JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье мы описываем некоторые установленные методы определения стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активации развернутого белкового ответа (УПО), уделяя особое внимание инфекции ВИЧ-1. В этой статье также описывается набор протоколов для исследования влияния стресса ER/UPR на репликацию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.

Аннотация

Вирусные инфекции могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) из-за аномального накопления белка, что приводит к развернутому белковому ответу (UPR). Вирусы разработали стратегии манипулирования UPR хозяина, но в литературе отсутствует подробное понимание модуляции UPR и ее функционального значения во время инфекции ВИЧ-1. В этом контексте в настоящей статье описываются протоколы, используемые в нашей лаборатории для измерения уровней стресса ER и UPR во время инфекции ВИЧ-1 в Т-клетках, а также влияние UPR на репликацию вируса и инфекционность.

Окрашивание тиофлавином Т (ThT) является относительно новым методом, используемым для обнаружения ER-стресса в клетках путем обнаружения белковых агрегатов. Здесь мы проиллюстрировали протокол окрашивания ThT в инфицированных ВИЧ-1 клетках для выявления и количественного определения ER-стресса. Кроме того, стресс ER также был обнаружен косвенно путем измерения уровней маркеров UPR, таких как BiP, фосфорилированный IRE1, PERK и eIF2α, сплайсинга XBP1, расщепления ATF6, ATF4, CHOP и GADD34 в инфицированных клетках ВИЧ-1, с использованием обычного иммуноблоттинга и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Установлено, что ThT-флуоресценция коррелирует с показателями активации UPR. В данной статье также демонстрируются протоколы анализа влияния стресса ER и модуляции УПО на репликацию ВИЧ-1 с помощью нокдаун-экспериментов, а также использования фармакологических молекул. Влияние УПО на экспрессию/репликацию гена ВИЧ-1 и продукцию вируса анализировали с помощью репортерного анализа люциферазы и ИФА захвата антигена р24 соответственно, тогда как влияние на инфекционность вириона анализировали путем окрашивания инфицированных репортерных клеток. В совокупности этот набор методов обеспечивает всестороннее понимание путей ответа развернутого белка во время инфекции ВИЧ-1, раскрывая его сложную динамику.

Введение

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) характеризуется постепенным снижением количества CD4+ Т-лимфоцитов, что приводит к прогрессирующему провалу иммунного ответа. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) является возбудителем СПИДа. Это оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с двумя копиями РНК на вирион, принадлежащий к семейству ретровирид. Производство высоких концентраций вирусных белков в клетке-хозяине создает чрезмерную нагрузку на механизм сворачивания белка в клетке1. ER является первым компартментом в секреторном пути эукариотических клеток. Он отвечает за производство, изменение и доставку белков к секреторному пути и местам-мишеням внеклеточного пространства. Белки претерпевают многочисленные посттрансляционные изменения и сворачиваются в свою естественную конформацию в ЭР, включая связанное с аспарагином гликозилирование и создание внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей2. Таким образом, в просвете ER присутствуют высокие концентрации белков, которые очень склонны к агрегации и неправильному сворачиванию. Различные физиологические состояния, такие как тепловой шок, микробные или вирусные инфекции, которые требуют усиленного синтеза белка или мутации белка, приводят к стрессу ЭР из-за повышенного накопления белка в ЭР, тем самым нарушая гомеостаз просвета ЭР. Стресс ER активирует сеть высококонсервативных адаптивных путей передачи сигнала, развернутый белковый ответ (UPR)3. UPR используется для восстановления нормального физиологического состояния ER путем выравнивания его развернутой белковой нагрузки и сворачивающей способности. Это вызвано увеличением размера ER и ER-резидентных молекулярных шаперонов и фолдаз, что приводит к повышению способности ER к сворачиванию. UPR также снижает белковую нагрузку ER за счет глобального ослабления синтеза белка на трансляционном уровне и увеличивает клиренс развернутых белков из ER за счет активации ER-ассоциированной деградации (ERAD)4,5.

Стресс ER воспринимается тремя ER-резидентными трансмембранными белками: протеинкиназой R (PKR)-подобной эндоплазматической ретикулумкиназой (PERK), активирующим фактором транскрипции 6 (ATF6) и инозитол-требующим ферментом типа 1 (IRE1). Все эти эффекторы остаются неактивными за счет связывания с шапероном белка теплового шока семейства A (Hsp70) 5 (HSPA5), также известным как связывающий белок (BiP)/78-кДа глюкозорегулируемый белок (GRP78). При стрессе ЭР и накоплении развернутых/неправильно свернутых белков HSPA5 диссоциирует и приводит к активации этих эффекторов, которые затем активируют ряд нижестоящих мишеней, которые помогают в разрешении стресса ЭР и, в экстремальных условиях,способствуют гибели клеток. При диссоциации от HSPA5 PERK аутофосфорилатируется, и его киназная активность активируется7. Его киназная активность фосфорилирует eIF2α, что приводит к трансляционному ослаблению, снижая белковую нагрузку ER8. Однако в присутствии фосфо-эукариотического фактора инициации 2α (eIF2α) нетранслируемые открытые рамки считывания на определенных мРНК, таких как ATF4, становятся предпочтительно транслируемыми, регулируя стресс-индуцированные гены. ATF4 и гомологичный белок C/EBP (CHOP) являются факторами транскрипции, которые регулируют гены, вызванные стрессом, и регулируют пути апоптоза и гибели клеток 9,10. Одной из мишеней ATF4 и CHOP является белок, вызывающий остановку роста и индуцируемый повреждением ДНК (GADD34), который вместе с протеинфосфатазой 1 дефосфорилирует peIF2α и действует как регулятор обратной связи для трансляционного ослабления11. Под воздействием ER-стресса ATF6 диссоциирует от HSPA5, и его сигнал локализации по Гольджи подвергается воздействию, что приводит к его транслокации в аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи ATF6 расщепляется протеазой сайта-1 (S1P) и протеазой сайта-2 (S2P) с высвобождением расщепленной формы ATF6 (ATF6 P50). Затем ATF6 p50 перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию генов, участвующих в сворачивании, созревании и секреции белка, а также в деградации белка12,13. Во время ER-стресса IRE1 диссоциирует от HSPA5, мультимеризуется и аутофосфорилируется14. Фосфорилирование IRE1 активирует его РНКазный домен, в частности, опосредуя сплайсинг 26 нуклеотидов из центральной части мРНК X-box-связывающего белка 1 (XBP1)15,16. Это приводит к образованию нового С-конца, придающего трансактивационную функцию, генерируя функциональный белок XBP1s, мощный транскрипционный фактор, контролирующий несколько генов, индуцированных стрессом ER17,18. Совместная активность этих транскрипционных факторов включается генетическими программами, направленными на восстановление гомеостаза ЭР.

Существуют различные методы определения напряжения ER и UPR. К ним относятся традиционные методы анализа маркеров УПО19,20. К различным нетрадиционным методам относятся измерение окислительно-восстановительного состояния UPR и распределения кальция в просвете ER, а также оценка структуры ER. Электронная микроскопия может быть использована для того, чтобы увидеть, насколько увеличивается просвет ER в ответ на стресс ER в клетках и тканях. Однако этот метод занимает много времени и зависит от наличия электронного микроскопа, который может быть доступен не каждой исследовательской группе. Кроме того, измерение потока кальция и окислительно-восстановительного состояния ЭР является сложной задачей из-за доступности реагентов. Кроме того, результаты этих экспериментов очень чувствительны и могут быть подвержены влиянию других факторов клеточного метаболизма.

Мощным и простым методом мониторинга выходов УПО является измерение активации различных сигнальных путей УПО, который десятилетиями использовался в различных сценариях стресса. Эти традиционные методы измерения активации УПО экономичны, осуществимы и предоставляют информацию за меньшее время по сравнению с другими известными методами. К ним относятся иммуноблоттинг для измерения экспрессии маркеров UPR на белковом уровне, таких как фосфорилирование IRE1, PERK и eIF2α, и расщепление ATF6 путем измерения P50-формы ATF6 и экспрессии белков других маркеров, таких как HSPA5, сплайсированный XBP1, ATF4, CHOP и GADD34, а также ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК, а также сплайсинг мРНК XBP1.

В данной статье описывается валидированный и надежный набор протоколов для мониторинга стресса ER и активации УПО в инфицированных клетках ВИЧ-1, а также для определения функциональной значимости УПО в репликации и инфекционности ВИЧ-1. В протоколах используются легкодоступные и экономичные реагенты и предоставляется убедительная информация о выходах УПО. Стресс ER является результатом накопления развернутых/неправильно свернутых белков, которые склонны к образованию белковых агрегатов21. Мы описываем способ обнаружения этих белковых агрегатов в ВИЧ-1-инфицированных клетках. Окрашивание тиофлавином Т является относительно новым методом, используемым для обнаружения и количественного определения этих белковых агрегатов. Берио и Верштук описали этот метод для обнаружения и количественного определения белковых агрегатов и, следовательно, уровней стресса ER в живых клетках. Было продемонстрировано, что малая флуоресцентная молекула тиофлавина Т (ThT) избирательно связывается с белковыми агрегатами, особенно амилоидными фибриллами.

В этой статье мы описываем использование ThT для обнаружения и количественной оценки ER-стресса в инфицированных клетках ВИЧ-1 и соотносим его с традиционным методом мониторинга UPR путем измерения активации различных сигнальных путей UPR.

Поскольку также отсутствует исчерпывающая информация о роли УПО во время инфицирования ВИЧ-1, мы предоставляем набор протоколов для понимания роли УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вириона. Эти протоколы включают лентивирус-опосредованный нокдаун маркеров УПО, а также лечение фармакологическими индукторами стресса ER. В этой статье также показаны типы считывания, которые могут быть использованы для измерения экспрессии гена ВИЧ-1, вирусной продукции, а также инфекционности производимых вирионов, такие как анализ люциферазы на основе длинных терминальных повторов (LTR), иммуноферментный анализ p24 (ИФА) и репортерный анализ окрашивания β-gal соответственно.

Используя большинство из этих протоколов, мы недавно сообщили о функциональном влиянии инфекции ВИЧ-1 на УПО в Т-клетках23, и результаты этой статьи свидетельствуют о надежности описанных здесь методов. Таким образом, в данной статье представлен набор методов для получения исчерпывающей информации о взаимодействии ВИЧ-1 со стрессом ER и активацией УПО.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются клеточные линии HEK-293T и Jurkat J6 (клеточная линия CD4+T), которые были получены из Cell Repository, NCCS, Пуна, Индия; TZM-bl, клеточная линия, полученная из HeLa, которая интегрировала копии генов β-галактозидазы и люциферазы в промотор24 длинного терминального повтора (LTR) HIV-1 и CEM-GFP (другая клеточная линия CD4+ T)25 , были получены из репозитория NIH AIDS Repository, США.

1. Подготовка и хранение запасов вируса ВИЧ-1

  1. Подготовка поголовья вируса ВИЧ-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах, связанных с ВИЧ-1, рекомендуется применять международные рекомендации, связанные с биобезопасностью, которые доступны в руководстве Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC). Работа с вирусом и любые эксперименты с живым вирусом должны проводиться только в соответствующем шкафу биобезопасности, расположенном, по крайней мере, в лаборатории уровня BSL2. Производство инфекционных частиц ВИЧ-1 с использованием набора для трансфекции млекопитающих на основе фосфата кальция описано в этом разделе протокола.
    1. Посейте клетки HEK-293T в чашки диаметром 90 мм с 10 мл полного (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) в контейнере биобезопасности класса II типа A2 и выдерживайте около 12 часов в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C так, чтобы слияние клеток составляло 50%-60%.
    2. На следующий день приготовьте смесь для трансфекции: приготовьте раствор А, содержащий 25 г плазмидной ДНК pNL4.3 (молекулярный клон ВИЧ-1) в стерильном буфере, 86,8 мкл 2 M CaCl 2 и оставшуюся стерильную воду, чтобы получить окончательный объем 700 мкл для каждой пластины. Приготовьте раствор В, содержащий 700 мкл 2x HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS) на 1 тарелку. Затем скорректируйте расчет для общего количества пластин.
    3. Теперь добавьте раствор B к решению A по каплям, непрерывно перемещая решение A. Общий объем трансфекционной смеси теперь составляет 1,4 мл на одну тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное капельное добавление раствора Б к раствору А при непрерывном вихревом приводит к образованию идеальных трансфекционных комплексов.
    4. Инкубируйте эту смесь при комнатной температуре (RT) около 20 минут. Затем медленно добавьте смесь по каплям в каждую тарелку, содержащую свежие 9 мл полного DMEM, и перенесите пластины в инкубатор CO2 . Через 8-10 ч смените имеющийся носитель на свежий 10 мл готового DMEM.
    5. Через 24 часа после смены среды соберите надосадочную жидкость (содержащую вирусные частицы) со всех планшетов в конические пробирки. Центрифугируйте при давлении 600 x g в течение 5 мин с помощью низкоскоростной настольной центрифуги (Table of Materials) для удаления клеточного мусора.
    6. Перенесите надосадочную жидкость в полиалломерные ультрацентрифужные пробирки и поместите их в поворотный ротор ультрацентрифуги (Таблица материалов). Проверьте вес держателей пробирок на предмет равновесия и при необходимости отрегулируйте с помощью стерильной среды.
    7. Ультрацентрифуга при давлении 1 41 000 x g в течение 2,5 ч при 4 °C. После этого осторожно выньте пробирки и медленно сцедите надосадочную жидкость внутрь шкафа биобезопасности.
    8. К грануле (которая сейчас является концентрированным вирусом) в каждой пробирке добавьте 1 мл неполной среды RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 и проведите энергичное пипетирование, чтобы выбить гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула после ультрацентрифуги практически незаметна невооруженным глазом. Таким образом, необходимо обязательно добавить RPMI 1640 в середину трубки, чтобы гранула была правильно выбита.
    9. Затем добавьте 25 мкл 1 М HEPES pH 7,4 к 1 мл вирусной суспензии. Аквотируйте 50 мкл суспензии на 1,5 мл центрифужных пробирок и сразу же храните их в морозильной камере при температуре -80 °C для длительного хранения.
  2. Количественное определение концентрации вируса и инфекционности вирионов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета инфекционности вируса необходимо сначала количественно определить его концентрацию, что делается с помощью p24 Antigen Capture ELISA (в соответствии с инструкциями производителя и поэтому здесь не описывается; см. Таблицу материалов). Этот процесс дает концентрацию вируса в нанограммах на микролитр (нг/л) запаса, который затем используется для определения числа инфекционного вириона в запасе с помощью следующего эксперимента в репортерных клетках26 TZM-bl.
    1. Подсчитайте и высадите 0,1 x 106 клеток TZM-bl в 24-луночный планшет, используя 500 μл полного DMEM для каждой лунки, и выдержите его в инкубаторе для клеточных культур в течение 10-12 часов.
    2. Убедитесь, что клетки на 50-60% слиты, прежде чем начать инфекцию для количественного определения вируса. Замените существующую среду на 250 мкл свежего полного DMEM в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо держите положительный контроль, чтобы исключить любые экспериментальные неисправности.
    3. Рассчитайте количество стандартного вируса, необходимое для заражения 1 нг, 0,1 нг и 0,01 нг в дубликатах. Добавьте в лунки соответствующее количество вируса и подержите планшет в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 часов.
    4. Дважды промойте ячейки 500 мкл неполного DMEM, а затем добавьте 500 мкл полного DMEM.
    5. Продолжайте процедуру окрашивания β-галлонами через 36 часов после смены среды.
      1. Выбросьте имеющуюся среду и дважды промойте клетки 1 мл PBS. Зафиксируйте ячейки, добавив 500 мкл фиксирующего раствора (0,25% глутаральдегида в PBS) в каждую лунку, и инкубируйте в RT внутри шкафа биобезопасности в течение 5-7 минут.
      2. Приготовьте раствор для окрашивания, как указано в таблице 1. Держите его подальше от света, так как X-gal светочувствительна.
      3. Промойте клетки один раз 1 мл PBS. Налейте на клетки 500 μL свежеприготовленного раствора для окрашивания и инкубируйте при температуре 37 °C в темноте в течение 2-18 часов.
      4. Чтобы остановить реакцию после этого, промойте клетки 500 мкл 3% диметилсульфоксида (ДМСО) в PBS дважды, а затем держите клетки в 500 мкл свежего PBS.
      5. Подсчитайте синие инфицированные клетки (как показано на рисунке 1А) под микроскопом в 10-кратном увеличении для 5 случайных полей. Возьмите среднее значение по 5 полям и умножьте его на коэффициент поля и коэффициент разбавления. Это позволяет количественно определить количество инфекционных частиц вириона в популяции вируса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для планшета с 24 лунками коэффициент поля равен 75.
КомпонентыПодготовкаТребуемый объем
ПБСПриготовьте 1x PBS из запаса 10x PBS14 мл
Ферри-ферроцианид калияРастворите 0,82 г феррицианида калия и 1,06 г ферроцианида калия в 25 мл 1x PBS0,75 мл
Хлорид магния1 М в 1 мл 1x PBS15 μл
Х-галРастворите 30 мг в 0,6 мл N,N-диметилформамида (темного цвета)0,3 мл
Итого = 15 мл

Таблица 1: Список компонентов, необходимых для окрашивания β-gal в ячейках TZM-bl.

2. ВИЧ-1 инфекция Т-клеточных линий

  1. Размораживание и культивирование бессмертной линии Т-клеток. В этом исследовании использовалась клеточная линия CEM-GFP, культивируемая в полной среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 500 мкг/мл G418.
  2. Подсчитайте и возьмите 2 миллиона клеток для каждой временной точки (Неинфицированный, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч). Неинфицированные клетки немедленно соберите центрифугированием при 100 x g в течение 5 мин и добавьте буфер для лизиса клеток (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 0,12 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,5% NP40, 0,5 мМ NaF, 1 мМ DTT), дополненный коктейлем ингибиторов протеазы, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 1x ингибитора фосфатазы (50 мкл для 1-3 млн клеток) или лизом в реагенте тризол (1 мл на 1-3 млн клеток) для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  3. Однократно промойте клетки 1 мл полной среды RPMI 1640, содержащей полибрен (5 мкг/мл) при 100 x g в течение 5 минут при RT. Повторно суспендируйте клетки в 1 мл полной среды.
    Полибрен является катионным полимером, который используется для усиления ретровирусной инфекции в клетках млекопитающих.
  4. Ресуспендируйте 8 миллионов клеток в 1 мл полибрена, содержащей полную среду. Теперь рассчитайте объем вирусного запаса, необходимый для 4 миллионов частиц вириона, добавьте запас вируса и получите общий объем до 2 мл, добавив полную среду. Таким образом, его MOI равен 0,5.
  5. Держите клетки внутри инкубатора CO2 при температуре 37 °C в течение 4 ч, с периодическим простукиванием каждые 30-45 минут.
  6. Через 4 ч раскрутите ячейки и осторожно выбросьте надосадочную жидкость внутрь шкафа биобезопасности с помощью правильных методов утилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, центрифугируйте клетки при 100 x g в течение 5 минут при RT.
  7. Дважды промойте ячейки 1 мл неполной среды. Ресуспендируйте клетки в 8 мл полной среды, доведя ее до 1 млн клеток/мл.
  8. В 6-луночном планшете для культивирования тканей засейте равное количество клеток в необходимое количество лунок и держите планшет в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C.
  9. В течение следующих 4 дней собирайте клетки каждые 24 часа, добавляя буфер для лизиса клеток. Также соберите надосадочную жидкость и сразу же перенесите ее в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  10. Чтобы проверить, произошло ли заражение, проведите ИФА для захвата антигена p24 для всех временных точек. Делайте правильные разбавления для временных точек, т.е. меньшее разведение для начальных временных точек и большее для последующих в диапазоне от 1:50 до 1:500. Отобразите показания на графике, показывающем прогрессирование инфекции (рисунок 1B).

3. Окрашивание тиофлавином Т для определения напряжения ER

  1. Зафиксировать 1 миллион неинфицированных и 0,5 инфицированных MOI клеток CEM-GFP (взятых через 72 ч инфицированных клеток) 200 мкл 4% параформальдегида в PBS в течение 20 мин в режиме ЛТ.
  2. Гранулируйте клетки в дозе 100 x g в течение 5 минут и обрабатывайте 500 μL 0,1 M глицина в течение 5 минут, после чего дважды промывайте 500 μL PBS. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл PBS.
  3. Соберите стеклянные предметные стекла, фильтрующие карты и камеры для образцов. Добавьте 100 μL ресуспендированных клеток в камеры для образцов и вращайте клетки при 1000 x g в течение 4 минут, чтобы приклеить клетки к предметным стеклам в цитоцентрифуге (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования цитоцентрифугой на предметном стекле не будет обездвиженного достаточного количества клеток, если клеточная суспензия будет слишком разбавлена. Клетки могут слипаться и плохо распределяться после цитоцентрифуги, если клеточная суспензия очень концентрирована.
  4. Пермеабилизируйте клетки в течение 10 минут, используя капли 0,1% Triton-X-100 в PBS (достаточно, чтобы покрыть область, где клетки прилипли) и дважды промойте клетки, положив PBS по каплям и протерев PBS салфеткой, наклонив предметное стекло.
  5. Инкубируйте клетки с 10 мкл 5 мкМ тиофлавина Т в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте после инкубации с ThT.
  6. Установите предметные стекла с использованием 5 μл монтажного материала (80% глицерина v/v, 20% PBS v/v и 8 мг/мл 1,4-диазабицикло[2.2.2]октанового числа [DABCO]), установите покровное стекло и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей. Дайте слайдам высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этих этапах следите за тем, чтобы клетки не пересыхали.
  7. Сделайте конфокальные изображения неподвижных клеток с помощью 63-кратной глицериновой иммерсионной линзы на конфокальном микроскопе (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте следующие настройки возбуждения и излучения: GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) и ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый флуоресцентный канал должен визуализироваться последовательно, а не одновременно, чтобы избежать перекрытия каналов. GFP был принят в качестве индикатора ВИЧ-1-инфекции, поскольку клетки CEM-GFP имеют GFP под регуляцией промотора LTR, который воздействует на ВИЧ-1-инфекцию25.
  8. Преобразуйте флуоресцентные изображения в 8-битные перед количественной оценкой с помощью порогового анализа. Количественно оцените интенсивность каждой ячейки вручную с помощью программного обеспечения, такого как Image J (~50 клеток)27. Постройте график с интенсивностью каждой клетки в виде точек на оси Y по неинфицированным и инфицированным критериям.
  9. Чтобы продемонстрировать эффективность данного протокола, возьмем положительный контроль, например, лечение Тапсигаргином (известным индуктором стресса ER) в данном случае28. Обработайте 1 миллион клеток CEM-GFP, каждая с 1 мкл ДМСО (контроль транспортного средства) и 100 нМ тапсигаргина в течение 12 ч.
  10. Соберите клетки и обработайте их для окрашивания ThT, как указано для инфицированных образцов (шаги 3.1-3.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих образцов флуоресценция GFP не требуется. Следовательно, в конфокальной микроскопии регистрируется только флуоресценция ThT.

4. Определение активации и экспрессии различных маркеров УПО

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения экспрессии маркеров UPR используются два метода: иммуноблоттинг и ОТ-ПЦР. Для иммуноблоттинга собирают 0,5 инфицированных MOI ВИЧ-1 клеток CEM-GFP в различные моменты времени после заражения (через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после заражения) и ресуспендируют клеточную гранулу в буфере для лизиса (как указано на шаге 2.2). В качестве альтернативы, для ОТ-ПЦР клеточные гранулы лизируют в реагенте Тризол (1 мл на 1-3 млн клеток) (см. таблицу материалов). Клетки, ресуспендированные в буфере для лизиса и реагенте Тризол, могут храниться при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

  1. Иммуноблоттинг для анализа маркеров UPR.
    1. Ресуспендированные клетки держать в буфере для лизиса на льду в течение 45 минут с прерывистым перемешиванием с помощью вихря.
    2. Гранулируйте ячейки при давлении 18000 x g в течение 15 минут с помощью настольной высокоскоростной центрифуги (см. Таблицу материалов). Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
    3. Количественно оцените концентрацию белка в каждом образце с помощью реагента Брэдфорда или аналогичного реагента.
    4. Возьмите одинаковую концентрацию белка для каждого образца и приготовьте образцы белка в буфере Laemmli (6x буфер: 250 мМ Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% глицерина и 0,02% бромофенолового синего; 5% β-меркаптоэтанол).
      Примечание: Для иммуноблоттинга для каждого маркера UPR использовали минимум 60-80 мкг белка.
    5. Отварите образцы белка при температуре 96 °C в течение 5 минут и дайте короткому отжиму.
    6. Разрешите образцы белка на 10%-12% геле SDS-PAGE и перенесите белки на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) (см. Таблицу материалов).
    7. Вмешайте в 5% обезжиренное сухое молоко или бычий сывороточный альбумин (БСА) в течение 1-2 ч, дважды промойте TBST (20 мМ Tris pH7,4 и 0,137 М NaCl; 0,1% Tween 20) и прозондируйте белково-специфическими первичными антителами против маркеров UPR (см. Таблицу материалов) в коромысле в течение ночи при 4 °C. На следующий день после двукратного промывания блоттинга TBST зонд с соответствующими вторичными антителами в течение 1,5 ч.
    8. Снова промойте блоттинг с помощью TBST и визуализируйте белковые полосы с помощью субстрата, детектирующего хемилюминесценцию (см. Таблицу материалов) в вестерн-блоттинге.
  2. ОТ-ПЦР
    1. Выделите общую РНК из клеток с помощью реагента Тризол (см. Таблицу материалов).
    2. Получить кДНК из равной концентрации РНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV-RT) (см. Таблицу материалов).
    3. Проанализируйте модуляцию экспрессии мРНК HSPA5, сплайсированных XBP1, ATF4, CHOP и GADD34 с помощью qRT-PCR с ген-специфичными праймерами (табл. 2). Кратко приготовьте 10 мкл реакционных смесей, содержащих матрицу кДНК (100 нг), 5 мкл красителя SYBR Green (см. Таблицу материалов) и по 10 пмоль каждой ген-специфичной пары олигонуклеотидных праймеров. Отрегулируйте громкость с помощью стерильного H2O.
    4. Запустите смеси на ПЦР-машине в реальном времени с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин и 40 циклов при 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с с последующим анализом кривой расплава. Рассчитайте кратное изменение экспрессии целевого гена относительно домашнего гена (например, β-Актина) следующим образом:
      Изменение складки = 2-Δ(ΔCT)
      Где ΔCT = CT (мишень) − CT (ген, отвечающий за ведение хозяйства)
      и Δ(ΔCT) = ΔCT (обработанный) -ΔCT (контроль)
    5. Для дальнейшего подтверждения сплайсинга XBP1 проведите полуколичественную ОТ-ПЦР с неинфицированными и инфицированными через 72 ч образцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сплайсинг мРНК XBP-1 изучают с помощью ОТ-ПЦР по сайту сплайсинга.
    6. Амплифицируют кДНК праймерами XBP1 (Таблица 2) с использованием высокоточной мастер-смеси ПЦР (см. Таблицу материалов) в следующих условиях: 1 цикл при 98 °C в течение 30 с, затем 5 циклов при 98 °C в течение 15 с, 65*Δ-5 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, а затем 30 циклов при 98 °C в течение 15 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, после чего следует окончательное продление до 72 °C в течение 10 мин и выдержка при 4 °C.
    7. Разделите ампликоны на 2,5% агарозном геле, содержащем 50 нг бромида этидия/мл, и визуализируйте в гелевом инструменте. Сплайсированная полоса XBP1 меньше на 26 нуклеотидов.

5. Нокдаун маркеров UPR и анализ экспрессии генов HIV-1 LTR и продукции вируса

  1. Подготовка конструкций shRNA для нокдауна UPR-маркеров
    1. Создание конструкций shRNA с использованием векторной основы pLKO.1-TRC (вектор клонирования лентивируса)29.
    2. Создайте две конструкции shRNA для каждого гена (IRE1, PERK, ATF6 и HSPA5). Смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мРНК соответствующего гена, разработаны консорциумом RNAi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (табл. 3).
      Примечание: Аналогичным образом, конструкции shRNA могут быть созданы для других маркеров UPR.
    3. Отжигните капсюли (по 100 нМ в прямом и обратном направлении) при температуре 95 °C с последующим постепенным охлаждением до RT.
    4. Затем лигируйте его на сайты Age1 и EcoRI вектора pLKO.1 с помощью ДНК-лигазы T4 (см. Таблицу материалов). Подтвердите последовательность с помощью секвенирования ДНК.
      Примечание: Конструкция shRNA, нацеленная на ген LacZ, используется в качестве нецелевого контроля.
  2. Нокдаун PERK, ATF6, IRE1 и HSPA5 в клетках HEK-293T, анализ на люциферазу и ИФА p24
    1. Приготовьте смесь шРНК-конструкта (0,9 мкг) и трансфективного реагента, такого как полиэтиленимин (ПЭИ) (3 мкл ПЭИ на 1 мкг ДНК) (см. Таблицу материалов) в 50 мкл среды, не содержащей сыворотки, путем вортексирования и инкубируйте в течение 20 мин.
    2. Из конфлюентных клеток HEK-293T, содержащих колбу, трипсинизируют и затравливают ~0,25 x 106 клеток вместе с трансфекционной смесью в 24-луночном планшете, что составляет общий объем 125 μL и инкубируют в течение 6 часов при 37 °C в инкубаторе CO2 . Этот метод называется обратной трансфекцией, при котором клетки засеваются вместе с трансфекционной смесью.
    3. Через 6 ч добавьте в лунки 125 мкл готовой среды и повторно суспендируйте ячейки для равномерного посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с нокдауном обратная трансфекция (шаги 5.2.1-5.2.3) обеспечивает лучшую эффективность как с shRNA, так и с миРНК.
    4. Через 24 ч выполните повторную трансфекцию. Приготовьте смесь конструкций pNL4-3 (100 нг), pLTR-Luc (100 нг) и pEGFP-N1 (50 нг) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) с PEI (3 мкл PEI на 1 г ДНК) в 50 мкл неполной среды путем вортексирования. Инкубируйте смесь в течение 20 минут при RT. Замените существующую среду 250 μл свежей неполной среды и добавьте смесь в ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репортерный вектор для HIV-1 LTR был разработан путем субклонирования LTR из pU3RIII30,31 в pGL3basic в лабораторных условиях ранее32. Экспрессия GFP с использованием pEGFP-N1 была использована для нормализации эффективности трансфекции32.
    5. Смените среду через 6 ч после трансфекции 500 мкл полной DMEM. Забор клеток через 36 ч для иммуноблоттинга и анализа люциферазы.
    6. Для анализа люциферазы гранулируют клетки и ресуспендируют в коммерчески закупаемом субстрате люциферазы (50 мкл) (см. Таблицу материалов). Добавьте ресуспензионный лизат клеток в непрозрачную 96-луночную пластину и инкубируйте в течение 10-15 минут. Получите показания люциферазы в люминометре. Также измерьте флуоресценцию GFP в тех же образцах для нормализации показаний люциферазы в микропланшетном микромодальном считывателе планшетов (Ex: 494 нм, Em: 519 нм).
    7. Постройте график в виде единицы люциферазы/GFP по оси Y.
      Примечание: Следует проверить нокдаун соответствующих маркеров UPR, и это можно сделать либо с помощью иммуноблоттинга, либо с помощью qRT-ПЦР с использованием ген-специфических антител или праймеров, соответственно.
    8. Соберите надосадочную жидкость для обработки для p24 ELISA, как упоминалось выше.
  3. Создание стабильных клеток с нокдауном маркеров UPR и инфекцией ВИЧ-1.
    1. Частицы лентивируса получают путем трансфекции клеток HEK-293T, посеянных в 6-луночный планшет, с соответствующими конструкциями шРНК (1 мкг) вместе с pMD2.G (вектор оболочки VSV-G) (0,75 мкг) и psPAX2 (лентивирусная упаковочная плазмида) (0,25 мкг) (см. Таблицу материалов) с использованием ПЭИ в соотношении 1 мкг ДНК: 3 мкл ПЭИ. Приготовьте смесь в 100 μл неполного DMEM и инкубируйте в течение 20 мин при RT. Добавьте смесь к 1,8 мл готовой среды в высеянных клетках HEK-293T.
      Примечание: Высевайте клетки HEK-293T в 6-луночной тарелке не менее чем за 12 часов до трансплантации до тех пор, пока они не приобретут морфологию и не станут примерно на 60-70% конфлюентными.
    2. Через 24 ч после трансфекции добавьте 1 мл полного DMEM в каждую лунку.
    3. Соберите надосадочную жидкость через 48 ч, храните при температуре -80 °C в морозильной камере и выполните p24 ELISA для подтверждения наличия вируса в этих надосадочных зонтах. Используйте этот необработанный лентивирусный надосадочный агент для трансдуцирования клеток J6.
    4. Инкубируйте 2 миллиона клеток в 6-луночном планшете с равным объемом лентивирусной надосадочной жидкости (500 мкл) для каждого контрольного и ген-специфичного нокдаун-лентивируса и добавьте свежую полную среду RPMI 1640 в присутствии полибрена (5 мкг/мл) для увеличения объема до 2 мл.
    5. Через 24 ч добавьте пуромицин (1 мкг/мл) в каждую лунку, чтобы выбрать стабильные клетки. После добавления Пуромицина гранулируйте клетки каждые 24 ч и добавьте 2 мл свежей среды с Пуромицином.
    6. Делайте это до тех пор, пока не произойдет гибель клеток (~1 неделя). Выжившие клетки – это стабильные клетки с нужным нокдауном гена.
      Примечание: Нокдаун соответствующих генов может быть проверен через равные промежутки времени и, наконец, когда в пуромицин-содержащих средах видны только выжившие клетки, с помощью иммуноблоттинга или qRT-PCR.
    7. Инфицируйте LacZ и ген-специфические нокдаун-клетки 0,5 MOI ВИЧ-1, как описано в разделе 2, и собирайте клетки через 48 ч после заражения.
    8. Соберите надосадочную жидкость из каждого образца и обработайте p24-ELISA, как описано ранее, и обработайте клетки для проверки уровня нокдауна с помощью иммуноблоттинга.

6. Лечение индуктором стресса ER и анализ его влияния на репликацию ВИЧ-1

Примечание: Для определения эффекта гиперстимуляции УПО во время репликации ВИЧ-1 можно использовать молекулу фармакологического индуктора Тапсигаргин.

  1. Определение процента жизнеспособности клеток при лечении Тапсигаргином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность тапсигаргина определяется реагентом МТТ (см. Таблицу материалов).
    1. Засейте 25 000-30 000 ячеек CEM-GFP на лунку в 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл полного RPMI 1640. Добавьте 100 нМ Тапсигаргина в среду и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе.
      Примечание: Клетки, обработанные 1 мкл ДМСО, были взяты в качестве контрольных носителей.
    2. Через 48 ч добавьте по 10 мкл МТТ (5 мг/мл) в каждую лунку и инкубируйте в темноте в течение 4 ч для образования кристаллов формазана при 37 °C с 5%CO2.
    3. Через 4 ч растворите кристаллы с помощью 100 мкл изопропанола до получения фиолетового цвета и измерьте поглощение на длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра.
    4. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток на основе уравнения, приведенного ниже
      % жизнеспособности клеток = (КонтрольOD570 - ЛечениеOD570) / КонтрольOD570 x 100
  2. Предварительное лечение тапсигаргином и анализ прогрессирования ВИЧ-1-инфекции методом p24 ИФА.
    1. Засейте 1 миллион клеток CEM-GFP в 12-луночный планшет, содержащий 1 мл полного RPMI 1640, и обработайте клетки 100 нМ тапсигаргина или 1 мкл ДМСО (контроль транспортного средства) в течение 12 ч в инкубаторе CO2 при температуре 37 °C. Через 12 ч промойте клетки полным RPMI 1640 и инфицируйте 0,5 MOI ВИЧ-1, как описано ранее.
    2. Собирайте клетки в разные моменты времени, например, через 24 часа, 48 часов и 72 часа после заражения, для иммуноблоттинга.
    3. Соберите надосадочную жидкость из каждого образца и проведите ИФА p24, как описано ранее.
    4. Постройте график с концентрацией p24 в образце по оси Y и соответствующими временными точками по оси X.
    5. С помощью иммуноблоттинга проанализировать индукцию стресса ER из-за лечения тапсигаргином путем измерения уровня любых маркеров UPR. В этом исследовании в качестве маркера использовался HSPA5.

7. Анализ инфекционности TZM-bl β-gal для определения влияния UPR на инфекционность вирионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять роль УПО в инфекционности вириона, надосадочная жидкость из нокдауна, а также лечение Тапсигаргином могут быть использованы для анализа инфекционности TZM-bl β-gal, как описано в разделе 1.2, на основе концентрации p24, определенной с помощью p24 ELISA.

  1. Заражайте клетки TZM-bl с равной концентрацией p24 из каждого образца и проводите окрашивание β-gal. Подсчитайте синие зараженные клетки под микроскопом в 10-кратном увеличении для 5 случайных полей.
  2. Возьмите среднее значение количества 5 полей для каждой выборки из описанных выше шагов.
  3. Рассчитайте изменение сгиба, как указано ниже:
    Изменение кратности = Среднее количество синих клеток в тестовых образцах/Среднее количество синих клеток в контрольном образце.

Результаты

В данной работе мы описали подробный протокол изучения стресса ER in vitro и активации UPR при инфицировании ВИЧ-1 в Т-клетках (рис. 2). В этом исследовании также описаны методы анализа функциональной значимости УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вири...

Обсуждение

Сфера применения настоящего протокола включает в себя: (i) обработку запасов вируса ВИЧ-1 и измерение концентрации вируса и инфекционности вириона, (ii) инфицирование Т-клеток ВИЧ-1 и оценку его влияния на стресс ER и различные маркеры УПО, (iii) влияние нокдауна маркеров УПО...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим Национальный центр клеточных наук Департамента биотехнологии правительства Индии за внутреннюю поддержку. AT и AD благодарны за поддержку докторских исследований, полученную от Национального центра клеточных наук, Департамента биотехнологии правительства Индии. DM выражает благодарность за Национальную стипендию JC Bose от SERB, правительство Индии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

Ссылки

  1. Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

ERUPRHIV 1TT ThTUPRBiPIRE1PERKEIF2XBP1ATF6ATF4CHOPGADD341

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены