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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo alcuni metodi consolidati per determinare lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l'attivazione della risposta proteica dispiegata (UPR), con particolare enfasi sull'infezione da HIV-1. Questo articolo descrive anche una serie di protocolli per studiare l'effetto dello stress ER/UPR sulla replicazione dell'HIV-1 e sull'infettività del virione.

Abstract

Le infezioni virali possono causare stress al reticolo endoplasmatico (ER) a causa di un accumulo anomalo di proteine, che porta alla risposta proteica non ripiegata (UPR). I virus hanno sviluppato strategie per manipolare l'UPR dell'ospite, ma in letteratura manca una comprensione dettagliata della modulazione dell'UPR e del suo significato funzionale durante l'infezione da HIV-1. In questo contesto, il presente articolo descrive i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio per misurare i livelli di stress ER e UPR durante l'infezione da HIV-1 nelle cellule T e l'effetto dell'UPR sulla replicazione virale e sull'infettività.

La colorazione con tioflavina T (ThT) è un metodo relativamente nuovo utilizzato per rilevare lo stress ER nelle cellule rilevando aggregati proteici. Qui, abbiamo illustrato il protocollo per la colorazione con ThT nelle cellule infette da HIV-1 per rilevare e quantificare lo stress ER. Inoltre, lo stress ER è stato rilevato anche indirettamente misurando i livelli di marcatori UPR come BiP, IRE1 fosforilato, PERK ed eIF2α, splicing di XBP1, scissione di ATF6, ATF4, CHOP e GADD34 in cellule infette da HIV-1, utilizzando l'immunoblotting convenzionale e la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-PCR). Abbiamo scoperto che la fluorescenza ThT è correlata con gli indicatori di attivazione dell'UPR. Questo articolo dimostra anche i protocolli per analizzare l'impatto dello stress ER e della modulazione UPR sulla replicazione dell'HIV-1 mediante esperimenti di knockdown e l'uso di molecole farmacologiche. L'effetto dell'UPR sull'espressione/replicazione genica dell'HIV-1 e sulla produzione del virus è stato analizzato rispettivamente mediante saggi reporter Luciferase e ELISA di cattura dell'antigene p24, mentre l'effetto sull'infettività del virione è stato analizzato mediante colorazione di cellule reporter infette. Nel complesso, questo insieme di metodi fornisce una comprensione completa dei percorsi di risposta proteica unfolded durante l'infezione da HIV-1, rivelando le sue intricate dinamiche.

Introduzione

La sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è caratterizzata da una graduale riduzione del numero di linfociti T CD4+, che porta al progressivo fallimento della risposta immunitaria. Il virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1) è l'agente eziologico dell'AIDS. È un virus a RNA a singolo filamento con involucro, senso positivo, con due copie di RNA per virione e appartiene alla famiglia dei retroviridae. La produzione di alte concentrazioni di proteine virali all'interno della cellula ospite pone uno stress eccessivo sul meccanismo di ripiegamento delle proteine della cellula1. L'ER è il primo compartimento della via secretoria delle cellule eucariotiche. È responsabile della produzione, dell'alterazione e della consegna delle proteine alla via secretoria e ai siti bersaglio dello spazio extracellulare. Le proteine subiscono numerosi cambiamenti post-traduzionali e si ripiegano nella loro conformazione naturale nell'ER, tra cui la glicosilazione legata all'asparagina e la creazione di legami disolfuro intra- e intermolecolari2. Pertanto, nel lume dell'ER sono presenti alte concentrazioni di proteine e queste sono molto inclini all'aggregazione e al ripiegamento errato. Varie condizioni fisiologiche, come lo shock termico, le infezioni microbiche o virali, che richiedono una maggiore sintesi proteica o mutazione proteica, portano allo stress dell'ER a causa dell'aumento dell'accumulo di proteine nell'ER, disturbando così l'omeostasi del lume dell'ER. Lo stress dell'ER attiva una rete di vie di trasduzione del segnale adattive altamente conservate, l'Unfolded Protein Response (UPR)3. L'UPR viene impiegato per riportare la normale condizione fisiologica dell'ER allineando il suo carico proteico dispiegato e la capacità di ripiegamento. Ciò è causato dall'aumento delle dimensioni dell'ER e degli chaperoni molecolari e delle foldasi residenti nell'ER, con conseguente aumento della capacità di ripiegamento dell'ER. L'UPR riduce anche il carico proteico dell'ER attraverso l'attenuazione della sintesi proteica globale a livello traduzionale e aumenta la clearance delle proteine non ripiegate dall'ER attraverso l'upregolazione della degradazione associata all'ER (ERAD)4,5.

Lo stress dell'ER è rilevato da tre proteine transmembrana residenti nell'ER: la proteina chinasi R (PKR)-like endoplasmic reticulum chinasi (PERK), il fattore di trascrizione attivante 6 (ATF6) e l'enzima di tipo 1 che richiede inositolo (IRE1). Tutti questi effettori sono mantenuti inattivi legandosi al chaperone Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 (HSPA5), noto anche come proteina legante (BiP)/proteina regolata dal glucosio 78-kDa (GRP78). In seguito allo stress dell'ER e all'accumulo di proteine non ripiegate/mal ripiegate, HSPA5 si dissocia e porta all'attivazione di questi effettori, che poi attivano una serie di bersagli a valle che aiutano a risolvere lo stress dell'ER e, in condizioni estreme, promuovono la morte cellulare6. Dopo la dissociazione da HSPA5, PERK si autofosforilata e la sua attività chinasica viene attivata7. La sua attività chinasica fosforila eIF2α, che porta all'attenuazione traduzionale, abbassando il carico proteico dell'ER8. Tuttavia, in presenza del fattore di iniziazione fosfo-eucariotico 2α (eIF2α), i frame di lettura aperti non tradotti su specifici mRNA vengono tradotti preferenzialmente, come l'ATF4, regolando i geni indotti dallo stress. L'ATF4 e la proteina omologa C/EBP (CHOP) sono fattori di trascrizione che regolano i geni indotti dallo stress e regolano le vie dell'apoptosi e della morte cellulare 9,10. Uno dei bersagli di ATF4 e CHOP è la proteina GADD34 (GADD34), che insieme alla proteina fosfatasi 1 defosforilata peIF2α e agisce come regolatore di feedback per l'attenuazione traduzionale11. Sotto stress ER, ATF6 si dissocia da HSPA5 e il suo segnale di localizzazione del Golgi viene esposto, portando alla sua traslocazione nell'apparato di Golgi. Nell'apparato di Golgi, l'ATF6 viene scisso dalla proteasi del sito-1 (S1P) e dalla proteasi del sito-2 (S2P) per rilasciare la forma scissa di ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 viene quindi traslocato nel nucleo, dove induce l'espressione di geni coinvolti nel ripiegamento, maturazione e secrezione delle proteine, nonché nella degradazione delle proteine12,13. Durante lo stress ER, IRE1 si dissocia da HSPA5, si multimerizza e auto-fosforila14. La fosforilazione di IRE1 attiva il suo dominio RNasi, mediando in particolare lo splicing di 26 nucleotidi dalla parte centrale dell'mRNA della proteina legante X-box 1 (XBP1)15,16. Questo genera un nuovo C-terminale che conferisce funzione di transattivazione, generando la proteina funzionale XBP1s, un potente fattore di trascrizione che controlla diversi geni indotti dallo stress ER17,18. L'attività combinata di questi fattori di trascrizione attiva i programmi genetici volti a ripristinare l'omeostasi dell'ER.

Esistono vari metodi per rilevare lo stress ER e l'UPR. Questi includono i metodi convenzionali di analisi dei marcatori UPR19,20. Vari metodi non convenzionali includono la misurazione dello stato redox dell'UPR e della distribuzione del calcio nel lume dell'ER, nonché la valutazione della struttura dell'ER. La microscopia elettronica può essere utilizzata per vedere quanto il lume dell'ER si allarga in risposta allo stress dell'ER nelle cellule e nei tessuti. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo e dipende dalla disponibilità di un microscopio elettronico, che potrebbe non essere disponibile per tutti i gruppi di ricerca. Inoltre, la misurazione del flusso di calcio e dello stato redox dell'ER è impegnativa a causa della disponibilità di reagenti. Inoltre, la lettura di questi esperimenti è molto sensibile e potrebbe essere influenzata da altri fattori del metabolismo cellulare.

Una tecnica potente e semplice per monitorare le uscite dell'UPR consiste nel misurare l'attivazione delle diverse vie di segnalazione dell'UPR ed è stata utilizzata per decenni in vari scenari di stress. Questi metodi convenzionali per misurare l'attivazione dell'UPR sono economici, fattibili e forniscono le informazioni in meno tempo rispetto ad altri metodi noti. Questi includono l'immunoblotting per misurare l'espressione dei marcatori UPR a livello proteico, come la fosforilazione di IRE1, PERK e eIF2α e la scissione di ATF6 misurando la forma P50 di ATF6 e l'espressione proteica di altri marcatori come HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP e GADD34 spliced, nonché RT-PCR per determinare i livelli di mRNA e lo splicing dell'mRNA XBP1.

Questo articolo descrive un insieme convalidato e affidabile di protocolli per monitorare lo stress ER e l'attivazione dell'UPR nelle cellule infette da HIV-1 e per determinare la rilevanza funzionale dell'UPR nella replicazione e nell'infettività dell'HIV-1. I protocolli utilizzano reagenti facilmente reperibili ed economici e forniscono informazioni convincenti sulle uscite UPR. Lo stress ER è il risultato dell'accumulo di proteine non ripiegate/mal ripiegate, che tendono a formare aggregati proteici21. Con la presente descriviamo un metodo per rilevare questi aggregati proteici nelle cellule infette da HIV-1. La colorazione con tioflavina T è un metodo relativamente nuovo utilizzato per rilevare e quantificare questi aggregati proteici22. Beriault e Werstuck hanno descritto questa tecnica per rilevare e quantificare gli aggregati proteici e, quindi, i livelli di stress ER nelle cellule vive. È stato dimostrato che la piccola molecola fluorescente tioflavina T (ThT) si lega selettivamente agli aggregati proteici, in particolare alle fibrille amiloidi.

In questo articolo, descriviamo l'uso del ThT per rilevare e quantificare lo stress ER nelle cellule infette da HIV-1 e lo correliamo al metodo convenzionale di monitoraggio dell'UPR misurando l'attivazione di diverse vie di segnalazione dell'UPR.

Poiché mancano anche informazioni complete sul ruolo dell'UPR durante l'infezione da HIV-1, forniamo una serie di protocolli per comprendere il ruolo dell'UPR nella replicazione dell'HIV-1 e nell'infettività del virione. Questi protocolli includono il knockdown mediato da lentivirus dei marcatori UPR e il trattamento con induttori farmacologici dello stress ER. Questo articolo mostra anche i tipi di lettura che possono essere utilizzati per misurare l'espressione genica dell'HIV-1, la produzione virale e l'infettività dei virioni prodotti, come il saggio della luciferasi basato sulla ripetizione terminale lunga (LTR), il saggio di immunoassorbimento enzimatico p24 (ELISA) e il saggio di colorazione reporter β-gal.

Utilizzando la maggior parte di questi protocolli, abbiamo recentemente riportato l'implicazione funzionale dell'infezione da HIV-1 sull'UPR nelle cellule T23, e i risultati di quell'articolo suggeriscono l'affidabilità dei metodi qui descritti. Pertanto, questo articolo fornisce una serie di metodi per informazioni complete sull'interazione di HIV-1 con lo stress ER e l'attivazione dell'UPR.

Protocollo

NOTA: Le linee cellulari utilizzate qui sono HEK-293T e Jurkat J6 (una linea cellulare CD4+T), che sono state ottenute dal Cell Repository, NCCS, Pune, India; TZM-bl, una linea cellulare derivata da HeLa che ha integrato copie dei geni della β-galattosidasi e della luciferasi sotto il promotore24 della ripetizione terminale lunga (LTR) dell'HIV-1 e del CEM-GFP (un'altra linea cellulare reporter T CD4+)25 è stata ottenuta dal NIH AIDS Repository, USA.

1. Preparazione e conservazione delle scorte per il virus HIV-1

  1. Preparazione stock del virus HIV-1
    NOTA: Si consiglia di mettere in pratica le linee guida internazionali relative alla biosicurezza disponibili nel manuale dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) o dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in tutti gli esperimenti che coinvolgono l'HIV-1. La manipolazione del virus e qualsiasi esperimento con il virus vivo deve essere effettuata solo in un'adeguata cabina di biosicurezza ospitata in almeno un laboratorio di contenimento di livello BSL2. La produzione di particelle infettive di HIV-1 utilizzando un kit di trasfezione di mammiferi fosfato di calcio è descritta in questo segmento del protocollo.
    1. Seminare le cellule HEK-293T in piastre da 90 mm con 10 mL di DMEM completo (integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina) (Dulbecco's Modified Eagle Medium) in una cabina di biosicurezza di classe II di tipo A2 e conservare per circa 12 ore in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C in modo che la confluenza delle cellule sia compresa tra il 50% e il 60%.
    2. Il giorno successivo, preparare la miscela di trasfezione: preparare la soluzione A contenente 25 μg di DNA plasmidico pNL4.3 (un clone molecolare dell'HIV-1) in tampone sterile, 86,8 μl di 2 M CaCl2 e l'acqua sterile rimanente per ottenere il volume finale di 700 μl per ciascuna piastra. Preparare la soluzione B contenente 700 μl di soluzione salina tamponata HEPES (HBS) 2x per 1 piastra. Quindi, regolare il calcolo per il numero totale di piastre.
    3. Ora aggiungi la soluzione B alla soluzione A in modo goccia mentre fai vorticare continuamente la soluzione A. Il volume totale della miscela di trasfezione diventa ora di 1,4 mL per una piastra.
      NOTA: Aggiunta precisa a goccia della soluzione B alla soluzione A mentre il vortice continuo porta alla formazione di complessi di trasfezione perfetti.
    4. Incubare questa miscela a temperatura ambiente (RT) per circa 20 minuti. Quindi, aggiungere lentamente la miscela goccia a goccia a ciascuna piastra contenente 9 ml freschi di DMEM completo e trasferire le piastre nell'incubatore di CO2 . Dopo 8-10 ore, sostituire il terreno esistente con 10 ml freschi di DMEM completo.
    5. Dopo 24 ore dal cambio del terreno, raccogliere il surnatante (che contiene le particelle virali) da tutte le piastre in provette coniche. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti utilizzando una centrifuga da tavolo a bassa velocità (Tabella dei materiali) per rimuovere i detriti cellulari.
    6. Trasferire il surnatante nelle provette per ultracentrifuga in poliallomero e posizionarle nel rotore oscillante di un'ultracentrifuga (Tabella dei materiali). Controllare l'equilibrio dei pesi dei portaprovette e, se necessario, regolarli con un mezzo sterile.
    7. Ultracentrifugare a 1,41,000 x g per 2,5 h a 4 °C. Dopodiché, estrarre con cautela i tubi e travasare lentamente il surnatante all'interno della cabina di biosicurezza.
    8. Al pellet (che ora è il virus concentrato) in ciascuna provetta, aggiungere 1 mL di terreno RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incompleto ed eseguire un pipettaggio vigoroso per rimuovere il pellet.
      NOTA: Il pellet dopo l'ultracentrifuga è quasi invisibile ad occhio nudo. Quindi, è necessario assicurarsi di aggiungere RPMI 1640 al centro del tubo in modo che il pellet venga rimosso correttamente.
    9. Quindi, aggiungere 25 μl di 1 M HEPES pH 7,4 a 1 mL di sospensione virale. Aliquotare 50 μl della sospensione in provette da centrifuga da 1,5 mL e conservarle immediatamente in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
  2. Quantificazione della concentrazione virale e infettività del virione
    NOTA: Per calcolare l'infettività del virus, è essenziale prima quantificarne la concentrazione, che viene effettuata mediante p24 Antigen Capture ELISA (secondo le istruzioni del produttore e quindi non viene descritto qui; vedi Tabella dei materiali). Questo processo fornisce la concentrazione del virus in nanogrammi per microlitro (ng/μL) del ceppo, che viene poi utilizzato per identificare il numero di virione infettivo nel ceppo attraverso il seguente esperimento in cellule reporter TZM-bl26.
    1. Contare e seminare 0,1 x 106 cellule TZM-bl in una piastra da 24 pozzetti utilizzando 500 μL di DMEM completo per ogni pozzetto e conservarla in un incubatore per colture cellulari per 10-12 ore.
    2. Assicurati che le cellule siano confluenti al 50%-60% prima di iniziare con l'infezione per la quantificazione del virus. Sostituire il terreno esistente con 250 μL di DMEM completo fresco in ciascun pozzetto.
      NOTA: Mantenere un pozzetto di controllo positivo per escludere qualsiasi guasto sperimentale.
    3. Calcola la quantità di virus stock necessaria per infezioni di 1 ng, 0,1 ng e 0,01 ng nei duplicati. Aggiungere la quantità appropriata di virus ai pozzetti e mantenere la piastra nell'incubatore a 37 °C per 4 ore.
    4. Lavare le celle due volte con 500 μL di DMEM incompleto e quindi aggiungere 500 μL di DMEM completo.
    5. Procedere con la procedura di colorazione a β galloni dopo 36 ore di cambio del fluido.
      1. Eliminare il terreno esistente e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS. Fissare le cellule aggiungendo 500 μL della soluzione di fissaggio (0,25% di glutaraldeide in PBS) a ciascun pozzetto e incubare a RT all'interno della cabina di biosicurezza per 5-7 minuti.
      2. Preparare la soluzione colorante come indicato nella Tabella 1. Tienilo lontano dalla luce poiché X-gal è sensibile alla luce.
      3. Lavare le cellule una volta con 1 mL di PBS. Sovrapporre le cellule con 500 μl di soluzione colorante appena preparata e incubare a 37 °C al buio per 2-18 ore.
      4. Per interrompere la reazione in seguito, sciacquare le cellule con 500 μL di dimetilsolfossido (DMSO) al 3% in PBS due volte e quindi mantenere le cellule in 500 μL di PBS fresco.
      5. Contare le cellule blu infette (come mostrato nella Figura 1A) al microscopio con un ingrandimento di 10x per 5 campi casuali. Prendi un conteggio medio dei 5 campi e moltiplicalo per il fattore di campo e il fattore di diluizione. Questo quantifica le particelle di virione infettive nello stock virale.
        NOTA: Per una piastra a 24 pozzetti, il fattore di campo è 75.
ComponentiPreparazioneVolume richiesto
PBSPrepara 1x PBS da una scorta di 10x PBS14 ml
Ferro-cianuro di potassioSciogliere 0,82 g di ferricianuro di potassio e 1,06 g di ferrocianuro di potassio in 25 mL di 1x PBS0,75 ml
Cloruro di magnesio1 M in 1 mL di 1x PBS15 μl
X-galSciogliere 30 mg in 0,6 mL di N,N-dimetil formammide (al buio)0,3 ml
Totale = 15 mL

Tabella 1: Elenco dei componenti necessari per la colorazione β-gal nelle cellule TZM-bl.

2. Infezione da HIV-1 di linee di cellule T

  1. Scongelare e coltivare una linea di cellule T immortalizzata. Questo studio ha utilizzato una linea cellulare CEM-GFP coltivata in terreno RPMI 1640 completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 500 μg/mL di G418.
  2. Conta e prendi 2 milioni di cellule per ogni punto temporale (non infetto, 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore). Raccogliere immediatamente le cellule non infette centrifugando a 100 x g per 5 minuti e aggiungere un tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), integrato con un cocktail di inibitori della proteasi, 0,5 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e 1x inibitore della fosfatasi (50 μL per 1-3 milioni di cellule) o liso nel reagente Trizol (1 mL per 1-3 milioni di cellule) per l'isolamento dell'RNA (vedere la Tabella di Materiali).
  3. Lavare le cellule una volta con 1 mL di terreno RPMI 1640 completo contenente polibrene (5 μg/mL) a 100 x g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo.
    NOTA: Il polibrene è un polimero cationico che viene utilizzato per migliorare l'infezione retrovirale nelle cellule di mammifero.
  4. Risospendere gli 8 milioni di cellule in 1 mL di polibrene contenente terreno completo. Ora calcola il volume di stock virale necessario per 4 milioni di particelle di virione, aggiungi lo stock virale e componi il volume totale a 2 mL aggiungendo un terreno completo. Questo lo rende un MOI di 0,5.
  5. Mantenere le celle all'interno dell'incubatore di CO2 a 37 °C per 4 ore, con picchiettamento intermittente ogni 30-45 minuti.
  6. Dopo 4 ore, centrifugare le cellule e gettare il surnatante con cura all'interno della cabina di biosicurezza con metodi di smaltimento adeguati.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, centrifugare le celle a 100 x g per 5 minuti a RT.
  7. Lavare le cellule due volte con 1 mL di terreno incompleto. Risospendere le cellule in 8 mL di terreno completo, per ottenere 1 milione di cellule/mL.
  8. In una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti, seminare un numero uguale di cellule nel numero richiesto di pozzetti e conservare la piastra in un incubatore di CO2 mantenuto a 37 °C.
  9. Per i successivi 4 giorni, raccogliere le cellule ogni 24 ore aggiungendo un tampone di lisi cellulare. Inoltre, raccogliere il surnatante e trasferirlo immediatamente nel congelatore a -80 °C.
  10. Per verificare se l'infezione è avvenuta, procedere con l'ELISA di cattura dell'antigene p24 per tutti i punti temporali. Effettuare diluizioni adeguate per i punti temporali, cioè una diluizione più bassa per i punti temporali iniziali e più alta per quelli successivi che vanno da 1:50 a 1:500. Tracciare le letture in un grafico che rappresenta la progressione dell'infezione (Figura 1B).

3. Colorazione con tioflavina T per determinare lo stress dell'ER

  1. Fissare 1 milione di cellule CEM-GFP non infette e con 0,5 MOI (prese 72 ore su cellule infette) con 200 μL di paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a RT.
  2. Pellettare le celle a 100 x g per 5 minuti e trattare con 500 μL di glicina 0,1 M per 5 minuti, quindi lavare con 500 μL di PBS due volte. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS.
  3. Assemblare i vetrini, le schede filtranti e le camere dei campioni. Aggiungere i 100 μl di cellule risospese alle camere del campione e far girare le cellule a 1000 x g per 4 minuti per far aderire le cellule ai vetrini in una citocentrifuga (Tabella dei materiali).
    NOTA: Non ci sarebbero abbastanza cellule immobilizzate sul vetrino dopo la centrifugazione della citocentrifuga se la sospensione cellulare è troppo diluita. È probabile che le cellule si aggreghino e siano scarsamente distribuite dopo la citocentrifuga, se la sospensione cellulare è molto concentrata.
  4. Permeabilizzare le cellule per 10 minuti utilizzando gocce di Triton-X-100 allo 0,1% in PBS (sufficienti a coprire l'area in cui le cellule hanno aderito) e lavare le cellule due volte mettendo il PBS a goccia e pulendo il PBS con il tessuto inclinando il vetrino.
  5. Incubare le cellule con 10 μL di 5 μM di tioflavina T per 30 minuti.
    NOTA: Non lavare dopo l'incubazione con ThT.
  6. Montare i vetrini utilizzando 5 μL di terreno di montaggio (80% glicerolo v/v, 20% PBS v/v e 8 mg/mL di 1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano [DABCO]), applicare il vetrino coprioggetti e sigillare il vetrino coprioggetti con smalto per unghie. Lasciare asciugare le diapositive.
    NOTA: In tutti questi passaggi, assicurarsi che le celle non si secchino.
  7. Scattare le immagini confocali di cellule fissate con una lente a immersione in glicerolo 63x su un microscopio confocale (vedere la Tabella dei materiali). Regolare le seguenti impostazioni di eccitazione ed emissione: GFP (Es. 494 nm, Em. 519 nm) e ThT (Es. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    NOTA: Ogni canale fluorescente deve essere ripreso in sequenza, anziché simultaneamente, per evitare la sovrapposizione dei canali. La GFP è stata considerata l'indicazione dell'infezione da HIV-1 in quanto le cellule CEM-GFP hanno la GFP sotto la regolazione del promotore LTR, che si attiva in seguito all'infezione da HIV-125.
  8. Converti le immagini fluorescenti a 8 bit prima di quantificarle mediante analisi di soglia. Quantifica manualmente l'intensità di ogni cella utilizzando un software come Image J (~50 celle)27. Traccia il grafico con l'intensità di ciascuna cella come punti sull'asse Y rispetto ai criteri non infetti e infetti.
  9. Per dimostrare l'efficacia di questo protocollo, assumere un controllo positivo, ad esempio il trattamento con Thapsigargin (noto induttore di stress ER) in questo caso28. Trattare 1 milione di cellule CEM-GFP, ciascuna con 1 μL di DMSO (controllo del veicolo) e 100 nM di Thapsigargin per 12 ore.
  10. Raccogliere le cellule e procedere per la colorazione ThT come menzionato per i campioni infetti (passaggi 3.1-3.8).
    NOTA: Per questi campioni, la fluorescenza GFP non è richiesta. Pertanto, solo la fluorescenza ThT viene catturata nella microscopia confocale.

4. Determinazione dell'attivazione e dell'espressione di vari marcatori UPR

NOTA: Per determinare l'espressione dei marcatori UPR vengono utilizzati due metodi: Immunoblotting e RT-PCR. Per l'immunoblotting, prelevare le cellule CEM-GFP infette da HIV-1 a 0,5 MOI in vari momenti dopo l'infezione (24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore dopo l'infezione) e risospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi (come indicato nella fase 2.2). In alternativa, per la RT-PCR, i pellet cellulari vengono lisati nel reagente Trizol (1 mL per 1-3 milioni di cellule) (vedere la Tabella dei materiali). Le cellule risospese nel tampone di lisi e nel reagente Trizol possono essere conservate a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

  1. Immunoblotting per l'analisi dei marcatori UPR.
    1. Mantenere le cellule risospese nel tampone di lisi su ghiaccio per 45 minuti mescolando in modo intermittente utilizzando un vortice.
    2. Pellettare le celle a 18000 x g per 15 minuti utilizzando una centrifuga da banco ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali). Raccogliere il surnatante in un tubo nuovo.
    3. Quantificare la concentrazione proteica in ciascun campione utilizzando Bradford o un reagente simile.
    4. Prelevare una concentrazione uguale di proteine per ogni campione e preparare i campioni proteici in tampone Laemmli (6x tampone: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% glicerolo e 0,02% blu di bromofenolo; 5% β-mercaptoetanolo).
      NOTA: Per l'immunoblotting per ciascun marcatore UPR, è stato utilizzato un minimo di 60-80 μg di proteine.
    5. Far bollire i campioni di proteine a 96 °C per 5 minuti e centrifugare brevemente.
    6. Risolvere i campioni di proteine su un gel SDS-PAGE al 10%-12% e trasferire le proteine su una membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedere la Tabella dei materiali).
    7. Bloccare con latte in polvere scremato al 5% o albumina sierica bovina (BSA) per 1-2 ore, lavare due volte con TBST (20 mM Tris pH7.4 e 0,137 M NaCl; 0,1% Tween 20) e sondare con anticorpi primari proteino-specifici contro i marcatori UPR (vedere Tabella dei materiali) in un bilanciere, per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, dopo aver lavato due volte le macchie con TBST, sondare con i rispettivi anticorpi secondari per 1,5 ore.
    8. Lavare nuovamente i blot con TBST e visualizzare le bande proteiche utilizzando un substrato di rilevamento della chemiluminescenza (vedi Tabella dei materiali) in uno strumento di imaging western blot.
  2. RT PCR
    1. Isolare l'RNA totale dalle cellule utilizzando il reagente Trizol (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Preparare il cDNA a partire da una concentrazione uguale di RNA utilizzando la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney (MMLV-RT) (vedi Tabella dei materiali).
    3. Analizzare la modulazione dell'espressione dell'mRNA di HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP e GADD34 mediante qRT-PCR con primer gene-specifici (Tabella 2). In breve, preparare miscele di reazione da 10 μl contenenti stampo di cDNA (100 ng), 5 μl di colorante verde SYBR (vedi Tabella dei materiali) e 10 pmol di ciascuna coppia di primer oligonucleotidici specifici per il gene. Regolare il volume utilizzando H2O sterile.
    4. Eseguire le miscele su una macchina PCR in tempo reale utilizzando il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti e 40 cicli di 95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s seguita dall'analisi della curva di fusione. Calcola la variazione di piega nell'espressione genica bersaglio rispetto al gene housekeeping (ad esempio β-actina) come:
      Cambio di piega = 2-Δ(ΔCT)
      Dove ΔCT = CT (bersaglio) − CT (gene del mantenimento della casa)
      e Δ(ΔCT) = ΔCT (trattato) -ΔCT (controllo)
    5. Per confermare ulteriormente lo splicing di XBP1, eseguire una RT-PCR semiquantitativa con campioni non infetti e infetti per 72 ore.
      NOTA: Lo splicing dell'mRNA di XBP-1 viene studiato utilizzando la RT-PCR attraverso il sito di splicing.
    6. Amplificare il cDNA con primer XBP1 (Tabella 2) utilizzando una master mix PCR ad alta fedeltà (vedere la Tabella dei materiali) nelle seguenti condizioni: 1 ciclo di 98 °C per 30 s, seguito da 5 cicli di 98 °C per 15 s, 65*Δ-5 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, seguiti da 30 cicli di 98 °C per 15 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, seguita da un'estensione finale di 72 °C per 10 min e mantenimento a 4 °C.
    7. Separare gli ampliconi su un gel di agarosio al 2,5% contenente 50 ng di bromuro di etidio/mL e visualizzare in uno strumento gel doc. La banda XBP1 spliced è più piccola di 26 nucleotidi.

5. Knockdown dei marcatori UPR e analisi dell'espressione genica e della produzione virale guidata da HIV-1 LTR

  1. Preparazione di costrutti di shRNA per il knockdown di marcatori UPR
    1. Creare costrutti di shRNA utilizzando la spina dorsale del vettore pLKO.1-TRC (vettore di clonazione lentivirale)29.
    2. Costruire due costrutti di shRNA per ciascun gene (IRE1, PERK, ATF6 e HSPA5). Gli oligonucleotidi senso e antisenso che hanno come bersaglio l'mRNA del rispettivo gene sono stati progettati dal Consorzio RNAi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabella 3).
      NOTA: In modo simile, i costrutti di shRNA possono essere realizzati per altri marcatori UPR.
    3. Ricuocere gli inneschi (100 nM ciascuno di avanti e indietro) a 95 °C seguito da un raffreddamento graduale a RT.
    4. Quindi, legarlo nei siti Age1 ed EcoRI del vettore pLKO.1 utilizzando una DNA ligasi T4 (vedi Tabella dei materiali). Confermare la sequenza mediante sequenziamento del DNA.
      NOTA: Un costrutto shRNA che ha come bersaglio il gene LacZ viene utilizzato come controllo non mirato.
  2. Knockdown di PERK, ATF6, IRE1 e HSPA5 in cellule HEK-293T, saggio della luciferasi e ELISA p24
    1. Preparare una miscela di costrutto shRNA (0,9 μg) e un reagente di trasfezione come la polietilenimmina (PEI) (3 μl di PEI per 1 μg di DNA) (vedi Tabella dei materiali) in 50 μl di terreno privo di siero mediante vortex e incubare per 20 minuti.
    2. Da una cella HEK-293T confluente contenente fiaschetta, tripsinizzare e seminare ~0,25 x 106 cellule insieme alla miscela di trasfezione in una piastra a 24 pozzetti, per un volume totale di 125 μL e incubare per 6 ore a 37 °C in un incubatore di CO2 . Questo metodo è chiamato trasfezione inversa in cui le cellule vengono seminate insieme alla miscela di trasfezione.
    3. Dopo 6 ore, aggiungere 125 μL di terreno completo ai pozzetti e risospendere le cellule per una semina uniforme.
      NOTA: Per gli esperimenti di knockdown, la trasfezione inversa (passaggi 5.2.1-5.2.3) offre una migliore efficienza sia con gli shRNA che con i siRNA.
    4. Dopo 24 ore, eseguire una seconda trasfezione. Preparare una miscela di costrutti pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) e pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) con PEI (3 μL di PEI per 1 μg di DNA) in 50 μL di terreno incompleto mediante vortex. Incubare la miscela per 20 minuti a RT. Sostituire il terreno esistente con 250 μl di terreno fresco incompleto e aggiungere la miscela alle cellule.
      NOTA: Un vettore reporter per l'LTR dell'HIV-1 è stato sviluppato mediante sub-clonazione di LTR da pU3RIII30,31 in pGL3basic in laboratorio in precedenza32. L'espressione di GFP utilizzando pEGFP-N1 è stata utilizzata per normalizzare l'efficienza di trasfezione32.
    5. Sostituire il terreno dopo 6 ore dopo la trasfezione con 500 μL di DMEM completo. Raccogliere le cellule dopo 36 ore per l'immunoblotting e il test della luciferasi.
    6. Per il dosaggio della luciferasi, pellettare le cellule e risospenderle in un substrato di luciferasi procurato in commercio (50 μL) (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere il lisato cellulare risospeso in una piastra opaca a 96 pozzetti e incubare per 10-15 minuti. Ottieni la lettura della luciferasi in un luminometro. Misurare anche la fluorescenza GFP negli stessi campioni per normalizzare la lettura della luciferasi in un lettore di piastre micromodale per micropiastre (Es: 494 nm, Em:519 nm).
    7. Traccia il grafico come unità di luciferasi/GFP sull'asse Y.
      NOTA: Il knockdown dei rispettivi marcatori UPR deve essere controllato e può essere eseguito mediante immunoblotting o qRT-PCR utilizzando rispettivamente anticorpi o primer specifici per il gene.
    8. Raccogliere i surnatanti da elaborare per l'ELISA p24 come menzionato sopra.
  3. Creazione di cellule stabili con knockdown dei marcatori UPR e infezione da HIV-1.
    1. Preparare le particelle di lentivirus trasfettando le cellule HEK-293T seminate in una piastra a 6 pozzetti, con i rispettivi costrutti di shRNA (1 μg) insieme a pMD2.G (vettore dell'involucro VSV-G) (0,75 μg) e psPAX2 (plasmide di imballaggio lentivirale) (0,25 μg) (vedi Tabella dei materiali) utilizzando PEI nel rapporto 1 μg di DNA: 3 μL di PEI. Preparare la miscela in 100 μL di DMEM incompleto e incubare per 20 minuti a RT. Aggiungere la miscela a 1,8 mL di terreno completo nelle cellule HEK-293T seminate.
      NOTA: Seminare le cellule HEK-293T in una piastra a 6 pozzetti almeno 12 ore prima della trasfezione fino a quando non acquisiscono morfologia e sono confluenti per circa il 60-70%.
    2. Dopo 24 ore di trasfezione, aggiungere 1 mL di DMEM completo a ciascun pozzetto.
    3. Raccogliere i surnatanti dopo 48 ore, conservare in congelatore a -80 °C ed eseguire l'ELISA p24 per confermare la presenza del virus in questi surnatanti. Usa questo surnatante lentivirale grezzo per la trasduzione delle cellule J6.
    4. Incubare 2 milioni di cellule in una piastra a 6 pozzetti con un volume uguale di surnatante lentivirale (500 μL) per ogni lentivirus di controllo e knockdown specifico per gene e aggiungere un terreno RPMI 1640 fresco completo in presenza di polibrene (5 μg/mL) per portare il volume a 2 mL.
    5. Dopo 24 ore, aggiungere la puromicina (1 μg/mL) a ciascun pozzetto per selezionare le cellule stabili. Dopo aver aggiunto la puromicina, pellettare le cellule ogni 24 ore e aggiungere 2 ml di terreno fresco con puromicina.
    6. Fallo fino a quando non c'è morte cellulare (~1 settimana). Le cellule sopravvissute sono le cellule stabili con il knockdown genico desiderato.
      NOTA: Il knockdown dei rispettivi geni può essere controllato a intervalli regolari e, infine, quando solo le cellule sopravvissute sono visibili nei terreni contenenti Puromicina utilizzando l'immunoblotting o la qRT-PCR.
    7. Infettare il LacZ e le cellule knockdown gene-specifiche con 0,5 MOI di HIV-1 come descritto nella sezione 2 e raccogliere le cellule 48 ore dopo l'infezione.
    8. Raccogliere il surnatante da ciascun campione e processare per p24-ELISA come descritto in precedenza ed elaborare le cellule per controllare il livello di knockdown mediante immunoblotting.

6. Trattamento con induttore di stress ER e analisi del suo effetto sulla replicazione dell'HIV-1

NOTA: Per determinare l'effetto della sovrastimolazione di UPR durante la replicazione dell'HIV-1, può essere utilizzata la molecola induttrice farmacologica, Tapsigargina.

  1. Determinazione della percentuale di vitalità cellulare durante il trattamento con Thapsigargin.
    NOTA: La citotossicità di Thapsigargin è determinata dal reagente MTT (vedere Tabella dei materiali).
    1. Seminare 25.000-30.000 cellule CEM-GFP per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti contenente 100 μL di RPMI 1640 completo. Aggiungere 100 nM di Thapsigargin al terreno e incubare a 37 °C in un incubatore.
      NOTA: Le cellule trattate con 1 μL di DMSO sono state prese come controllo del veicolo.
    2. Dopo 48 ore, aggiungere 10 μL di MTT (5 mg/mL) in ciascun pozzetto e incubare al buio per 4 ore per la formazione di cristalli di formazan a 37 °C con il 5% di CO2.
    3. Dopo 4 ore, sciogliere i cristalli utilizzando 100 μL di isopropanolo per formare un colore viola e misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro.
    4. Calcola la percentuale di vitalità cellulare in base all'equazione fornita di seguito
      % vitalità cellulare = (ControlloOD570 - TrattamentoOD570)/ ControlloOD570 x 100
  2. Pre-trattamento di Thapsigargin e analisi della progressione dell'infezione da HIV-1 mediante p24 ELISA.
    1. Seminare 1 milione di cellule CEM-GFP in una piastra a 12 pozzetti contenente 1 mL di RPMI 1640 completo e trattare le cellule con 100 nM di Thapsigargin o 1 μL di DMSO (controllo del veicolo) per 12 ore in un incubatore di CO2 mantenuto a 37 °C. Dopo 12 ore, lavare le cellule con RPMI 1640 completo e infettare con 0,5 MOI di HIV-1 come descritto in precedenza.
    2. Raccogliere le cellule in diversi momenti, ad esempio 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'infezione, per l'immunoblotting.
    3. Raccogliere i surnatanti da ciascun campione ed eseguire l'ELISA p24 come descritto in precedenza.
    4. Tracciare il grafico con la concentrazione di p24 nel campione come asse Y e i rispettivi punti temporali come asse X.
    5. Utilizzando l'immunoblotting, analizzare l'induzione dello stress ER dovuta al trattamento con Thapsigargin misurando il livello di qualsiasi marcatore UPR. Questo studio ha utilizzato HSPA5 come marcatore.

7. Saggio di infettività TZM-bl β-gal per determinare l'effetto dell'UPR sull'infettività del virione

NOTA: Per comprendere il ruolo dell'UPR nell'infettività del virione, il surnatante del knockdown e il trattamento con Thapsigargin, possono essere utilizzati per il test di infettività TZM-bl β-gal come descritto nella sezione 1.2, sulla base della concentrazione di p24 determinata da p24 ELISA.

  1. Infettare le cellule TZM-bl con una concentrazione uguale di p24 da ciascun campione ed eseguire la colorazione β-gal. Conta le cellule blu infette al microscopio con un ingrandimento di 10x per 5 campi casuali.
  2. Prendi una media del conteggio dei 5 campi per ogni campione dai passaggi precedenti.
  3. Calcola il cambio di piega come indicato di seguito:
    Variazione di piega = Numero medio di celle blu nei campioni di prova/Numero medio di celle blu nel campione di controllo.

Risultati

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per studiare in vitro lo stress ER e l'attivazione dell'UPR in seguito all'infezione da HIV-1 nelle cellule T (Figura 2). Questo studio descrive anche i metodi per analizzare la rilevanza funzionale dell'UPR nella replicazione dell'HIV-1 e nell'infettività del virione (Figura 3).

A questo scopo, abbiamo analizzato lo stress ER cau...

Discussione

L'ambito del presente protocollo comprende (i) la gestione degli stock di virus HIV-1 e la misurazione della concentrazione del virus e dell'infettività del virione, (ii) l'infezione delle cellule T con HIV-1 e la valutazione del suo effetto sullo stress ER e sui diversi marcatori di UPR, (iii) l'effetto del knockdown dei marcatori UPR e il loro effetto sull'attività genica guidata da HIV-1 LTR, produzione virale e infettività dei virioni e (iv) sovrastimolazione dell'UPR utilizzando...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Ringraziamo il National Centre for Cell Science, Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India, per il supporto intramurale. AT e AD sono grati per il dottorato di ricerca ricevuto dal National Centre for Cell Science, Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India. DM è grato per la JC Bose National Fellowship di SERB, governo indiano.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

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