام كاشف Trizol (انظر جدول المواد).
    2. تحضير cDNA من تركيز متساو من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي لفيروس Moloney Murine Leukemia (MMLV-RT) (انظر جدول المواد).
    3. تحليل تعديل تعبير mRNA ل HSPA5 ، XBP1 المقسم ، ATF4 ، CHOP و GADD34 باستخدام qRT-PCR مع البادئات الخاصة بالجينات (الجدول 2). باختصار ، قم بإعداد مخاليط تفاعل 10 ميكرولتر تحتوي على قالب cDNA (100 نانوغرام) ، و 5 ميكرولتر من صبغة SYBR الخضراء (انظر جدول المواد) ، و 10 pmol لكل زوج أوليغونيوكليوتيد خاص بالجينات. اضبط مستوى الصوت باستخدام H2O المعقم.
    4. قم بتشغيل المخاليط على جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام البرنامج التالي: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية متبوعا بتحليل منحنى الذوبان. احسب تغير الطي في التعبير الجيني المستهدف بالنسبة لجين التدبير المنزلي (على سبيل المثال β-Actin) على النحو التالي:
      تغيير الطي = 2-Δ (ΔCT)
      حيث ΔCT = CT (الهدف) - CT (جين التدبير المنزلي)
      و Δ (ΔCT) = ΔCT (معالجة) -ΔCT (تحكم)
    5. لمزيد من تأكيد الربط ل XBP1 ، قم بإجراء RT-PCR شبه كمي مع عينات غير مصابة و 72 ساعة.
      ملاحظة: تمت دراسة ربط XBP-1 mRNA باستخدام RT-PCR عبر موقع اللصق.
    6. تضخيم cDNA باستخدام بادئات XBP1 (الجدول 2) باستخدام مزيج رئيسي PCR عالي الدقة (انظر جدول المواد) في ظل الظروف التالية: دورة واحدة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 65 * Δ-5 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، يليها تمديد نهائي قدره 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والاحتفاظ عند 4 درجات مئوية.
    7. افصل الأمبليكونات على هلام أغاروز 2.5٪ يحتوي على 50 نانوغرام من بروميد الإيثيديوم / مل وتصوره في أداة وثيقة هلامية. شريط XBP1 المقسم أصغر بمقدار 26 نيوكليوتيدات.

5. ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل وتحليل التعبير الجيني المدفوع بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR وإنتاج الفيروس

  1. إعداد تركيبات shRNA لضربة قاضية من علامات الاستعراض الدوري الشامل
    1. إنشاء تركيبات shRNA باستخدام العمود الفقري لناقل pLKO.1-TRC (ناقل استنساخ الفيروسات العدسية)29.
    2. بناء بنيتين shRNA لكل جين (IRE1 و PERK و ATF6 و HSPA5). تم تصميم قليل النيوكليوتيدات الحسية والمضادة للإحساس التي تستهدف mRNA للجين المعني بواسطة اتحاد RNAi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (الجدول 3).
      ملاحظة: بطريقة مماثلة ، يمكن إجراء تركيبات shRNA لعلامات UPR الأخرى.
    3. قم بتلدين البادئات (100 نانومتر لكل من الأمام والخلف) عند 95 درجة مئوية متبوعة بالتبريد التدريجي إلى RT.
    4. بعد ذلك ، قم بربطه في مواقع Age1 و EcoRI لناقل pLKO.1 باستخدام رابط الحمض النووي T4 (انظر جدول المواد). تأكيد التسلسل عن طريق تسلسل الحمض النووي.
      ملاحظة: يتم استخدام بنية shRNA التي تستهدف جين LacZ كعنصر تحكم غير مستهدف.
  2. ضربة قاضية من PERK ، ATF6 ، IRE1 و HSPA5 في خلايا HEK-293T ، مقايسة Luciferase و p24 ELISA
    1. قم بإعداد مزيج من بنية shRNA (0.9 ميكروغرام) وكاشف نقل مثل polyethylenimine (PEI) (3 ميكرولتر من PEI مقابل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) (انظر جدول المواد) في 50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل عن طريق الدوامة واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
    2. من خلايا HEK-293T المتقاربة التي تحتوي على قارورة ، التربسينيز والبذور ~ 0.25 × 106 خلايا جنبا إلى جنب مع مزيج النقل في لوحة بئر 24 ، مما يجعل الحجم الإجمالي 125 ميكرولتر واحتضان لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . تسمى هذه الطريقة النقل العكسي حيث يتم زرع الخلايا مع خليط النقل.
    3. بعد 6 ساعات ، أضف 125 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى الآبار وأعد تعليق الخلايا للبذر المتساوي.
      ملاحظة: بالنسبة لتجارب الضربة القاضية ، يعطي النقل العكسي (الخطوات 5.2.1-5.2.3) كفاءة أفضل مع كل من shRNAs و siRNAs.
    4. بعد 24 ساعة ، قم بإجراء عملية نقل ثانية. قم بإعداد مزيج من pNL4-3 (100 نانوغرام) ، pLTR-Luc (100 نانوغرام) ، و pEGFP-N1 (50 نانوغرام) (pNL4-3: pLTR-Luc: pEGFPN1-1: 1: 0.5) مع PEI (3 ميكرولتر من PEI ل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) في 50 ميكرولتر من الوسائط غير المكتملة عن طريق الدوامة. احتضان المزيج لمدة 20 دقيقة في RT. قم بتغيير الوسائط الموجودة باستخدام 250 ميكرولتر من الوسائط الجديدة غير المكتملة وأضف المزيج إلى الخلايا.
      ملاحظة: تم تطوير ناقل مراسل ل HIV-1 LTR عن طريق الاستنساخ الفرعي LTR من pU3RIII30,31 إلى pGL3basic في المختبر في وقت سابق32. تم استخدام تعبير GFP باستخدام pEGFP-N1 لتطبيع كفاءة النقل32.
    5. قم بتغيير الوسائط بعد 6 ساعات بعد النقل باستخدام 500 ميكرولتر من DMEM الكامل. حصاد الخلايا بعد 36 ساعة لفحص المناعة واختبار لوسيفيراز.
    6. بالنسبة لمقايسة لوسيفيراز ، قم بتجميع الخلايا وإعادة تعليقها في ركيزة لوسيفيراز المشتراة تجاريا (50 ميكرولتر) (انظر جدول المواد). أضف محللة الخلية المعاد تعليقها إلى صفيحة بئر 96 غير شفافة واحتضنها لمدة 10-15 دقيقة. احصل على قراءة لوسيفيراز في مقياس الإنارة. قم أيضا بقياس مضان GFP في نفس العينات لتطبيع قراءة لوسيفيراز في قارئ لوحة microplate micromode (على سبيل المثال: 494 نانومتر ، Em: 519 نانومتر).
    7. ارسم الرسم البياني على أنه وحدة Luciferase / GFP على المحور Y.
      ملاحظة: يجب فحص ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل المعنية ، ويمكن إجراؤها إما عن طريق النشاف المناعي أو qRT-PCR باستخدام الأجسام المضادة أو البادئات الخاصة بالجينات ، على التوالي.
    8. اجمع المواد الطافية لمعالجة p24 ELISA كما هو مذكور أعلاه.
  3. إنشاء خلايا مستقرة مع ضربة قاضية من علامات الاستعراض الدوري الشامل وعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1.
    1. قم بإعداد جزيئات Lentivirus عن طريق نقل خلايا HEK-293T المصنفة في صفيحة 6 آبار ، مع تركيبات shRNA (1 ميكروغرام) المعنية جنبا إلى جنب مع pMD2.G (ناقل مغلف VSV-G) (0.75 ميكروغرام) ، و psPAX2 (بلازميد تغليف Lentiviral ) (0.25 ميكروغرام) (انظر جدول المواد) باستخدام PEI بنسبة 1 ميكروغرام من الحمض النووي: 3 ميكرولتر من جزيرة الأمير إدوارد. تحضير الخليط في 100 ميكرولتر من DMEM غير مكتملة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT. أضف الخليط إلى 1.8 مل من الوسائط الكاملة في خلايا HEK-293T المصنفة.
      ملاحظة: خلايا البذور HEK-293T في صفيحة بئر 6 على الأقل قبل 12 ساعة من النقل حتى تكتسب مورفولوجيا وتكون متقاربة بنسبة 60-70٪ تقريبا.
    2. بعد 24 ساعة من النقل ، أضف 1 مل من DMEM الكامل إلى كل بئر.
    3. اجمع المواد الطافية بعد 48 ساعة ، واحفظها في الفريزر -80 درجة مئوية ، وقم بإجراء p24 ELISA لتأكيد وجود الفيروس في هذه المواد الطافعة. استخدم هذا الطافي الفيروسي الخام لتحويل خلايا J6.
    4. احتضان 2 مليون خلية في صفيحة 6 آبار بحجم متساو من طاف الفيروسات العدسية (500 ميكرولتر) لكل عنصر تحكم وفيروس عدسي ضربة قاضية خاصة بالجينات وإضافة وسط RPMI 1640 كامل جديد في وجود بوليبرين (5 ميكروغرام / مل) لتعويض الحجم إلى 2 مل.
    5. بعد 24 ساعة ، أضف Puromycin (1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر لتحديد الخلايا المستقرة. بعد إضافة Puromycin ، قم بتجميع الخلايا كل 24 ساعة وإضافة 2 مل من الوسائط الطازجة باستخدام Puromycin.
    6. افعل ذلك حتى لا يكون هناك موت للخلايا (~ 1 أسبوع). الخلايا الباقية هي الخلايا المستقرة ذات الضربة القاضية الجينية المطلوبة.
      ملاحظة: يمكن فحص ضربة قاضية للجينات المعنية على فترات منتظمة ، وأخيرا ، عندما تكون الخلايا الباقية فقط مرئية في الوسائط المحتوية على Puromycin باستخدام immunoblotting أو qRT-PCR.
    7. تصيب خلايا LacZ والخلايا الضربة القاضية الخاصة بالجينات ب 0.5 MOI من HIV-1 كما هو موضح في القسم 2 وحصاد الخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة.
    8. اجمع المادة الطافية من كل عينة وقم بمعالجة p24-ELISA كما هو موضح سابقا وقم بمعالجة الخلايا للتحقق من مستوى الضربة القاضية عن طريق النشاف المناعي.

6. العلاج بمحفز الإجهاد ER وتحليل تأثيره على تكرار HIV-1

ملاحظة: لتحديد تأثير الإفراط في تحفيز الاستعراض الدوري الشامل أثناء تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 ، يمكن استخدام جزيء المحفز الدوائي ، Thapsigargin.

  1. تحديد النسبة المئوية لصلاحية الخلية عند علاج Thapsigargin.
    ملاحظة: يتم تحديد السمية الخلوية للثابسيجارجين بواسطة كاشف MTT (انظر جدول المواد).
    1. بذر 25000-30000 خلية CEM-GFP لكل بئر في 96 صفيحة بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من RPMI 1640 الكامل. أضف 100 نانومتر ثابسيجارجين إلى الوسائط واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
      ملاحظة: تم أخذ الخلايا المعالجة ب 1 ميكرولتر من DMSO كعنصر تحكم في السيارة.
    2. بعد 48 ساعة ، أضف 10 ميكرولتر من MTT (5 مجم / مل) في كل بئر واحتضانها في الظلام لمدة 4 ساعات لتشكيل بلورات الفورمازان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    3. بعد 4 ساعات ، قم بإذابة البلورات باستخدام 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لتشكيل لون أرجواني وقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    4. احسب النسبة المئوية لصلاحية الخلية بناء على المعادلة الواردة أدناه
      ٪ صلاحية الخلية = (التحكمOD570 - العلاجOD570) / التحكمOD570 × 100
  2. المعالجة المسبقة لثابسيجارجين وتحليل تطور عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 بواسطة p24 ELISA.
    1. قم بزرع مليون خلية CEM-GFP في صفيحة بئر 12 تحتوي على 1 مل من RPMI 1640 الكامل وعالج الخلايا ب 100 نانومتر من Thapsigargin أو 1 ميكرولتر من DMSO (التحكم في السيارة) لمدة 12 ساعة في حاضنة CO2 التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. بعد 12 ساعة ، اغسل الخلايا باستخدام RPMI 1640 الكامل وأصاب ب 0.5 MOI من HIV-1 كما هو موضح سابقا.
    2. احصد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة ، مثل 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة ، من أجل النشاف المناعي.
    3. اجمع المواد الطافية من كل عينة وقم بإجراء p24 ELISA كما هو موضح سابقا.
    4. ارسم التمثيل البياني بتركيز p24 في العينة باعتباره المحور Y والنقاط الزمنية ذات الصلة كمحور X.
    5. باستخدام immunoblotting ، قم بتحليل تحريض إجهاد ER بسبب علاج Thapsigargin عن طريق قياس مستوى أي علامات UPR. استخدمت هذه الدراسة HSPA5 كعلامة.

7. مقايسة عدوى TZM-bl β-gal لتحديد تأثير الاستعراض الدوري الشامل على عدوى virion

ملاحظة: لفهم دور الاستعراض الدوري الشامل في عدوى الفيروسية ، يمكن استخدام المادة الطافية من ضربة قاضية وكذلك العلاج باستخدام Thapsigargin ، لمقايسة عدوى TZM-bl β-gal كما هو موضح في القسم 1.2 ، بناء على تركيز p24 المحدد بواسطة p24 ELISA.

  1. تصيب خلايا TZM-bl بتركيز متساو من p24 من كل عينة وقم بإجراء تلطيخ β غالون. عد الخلايا المصابة الزرقاء تحت المجهر بتكبير 10x ل 5 حقول عشوائية.
  2. خذ متوسط عدد الحقول ال 5 لكل عينة من الخطوات المذكورة أعلاه.
  3. احسب تغيير الطي كما هو مذكور أدناه:
    تغيير الطي = متوسط عدد الخلايا الزرقاء في عينات الاختبار / متوسط عدد الخلايا الزرقاء في عينة التحكم.

النتائج

في هذا العمل ، وصفنا بروتوكولا مفصلا لدراسة إجهاد ER في المختبر وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل عند الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الخلايا التائية (الشكل 2). تصف هذه الدراسة أيضا طرق تحليل الأهمية الوظيفية للاستعراض الدوري الشامل في تكرار فير...

Discussion

يشمل نطاق هذا البروتوكول (i) التعامل مع مخزونات فيروس HIV-1 وقياس تركيز الفيروس وعدوى virion ، (ii) إصابة الخلايا التائية بفيروس HIV-1 وتقييم تأثيرها على إجهاد ER وعلامات مختلفة من الاستعراض الدوري الشامل ، (iii) تأثير ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل وتأثيرها على النشاط ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

نشكر المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند ، على الدعم الداخلي. AT و AD ممتنان للدكتوراه الدعم البحثي الذي تلقاه من المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند. DM ممتنة لزمالة JC Bose الوطنية من SERB ، حكومة الهند.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

References

  1. Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ER UPR 1 T ThT BiP IRE1 PERK EIF2 XBP1 ATF6 ATF4 CHOP GADD34 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved