JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

Özet

Viral enfeksiyonlar, anormal protein birikimi nedeniyle Endoplazmik Retikulum (ER) stresine neden olarak Katlanmamış Protein Yanıtına (UPR) yol açabilir. Virüsler konak UPR'yi manipüle etmek için stratejiler geliştirmiştir, ancak literatürde UPR modülasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki fonksiyonel önemi hakkında ayrıntılı bir anlayış eksikliği vardır. Bu bağlamda, bu makalede, T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonu sırasında ER stres düzeylerini ve UPR'yi ölçmek için laboratuvarımızda kullanılan protokoller ve UPR'nin viral replikasyon ve enfektivite üzerindeki etkisi anlatılmaktadır.

Thioflavin T (ThT) boyama, protein agregatlarını tespit ederek hücrelerdeki ER stresini tespit etmek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir. Burada, ER stresini tespit etmek ve ölçmek için HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ThT boyama protokolünü gösterdik. Ayrıca, ER stresi, konvansiyonel immünoblotlama ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak, HIV-1 ile enfekte hücrelerde BiP, fosforile IRE1, PERK ve eIF2α gibi UPR belirteçlerinin seviyeleri, XBP1'in eklenmesi, ATF6, ATF4, CHOP ve GADD34'ün bölünmesi ile dolaylı olarak da tespit edildi. ThT-floresansının UPR aktivasyonunun göstergeleri ile ilişkili olduğunu bulduk. Bu makale ayrıca, ER stresi ve UPR modülasyonunun HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisini, nakavt deneyleri ve farmakolojik moleküllerin kullanımı ile analiz etmek için protokolleri göstermektedir. UPR'nin HIV-1 gen ekspresyonu/replikasyonu ve virüs üretimi üzerindeki etkisi sırasıyla Luciferaz raportör testleri ve p24 antijen yakalama ELISA ile analiz edilirken, virion enfektivitesi üzerindeki etkisi enfekte raportör hücrelerin boyanması ile analiz edildi. Toplu olarak, bu yöntem seti, HIV-1 enfeksiyonu sırasında Katlanmamış Protein Yanıt yollarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve karmaşık dinamiklerini ortaya çıkarır.

Giriş

Edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS), CD4 + T lenfositlerinin sayısında kademeli bir azalma ile karakterizedir, bu da immün yanıtın ilerleyici başarısızlığına yol açar. İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1), AIDS'in etken maddesidir. Zarflı, pozitif anlamlı, virion başına iki RNA kopyası olan tek sarmallı bir RNA virüsüdür ve retroviridae ailesine aittir. Konak hücre içinde yüksek konsantrasyonlarda viral proteinlerin üretilmesi, hücrenin protein katlama mekanizmasına aşırı stres uygular1. ER, ökaryotik hücrelerin salgı yolundaki ilk bölmedir. Proteinlerin üretilmesinden, değiştirilmesinden ve salgı yoluna ve hücre dışı boşluk hedef bölgelerine iletilmesinden sorumludur. Proteinler çok sayıda translasyon sonrası değişikliğe uğrar ve asparagine bağlı glikosilasyon ve moleküller arası ve moleküller arası disülfür bağlarınınoluşturulması dahil olmak üzere ER'de doğal konformasyonlarına katlanırlar 2. Bu nedenle, ER lümeninde yüksek konsantrasyonlarda protein bulunur ve bunlar agregasyona ve yanlış katlanmaya çok eğilimlidir. Gelişmiş protein sentezi veya protein mutasyonu gerektiren ısı şoku, mikrobiyal veya viral enfeksiyonlar gibi çeşitli fizyolojik durumlar, ER'de artan protein birikimi nedeniyle ER stresine yol açar ve böylece ER lümen homeostazını bozar. ER stresi, yüksek oranda korunmuş adaptif sinyal iletim yollarından oluşan bir ağı, Katlanmamış Protein Tepkisi (UPR)3 aktive eder. UPR, katlanmamış protein yükünü ve katlanma kapasitesini hizalayarak normal ER fizyolojik durumunu geri getirmek için kullanılır. Bu, ER boyutunun ve ER'de yerleşik moleküler şaperonların ve foldazların arttırılmasıyla sağlanır ve bu da ER'nin katlanma kabiliyetinin artmasına neden olur. UPR ayrıca, translasyonel seviyede küresel protein sentezi zayıflaması yoluyla ER'nin protein yükünü azaltır ve ER ile ilişkili bozunmayı (ERAD) yukarı regüle ederek katlanmamış proteinlerin ER'den temizlenmesini artırır4,5.

ER stresi, ER'de yerleşik üç transmembran protein tarafından algılanır: Protein kinaz R (PKR) benzeri endoplazmik retikulum kinaz (PERK), Aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) ve İnositol gerektiren enzim tip 1 (IRE1). Tüm bu efektörler, bağlayıcı protein (BiP)/78-kDa glikoz regüle protein (GRP78) olarak da bilinen şaperon Isı şoku protein ailesi A (Hsp70) üyesi 5'e (HSPA5) bağlanarak inaktif tutulur. ER stresi ve katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi üzerine, HSPA5 ayrışır ve bu efektörlerin aktivasyonuna yol açar, bu daha sonra ER stresinin çözülmesine yardımcı olan ve aşırı koşullarda hücre ölümünü teşvik eden bir dizi aşağı akış hedefini aktive eder6. HSPA5'ten ayrışma üzerine, PERK otofosforilatlar ve kinaz aktivitesi aktive edilir7. Kinaz aktivitesi eIF2α'yı fosforile eder, bu da translasyonel zayıflamaya yol açarak ER8'in protein yükünü düşürür. Bununla birlikte, fosfo-ökaryotik başlatma faktörü 2α (eIF2α) varlığında, spesifik mRNA'lar üzerindeki çevrilmemiş açık okuma çerçeveleri, strese bağlı genleri düzenleyen ATF4 gibi tercihli olarak çevrilir. ATF4 ve C/EBP homolog proteini (CHOP), strese bağlı genleri düzenleyen ve apoptoz ve hücre ölüm yolaklarını düzenleyen transkripsiyon faktörleridir 9,10. ATF4 ve CHOP'un hedeflerinden biri, protein fosfataz 1 defosforilat peIF2α ile birlikte ve translasyonel zayıflama11 için bir geri besleme düzenleyicisi olarak işlev gören büyüme durdurma ve DNA hasarına neden olan proteindir (GADD34). ER stresi altında, ATF6, HSPA5'ten ayrışır ve Golgi lokalizasyon sinyali açığa çıkar, bu da Golgi aygıtına translokasyonuna yol açar. Golgi aygıtında ATF6, ATF6'nın (ATF6 P50) parçalanmış formunu serbest bırakmak için bölge-1 proteaz (S1P) ve site-2 proteaz (S2P) tarafından parçalanır. ATF6 p50 daha sonra çekirdeğe translokasyon yapar, burada protein katlanması, olgunlaşması ve salgılanmasının yanı sıra protein bozunması12,13 ile ilgili genlerin ekspresyonunu indükler. ER stresi sırasında, IRE1 HSPA5'ten ayrışır, multimerleşir ve14'ü oto-fosforile eder. IRE1'in fosforilasyonu, RNaz alanını aktive eder, spesifik olarak X-box bağlayıcı protein 1'in (XBP1) mRNA'sının merkezi kısmından 26 nükleotidin eklenmesine aracılık eder15,16. Bu, transaktivasyon fonksiyonu sağlayan yeni bir C-terminali oluşturur ve birkaç ER stresinin neden olduğu geni kontrol eden güçlü bir transkripsiyon faktörü olan fonksiyonel XBP1s proteini üretir17,18. Bu transkripsiyon faktörlerinin birleşik aktivitesi, ER homeostazını geri yüklemeyi amaçlayan genetik programları açar.

ER stresini ve UPR'yi tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar, UPR belirteçlerini19,20 analiz etmek için geleneksel yöntemleri içerir. Çeşitli konvansiyonel olmayan yöntemler, UPR'nin redoks durumunun ve ER lümenindeki kalsiyum dağılımının ölçülmesinin yanı sıra ER yapısının değerlendirilmesini içerir. Elektron mikroskobu, hücrelerde ve dokularda ER stresine yanıt olarak ER lümeninin ne kadar büyüdüğünü görmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve her araştırma grubu için mevcut olmayabilecek bir elektron mikroskobunun mevcudiyetine bağlıdır. Ayrıca, reaktiflerin mevcudiyeti nedeniyle kalsiyum akışının ve ER'nin redoks durumunun ölçülmesi zordur. Ayrıca, bu deneylerden elde edilen okuma çok hassastır ve hücresel metabolizmanın diğer faktörlerinden etkilenebilir.

UPR çıkışlarını izlemek için güçlü ve basit bir teknik, UPR'nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçmektir ve onlarca yıldır çeşitli stres senaryolarında kullanılmaktadır. UPR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan bu geleneksel yöntemler ekonomiktir, uygulanabilirdir ve bilinen diğer yöntemlere kıyasla bilgileri daha kısa sürede sağlar. Bunlar, IRE1, PERK ve eIF2α'nın fosforilasyonu gibi protein düzeyinde UPR belirteçlerinin ekspresyonunu ölçmek için immünoblotlamayı ve ATF6'nın bölünmesini ve HSPA5, eklenmiş XBP1, ATF4, CHOP ve GADD34 gibi diğer belirteçlerin protein ekspresyonunu ölçerek ve ayrıca mRNA seviyelerini ve XBP1 mRNA'nın eklenmesini belirlemek için RT-PCR'yi içerir.

Bu makale, HIV-1 ile enfekte hücrelerde ER stresini ve UPR aktivasyonunu izlemek ve UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve enfektivitesinde fonksiyonel önemini belirlemek için doğrulanmış ve güvenilir bir protokol setini açıklamaktadır. Protokoller, kolayca bulunabilen ve ekonomik reaktifleri kullanır ve UPR çıktıları hakkında ikna edici bilgiler sağlar. ER stresi, protein agregatları oluşturmaya eğilimli olan katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesinin sonucudur21. Burada, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde bu protein agregatlarını tespit etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Thioflavin T boyama, bu protein agregatlarını tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir22. Beriault ve Werstuck, canlı hücrelerde protein agregatlarını ve dolayısıyla ER stres seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için bu tekniği tanımladılar. Küçük floresan molekülü tioflavin T'nin (ThT) seçici olarak protein agregatlarına, özellikle amiloid fibrillere bağlandığı gösterilmiştir.

Bu makalede, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ER stresini tespit etmek ve ölçmek için ThT'nin kullanımını açıklıyoruz ve bunu, UPR'nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçerek geleneksel UPR izleme yöntemiyle ilişkilendiriyoruz.

HIV-1 enfeksiyonu sırasında UPR'nin rolü ile ilgili kapsamlı bilgi eksikliği olduğundan, UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesindeki rolünü anlamak için bir dizi protokol sunuyoruz. Bu protokoller, UPR belirteçlerinin lentivirüs aracılı yıkımının yanı sıra farmakolojik ER stres indükleyicileri ile tedaviyi içerir. Bu makale aynı zamanda HIV-1 gen ekspresyonu, viral üretim ve üretilen viryonların enfektivitesini ölçmek için kullanılabilecek okuma türlerini de göstermektedir, örneğin uzun terminal tekrar (LTR) bazlı lusiferaz testi, p24 enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve β-gal raportör boyama testi.

Bu protokollerin çoğunu kullanarak, yakın zamanda T hücreleri23'te HIV-1 enfeksiyonunun UPR üzerindeki fonksiyonel etkisini bildirdik ve bu makalenin sonuçları burada açıklanan yöntemlerin güvenilirliğini göstermektedir. Bu nedenle, bu makale, HIV-1'in ER stresi ve UPR aktivasyonu ile etkileşimi hakkında kapsamlı bilgi için bir dizi yöntem sunmaktadır.

Protokol

NOT: Burada kullanılan hücre hatları, Cell Repository, NCCS, Pune, Hindistan'dan elde edilen HEK-293T ve Jurkat J6'dır (bir CD4+T hücre hattı); HIV-1 uzun terminal tekrar (LTR) promotörü24 ve CEM-GFP (başka bir CD4 + T muhabir hücre hattı) altında β-galaktosidaz ve lusiferaz genlerinin kopyalarını entegre eden HeLa'dan türetilmiş bir hücre hattı olan TZM-BL, ABD, NIH AIDS Deposu'ndan elde edildi.

1. HIV-1 virüsü stok hazırlama ve depolama

  1. HIV-1 virüsü stok hazırlama
    NOT: HIV-1 içeren tüm deneylerde Dünya Sağlık Örgütü (WHO) veya Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) kılavuzunda bulunan biyogüvenlikle ilgili uluslararası kılavuzların uygulanması tavsiye edilir. Virüsün ele alınması ve canlı virüsle yapılan herhangi bir deney, yalnızca en az BSL2 düzeyinde bir muhafaza laboratuvarında bulunan uygun bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Bir Kalsiyum fosfat memeli transfeksiyon kiti kullanılarak bulaşıcı HIV-1 partiküllerinin üretimi, protokolün bu bölümünde açıklanmaktadır.
    1. HEK-293T hücrelerini, sınıf II tip A2 biyogüvenlik kabininde 10 mL tam (%10 Fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) ile 90 mm'lik tabaklarda tohumlayın ve hücrelerin birleşmesi %50-%60 arasında olacak şekilde 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 12 saat saklayın.
    2. Ertesi gün, transfeksiyon karışımını yapın: Steril tamponda 25 μg pNL4.3 (HIV-1'in moleküler bir klonu) plazmit DNA, 86.8 μL 2 MCaCl2 ve kalan steril su içeren Çözelti A'yı hazırlayın ve nihai hacmi her plaka için 700 μL yapın. 1 plaka için 700 μL 2x HEPES tamponlu salin (HBS) içeren Çözelti B'yi hazırlayın. Ardından, toplam plaka sayısı için hesaplamayı ayarlayın.
    3. Şimdi, Çözüm A'yı sürekli olarak girdaplarken, Çözüm A'ya çözelti A'ya damla damla ekleyin. Transfeksiyon karışımının toplam hacmi şimdi bir plaka için 1.4 mL olur.
      NOT: Sürekli girdaplama sırasında Çözelti B'nin Çözelti A'ya hassas damla bazında eklenmesi, mükemmel transfeksiyon komplekslerinin oluşumuna yol açar.
    4. Bu karışımı oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, karışımı taze 9 mL tam DMEM içeren her bir plakaya yavaşça ekleyin ve plakaları CO2 inkübatöre aktarın. 8-10 saat sonra, mevcut ortamı yeni 10 mL tam DMEM ile değiştirin.
    5. Ortam değişiminden 24 saat sonra, konik tüplerdeki tüm plakalardan süpernatanı (virüs parçacıklarını içeren) toplayın. Hücre kalıntılarını gidermek için düşük hızlı bir masa üstü santrifüj (Malzeme Tablosu) kullanarak 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı poliallomer ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve bunları bir ultrasantrifüjün açılır rotoruna yerleştirin (Malzeme Tablosu). Tüp tutucuların ağırlıklarını denge açısından kontrol edin ve gerekirse steril bir ortamla ayarlayın.
    7. 1,41,000 ° C'de 2.5 saat boyunca 4 x g'da ultrasantrifüj. Bundan sonra, tüpleri dikkatlice çıkarın ve süpernatanı biyogüvenlik kabininin içinde yavaşça boşaltın.
    8. Her tüpteki pelete (şu anda konsantre virüs olan) 1 mL eksik RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı ekleyin ve peleti çıkarmak için kuvvetli pipetleme yapın.
      NOT: Ultrasantrifüj sonrası pelet çıplak gözle neredeyse görünmezdir. Bu nedenle, peletin düzgün bir şekilde yerinden çıkması için tüpün ortasına RPMI 1640 eklendiğinden emin olunmalıdır.
    9. Daha sonra, 1 mL virüs süspansiyonuna 25 μL 1 M HEPES pH 7.4 ekleyin. Süspansiyonun 50 μL'sini 1,5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve uzun süreli saklama için hemen -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
  2. Virüs konsantrasyonu ve virion enfektivitesinin kantitasyonu
    NOT: Virüsün bulaşıcılığını hesaplamak için, öncelikle p24 Antijen Yakalama ELISA ile yapılan konsantrasyonunu ölçmek önemlidir (üreticinin talimatlarına göre ve bu nedenle burada açıklanmamıştır; Malzeme Tablosuna bakınız). Bu işlem, virüsün konsantrasyonunu stokun mikrolitresi (ng / μL) başına nanogram cinsinden verir ve daha sonra TZM-bl raportör hücrelerinde26 aşağıdaki deney yoluyla stoktaki enfektif virion sayısını tanımlamak için kullanılır.
    1. Her kuyucuk için 500 μL tam DMEM kullanarak 24 oyuklu bir plakada 0.1 x 106 TZM-bl hücreyi sayın ve tohumlayın ve 10-12 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
    2. Virüs ölçümü için enfeksiyona başlamadan önce hücrelerin %50-60 oranında birleştiğinden emin olun. Mevcut ortamı her kuyucuğa 250 μL taze tam DMEM ile değiştirin.
      NOT: Herhangi bir deneysel hatayı ortadan kaldırmak için pozitif bir kontrol kuyusu tutun.
    3. Kopyalar halinde 1 ng, 0.1 ng ve 0.01 ng enfeksiyonları için gereken stok virüs miktarını hesaplayın. Kuyucuklara uygun miktarda virüs ekleyin ve plakayı inkübatörde 37 ° C'de 4 saat tutun.
    4. Hücreleri 500 μL eksik DMEM ile iki kez yıkayın ve ardından 500 μL tam DMEM ekleyin.
    5. Ortam değişiminden 36 saat sonra β gal boyama prosedürüne devam edin.
      1. Mevcut ortamı atın ve hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 500 μL sabitleme solüsyonu (PBS'de %0.25 Glutaraldehit) ekleyerek hücreleri sabitleyin ve biyogüvenlik kabini içinde RT'de 5-7 dakika inkübe edin.
      2. Boyama solüsyonunu Tablo 1'de verildiği gibi hazırlayın. X-gal ışığa duyarlı olduğu için ışıktan uzak tutun.
      3. Hücreleri bir kez 1 mL PBS ile yıkayın. Hücreleri 500 μL taze hazırlanmış boyama solüsyonu ile kaplayın ve karanlıkta 37 ° C'de 2-18 saat inkübe edin.
      4. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için, hücreleri PBS'de 500 μL% 3 dimetil sülfoksit (DMSO) ile iki kez durulayın ve ardından hücreleri 500 μL taze PBS'de tutun.
      5. Mavi enfekte hücreleri ( Şekil 1A'da gösterildiği gibi) mikroskop altında 5 rastgele alan için 10x büyütmeyle sayın. 5 alanın ortalama sayısını alın ve bunu alan faktörü ve seyreltme faktörü ile çarpın. Bu, virüs stoğundaki enfektif virion partiküllerini ölçer.
        NOT: 24 oyuklu bir plaka için alan faktörü 75'tir.
BileşenHazırlıkGerekli hacim
PBS10x PBS'lik bir stoktan 1x PBS hazırlayın14 mL
Potasyum Ferri-ferro siyanür0.82 g Potasyum Ferrisiyanür ve 1.06 g Potasyum Ferrosiyanürü 25 mL 1x PBS'de çözün0,75 mL
Magnezyum klorür1x PBS'nin 1 mL'sinde 1 M15 μL
X-gal (İngilizce)30 mg'ı 0.6 mL N, N-dimetil formamid (karanlıkta) içinde çözün0,3 mL
Toplam = 15 mL

Tablo 1: TZM-bl hücrelerinde β-gal boyama için gerekli bileşenlerin listesi.

2. T hücre hatlarının HIV-1 enfeksiyonu

  1. Ölümsüzleştirilmiş bir T hücresi hattını çözün ve kültürleyin. Bu çalışmada, %10 Fetal sığır serumu, %1 penisilin-streptomisin ve 500 μg/mL G418 ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında kültürlenmiş CEM-GFP hücre hattı kullanılmıştır.
  2. Her zaman noktası için 2 milyon hücre sayın ve alın (Enfekte olmayan, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat). Enfekte olmamış hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyerek hemen hasat edin ve hücre lizis tamponu ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA,% 0.5 NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), proteaz inhibitör kokteyli, 0.5 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 1x fosfataz inhibitörü (1-3 milyon hücre için 50 μL) veya RNA izolasyonu için Trizol reaktifinde (1-3 milyon hücre için 1 mL) lizen (bkz . Malzemeler).
  3. Hücreleri bir kez 1 mL tam RPMI 1640 ortamı ile polibren (5 μg / mL) içeren polibren (5 μg / mL) ile RT'de 5 dakika boyunca yıkayın . Hücreleri 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
    NOT: Polibren, memeli hücrelerinde retroviral enfeksiyonu arttırmak için kullanılan katyonik bir polimerdir.
  4. Tam ortam içeren 1 mL polibrende 8 milyon hücreyi yeniden süspanse edin. Şimdi 4 milyon virion partikülü için gereken viral stok hacmini hesaplayın, virüs stoğunu ekleyin ve tam medya ekleyerek toplam hacmi 2 mL'ye çıkarın. Bu, onu 0,5'lik bir MOI yapar.
  5. Hücreleri CO2 inkübatörünün içinde 4 saat boyunca 37 ° C'de tutun ve her 30-45 dakikada bir aralıklı olarak vurun.
  6. 4 saat sonra, hücreleri döndürün ve süpernatanı uygun imha yöntemleriyle biyogüvenlik kabininin içine dikkatlice atın.
    NOT: Bu adımdan itibaren, hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
  7. Hücreleri 1 mL eksik ortamla iki kez yıkayın. Hücreleri 8 mL tam ortamda yeniden süspanse ederek 1 milyon hücre / mL yapar.
  8. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında, gerekli sayıda oyukta eşit sayıda hücre tohumlayın ve plakayı 37 ° C'de tutulan bir CO2 inkübatöründe tutun.
  9. Önümüzdeki 4 gün boyunca, hücre lizis tamponu ekleyerek hücreleri her 24 saatte bir hasat edin. Ayrıca, süpernatanı toplayın ve hemen -80 °C dondurucuya aktarın.
  10. Enfeksiyonun olup olmadığını kontrol etmek için, tüm zaman noktaları için p24 antijen yakalama ELISA'ya devam edin. Zaman noktaları için uygun seyreltmeler yapın, yani ilk zaman noktaları için daha düşük bir seyreltme ve daha sonrakiler için 1:50 ila 1:500 arasında değişen daha yüksek bir seyreltme yapın. Okumaları, enfeksiyon ilerlemesini gösteren bir grafikte çizin (Şekil 1B).

3. ER stresini belirlemek için tioflavin T boyaması

  1. RT'de 20 dakika boyunca PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ile 1 milyon enfekte olmamış ve 0.5 MOI ile enfekte olmuş CEM-GFP hücresini (72 saat enfekte hücre alınmış) düzeltin.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da peletleyin ve 5 dakika boyunca 500 μL 0.1 M glisin ile muamele edin, ardından iki kez 500 μL PBS ile yıkayın. Hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  3. Cam slaytları, filtre kartlarını ve numune haznelerini birleştirin. 100 μL'lik yeniden süspanse edilmiş hücreleri numune odalarına ekleyin ve hücreleri bir sitosantrifüjdeki slaytlara yapıştırmak için hücreleri 4 dakika boyunca 1000 x g'da döndürün (Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücre süspansiyonu çok seyreltilirse, sitosantrifüj santrifüjasyonunu takiben slayt üzerinde hareketsiz hale getirilmiş yeterli hücre olmayacaktır. Hücre süspansiyonu çok konsantre ise, sitosantrifüjden sonra hücrelerin topaklanması ve zayıf bir şekilde dağılması muhtemeldir.
  4. PBS'de% 0.1 Triton-X-100'lük damlalar kullanarak (hücrelerin yapıştığı alanı kaplayacak kadar) hücreleri 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin ve damla damla PBS koyarak hücreleri iki kez yıkayın ve slaytı eğerek PBS'yi doku ile silin.
  5. Hücreleri 10 μL 5 μM Thioflavin T ile 30 dakika inkübe edin.
    NOT: ThT ile inkübe ettikten sonra yıkamayın.
  6. Slaytları 5 μL montaj ortamı (%80 gliserol v/v, %20 PBS v/v ve 8 mg/mL 1,4-diazabisiklo[2.2.2]oktan [DABCO]) kullanarak monte edin, lamel koyun ve lameli oje kullanarak kapatın. Slaytları kurumaya bırakın.
    NOT: Tüm bu adımlarda hücrelerin kurumadığından emin olun.
  7. Konfokal mikroskopta 63x gliserol daldırma lensi ile sabit hücrelerin konfokal görüntülerini alın (Malzeme Tablosuna bakınız). Aşağıdaki uyarma ve emisyon ayarlarını yapın: GFP (Örn. 494 nm, Em. 519 nm) ve ThT (Örn. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    NOT: Kanal çakışmasını önlemek için her floresan kanalı, aynı anda değil, sırayla görüntülenmelidir. CEM-GFP hücreleri, HIV-1 enfeksiyonu25 üzerine ateşlenen LTR promotörü düzenlemesi altında GFP'ye sahip olduğundan, HIV-1 enfeksiyonunun göstergesi olarak alınmıştır.
  8. Eşik analizi ile nicelemeden önce floresan görüntüleri 8 bit'e dönüştürün. Image J (~ 50 hücre)27 gibi bir yazılım kullanarak her hücrenin yoğunluğunu manuel olarak ölçün. Grafiği, enfekte olmamış ve enfekte olmuş kriterlere karşı Y ekseni üzerinde noktalar olarak her hücrenin yoğunluğu ile çizin.
  9. Bu protokolün etkinliğini göstermek için, örneğin bu durumda Thapsigargin tedavisi (bilinen ER stres indükleyicisi) gibi pozitif bir kontrol uygulayın28. Her biri 1 μL DMSO (araç kontrolü) ve 100 nM Thapsigargin içeren 1 milyon CEM-GFP hücresini 12 saat boyunca tedavi edin.
  10. Hücreleri hasat edin ve enfekte numuneler için belirtildiği gibi ThT boyama işlemini gerçekleştirin (adım 3.1-3.8).
    NOT: Bu numuneler için GFP floresansı gerekli değildir. Bu nedenle, konfokal mikroskopide sadece ThT floresan yakalanır.

4. Çeşitli UPR belirteçlerinin aktivasyonunu ve ekspresyonunu belirleme

NOT: UPR belirteçlerinin ekspresyonunu belirlemek için iki yöntem kullanılır: İmmünoblotlama ve RT-PCR. İmmünoblotlama için, 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte olmuş CEM-GFP hücrelerini enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında (enfeksiyondan 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat sonra) hasat edin ve hücre peletini lizis tamponunda yeniden süspanse edin (adım 2.2'de belirtildiği gibi). Alternatif olarak, RT-PCR için, hücre peletleri Trizol reaktifi (1-3 milyon hücre için 1 mL) içinde parçalanır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Lizis tamponu ve Trizol reaktifi içinde yeniden süspanse edilen hücreler, daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir.

  1. UPR belirteçlerinin analizi için immünoblotlama.
    1. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, bir girdap kullanarak aralıklı karıştırma ile 45 dakika boyunca buz üzerindeki lizis tamponunda tutun.
    2. Tezgah üstü yüksek hızlı santrifüj kullanarak hücreleri 15 dakika boyunca 18000 x g'da peletleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
    3. Bradford veya benzer bir reaktif kullanarak her numunedeki protein konsantrasyonunu ölçün.
    4. Her numune için eşit konsantrasyonda protein alın ve protein numunelerini Laemmli tamponunda hazırlayın (6x tampon: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, %10 SDS, %30 Gliserol ve %0.02 Bromofenol mavisi; %5 β-Merkaptoetanol).
      NOT: Her bir UPR markörü için immünoblotlama için minimum 60-80 μg protein kullanılmıştır.
    5. Protein örneklerini 96 °C'de 5 dakika kaynatın ve kısa bir dönüş yapın.
    6. Protein örneklerini %10-12'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çözün ve proteinleri bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
    7. 1-2 saat boyunca% 5 yağsız kuru süt veya sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin, TBST (20 mM Tris pH7.4 ve 0.137 M NaCl;% 0.1 Tween 20) ile iki kez yıkayın ve UPR belirteçlerine karşı proteine özgü primer antikorlarla problayın (bkz . Malzeme Tablosu) bir külbütörde, gece boyunca 4 ° C'de. Ertesi gün, lekeleri TBST ile iki kez yıkadıktan sonra, 1.5 saat boyunca ilgili ikincil antikorlarla araştırın.
    8. Lekeleri TBST ile tekrar yıkayın ve bir batı lekesi görüntüleme cihazında kemilüminesans tespit eden bir substrat (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak protein bantlarını görselleştirin.
  2. RT PCR
    1. Trizol reaktifi kullanarak hücrelerden toplam RNA'yı izole edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. Moloney Murine Lösemi Virüsü ters transkriptaz (MMLV-RT) kullanarak eşit konsantrasyonda RNA'dan cDNA'yı hazırlayın (bkz.
    3. Gene özgü primerlerle qRT-PCR kullanarak HSPA5, eklenmiş XBP1, ATF4, CHOP ve GADD34'ün mRNA ekspresyonunun modülasyonunu analiz edin (Tablo 2). Kısaca, cDNA şablonu (100 ng), 5 μL SYBR Yeşil boya ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve her bir gene özgü oligonükleotid primer çiftinden 10 pmol içeren 10 μL reaksiyon karışımları hazırlayın. Steril H2O kullanarak ses seviyesini ayarlayın.
    4. Karışımları aşağıdaki programı kullanarak gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın: 3 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon ve 30 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C'de ve ardından eriyik eğrisi analizi. Temizlik genine (örneğin β-Actin) göre hedef gen ekspresyonundaki kıvrım değişikliğini şu şekilde hesaplayın:
      Katlama değişimi = 2-Δ(ΔCT)
      Burada ΔCT = CT (hedef) - CT (temizlik geni)
      ve Δ(ΔCT) = ΔCT (tedavi edilmiş) -ΔCT (kontrol)
    5. XBP1'in eklenmesini daha fazla doğrulamak için, enfekte olmamış ve 72 saat enfekte olmuş numunelerle yarı kantitatif bir RT-PCR gerçekleştirin.
      NOT: XBP-1 mRNA'nın eklenmesi, ekleme bölgesi boyunca RT-PCR kullanılarak incelenir.
    6. Aşağıdaki koşullar altında yüksek kaliteli bir PCR ana karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak cDNA'yı XBP1 primerleri (Tablo 2) ile amplifiye edin: 30 saniye boyunca 98 °C'lik 1 döngü, ardından 15 saniye boyunca 98 °C'lik 5 döngü, 30 saniye boyunca 65*Δ-5 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C, ardından 15 saniye boyunca 98 °C'lik 30 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C, ardından 10 dakika boyunca 72 °C'lik son bir uzatma ve 4 °C'de tutun.
    7. Amplikonları 50 ng etidyum bromür / mL içeren% 2.5'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın ve bir jel doc cihazında görselleştirin. Eklenmiş XBP1 bandı 26 nükleotid ile daha küçüktür.

5. UPR belirteçlerinin yıkılması ve HIV-1 LTR güdümlü gen ekspresyonu ve virüs üretiminin analizi

  1. UPR belirteçlerinin sökülmesi için shRNA yapılarının hazırlanması
    1. pLKO.1-TRC vektör omurgasını (lentiviral klonlama vektörü) kullanarak shRNA yapıları oluşturun29.
    2. Her gen için iki shRNA yapısı oluşturun (IRE1, PERK, ATF6 ve HSPA5). İlgili genin mRNA'sını hedefleyen anlamlı ve anti-anlamlı oligonükleotidler, RNAi Konsorsiyumu (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) tarafından tasarlanmıştır (Tablo 3).
      NOT: Benzer şekilde, diğer UPR belirteçleri için shRNA yapıları yapılabilir.
    3. Primerleri (ileri ve geri her biri 100 nM) 95 °C'de tavlayın ve ardından RT'ye kademeli olarak soğutun.
    4. Ardından, bir T4 DNA ligaz kullanarak pLKO.1 vektörünün Age1 ve EcoRI bölgelerine bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Diziyi DNA dizilimi ile onaylayın.
      NOT: LacZ genini hedefleyen bir shRNA yapısı, hedeflemeyen bir kontrol olarak kullanılır.
  2. HEK-293T hücrelerinde PERK, ATF6, IRE1 ve HSPA5'in yıkılması, Lusiferaz testi ve p24 ELISA
    1. ShRNA yapısı (0.9 μg) ve polietilenimin (PEI) gibi bir transfeksiyon reaktifi (1 μg DNA için 3 μL PEI) (malzeme Tablosuna bakınız) karışımını 50 μL serumsuz ortamda girdaplama yoluyla hazırlayın ve 20 dakika inkübe edin.
    2. Şişe, tripsinize ve tohum ~ 0.25 x 106 hücre içeren birleşik bir HEK-293T hücresinden, 24 oyuklu bir plakada transfeksiyon karışımı ile birlikte, toplam hacmi 125 μL yapar ve bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 6 saat inkübe edilir. Bu yöntem, hücrelerin transfeksiyon karışımı ile birlikte tohumlandığı ters transfeksiyon olarak adlandırılır.
    3. 6 saat sonra, kuyucuklara 125 μL tam ortam ekleyin ve eşit tohumlama için hücreleri yeniden süspanse edin.
      NOT: Knockdown deneyleri için, ters transfeksiyon (adım 5.2.1-5.2.3) hem shRNA'lar hem de siRNA'lar ile daha iyi verimlilik sağlar.
    4. 24 saat sonra ikinci bir transfeksiyon gerçekleştirin. pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) ve pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3: pLTR-Luc: pEGFPN1-1: 1: 0.5) ile PEI (1 μg DNA için 3 μL PEI) ile girdaplama yoluyla 50 μL eksik ortamda. Karışımı RT'de 20 dakika inkübe edin. Mevcut ortamı 250 μL taze eksik ortamla değiştirin ve karışımı hücrelere ekleyin.
      NOT: HIV-1 LTR için bir raportör vektör, LTR'nin daha önce laboratuvarda pU3RIII30,31'den pGL3basic'e32 alt klonlanmasıyla geliştirilmiştir. Transfeksiyon verimliliğini normalleştirmek için pEGFP-N1 kullanılarak GFP ekspresyonukullanıldı 32.
    5. Transfeksiyondan 6 saat sonra 500 μL tam DMEM ile ortamı değiştirin. İmmünoblotlama ve lusiferaz tahlili için hücreleri 36 saat sonra hasat edin.
    6. Lusiferaz tahlili için, hücreleri peletleyin ve ticari olarak tedarik edilen bir lusiferaz substratında (50 μL) yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu). Yeniden süspanse hücre lizatını opak 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve 10-15 dakika inkübe edin. Bir luminometrede lusiferaz okumasını elde edin. Ayrıca, bir mikroplaka mikromod plaka okuyucusunda (Örn: 494 nm, Em: 519 nm) lusiferaz okumasını normalleştirmek için aynı numunelerde GFP floresansını ölçün.
    7. Grafiği Y ekseninde Luciferaz birimi/GFP olarak çizin.
      NOT: İlgili UPR belirteçlerinin yıkılması kontrol edilmelidir ve sırasıyla gen spesifik antikorlar veya primerler kullanılarak immünoblotlama veya qRT-PCR ile yapılabilir.
    8. Yukarıda belirtildiği gibi p24 ELISA için işlenecek süpernatantları toplayın.
  3. UPR belirteçlerinin ve HIV-1 enfeksiyonunun yıkılması ile stabil hücrelerin oluşturulması.
    1. Lentivirus parçacıklarını, pMD2.G (VSV-G zarf vektörü) (0.75 μg) ve psPAX2 (Lentiviral ambalaj plazmidi) (0.25 μg) ile birlikte ilgili shRNA (1 μg) yapıları ile birlikte 6 oyuklu bir plakaya ekilen HEK-293T hücrelerini transfekte ederek hazırlayın (1 μg DNA: 3 μL PEI oranında PEI kullanarak). Karışımı 100 μL eksik DMEM'de hazırlayın ve RT'de 20 dakika inkübe edin. Karışımı, tohumlanmış HEK-293T hücrelerinde 1.8 mL tam ortama ekleyin.
      NOT: HEK-293T hücrelerini, transfeksiyondan en az 12 saat önce, morfoloji kazanana ve yaklaşık% 60-70 birleşim olana kadar 6 oyuklu bir plakada tohumlayın.
    2. 24 saatlik transfeksiyondan sonra, her kuyucuğa 1 mL tam DMEM ekleyin.
    3. Süpernatanları 48 saat sonra toplayın, -80 °C dondurucuda saklayın ve bu süpernatanlarda virüsün varlığını doğrulamak için p24 ELISA uygulayın. J6 hücrelerini dönüştürmek için bu ham lentiviral süpernatanı kullanın.
    4. Her kontrol ve gene özgü knockdown lentivirus için eşit hacimde lentiviral süpernatant (500 μL) ile 6 oyuklu bir plakada 2 milyon hücreyi inkübe edin ve hacmi 2 mL'ye çıkarmak için polibren (5 μg / mL) varlığında taze tam RPMI 1640 ortamı ekleyin.
    5. 24 saat sonra, stabil hücreleri seçmek için her bir oyuğa Puromycin (1 μg / mL) ekleyin. Puromisin ekledikten sonra, hücreleri her 24 saatte bir pelet haline getirin ve Puromisin ile 2 mL taze ortam ekleyin.
    6. Hücre ölümü olmayana kadar (~ 1 hafta) bunu yapın. Hayatta kalan hücreler, istenen gen yıkımına sahip kararlı hücrelerdir.
      NOT: İlgili genlerin yıkılması düzenli aralıklarla kontrol edilebilir ve son olarak, immünoblotlama veya qRT-PCR kullanılarak Puromisin içeren ortamda sadece hayatta kalan hücreler göründüğünde kontrol edilebilir.
    7. LacZ ve gene özgü knockdown hücrelerini, bölüm 2'de açıklandığı gibi 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edin ve hücreleri enfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin.
    8. Her numuneden süpernatanı toplayın ve daha önce tarif edildiği gibi p24-ELISA için işlem yapın ve immünoblotlama ile yıkım seviyesini kontrol etmek için hücreleri işleyin.

6. ER stres indükleyicisi ile tedavi ve HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisinin analizi

NOT: HIV-1 replikasyonu sırasında UPR'nin aşırı uyarılmasının etkisini belirlemek için, farmakolojik indükleyici molekül olan Thapsigargin kullanılabilir.

  1. Thapsigargin tedavisi üzerine hücre canlılığı yüzdesinin belirlenmesi.
    NOT: Thapsigargin'in sitotoksisitesi MTT reaktifi tarafından belirlenir (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. 100 μL tam RPMI 1640 içeren 96 oyuklu plakada kuyu başına 25.000-30.000 CEM-GFP hücresi tohumlayın. Ortama 100 nM Thapsigargin ekleyin ve bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: 1 μL DMSO ile tedavi edilen hücreler araç kontrolü olarak alınmıştır.
    2. 48 saat sonra, her bir oyuğa 10 μL MTT (5 mg / mL) ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile formazan kristallerinin oluşumu için karanlıkta 4 saat inkübe edin.
    3. 4 saat sonra, mor bir renk oluşturmak için 100 μL izopropanol kullanarak kristalleri çözün ve bir spektrofotometre kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.
    4. Aşağıda verilen denkleme göre hücre canlılığı yüzdesini hesaplayın
      % hücre canlılığı = (KontrolOD570 - TedaviOD570)/ KontrolOD570 x 100
  2. Thapsigargin'in ön tedavisi ve p24 ELISA ile HIV-1 enfeksiyonu ilerlemesinin analizi.
    1. 1 mL tam RPMI 1640 içeren 12 oyuklu bir plakada 1 milyon CEM-GFP hücresi tohumlayın ve hücreleri 37 ° C'de tutulan bir CO2 inkübatörde 12 saat boyunca 100 nM Thapsigargin veya 1 μL DMSO (araç kontrolü) ile tedavi edin. 12 saat sonra, hücreleri tam RPMI 1640 ile yıkayın ve daha önce tarif edildiği gibi 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edin.
    2. İmmünoblotlama için hücreleri enfeksiyondan 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra gibi farklı zaman noktalarında hasat edin.
    3. Her numuneden süpernatanları toplayın ve daha önce açıklandığı gibi p24 ELISA gerçekleştirin.
    4. Numunedeki p24 konsantrasyonu Y ekseni ve ilgili zaman noktaları X ekseni olarak grafiği çizin.
    5. İmmünoblotlama kullanarak, herhangi bir UPR markörünün seviyesini ölçerek Thapsigargin tedavisine bağlı ER stres indüksiyonunu analiz edin. Bu çalışmada belirteç olarak HSPA5 kullanılmıştır.

7. UPR'nin virion enfektivitesi üzerindeki etkisini belirlemek için TZM-bl β-gal enfektivite testi

NOT: Virion enfektivitesinde UPR'nin rolünü anlamak için, knockdown'dan elde edilen süpernatant ve Thapsigargin ile tedavi, p24 ELISA tarafından belirlenen p24 konsantrasyonuna dayalı olarak bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi TZM-bl β-gal enfektivite testi için kullanılabilir.

  1. TZM-bl hücrelerini her numuneden eşit konsantrasyonda p24 ile enfekte edin ve β gal boyama yapın. Mavi enfekte hücreleri mikroskop altında 5 rastgele alan için 10x büyütme ile sayın.
  2. Yukarıdaki adımlardan her örnek için 5 alanın sayısının ortalamasını alın.
  3. Katlama değişikliğini aşağıda belirtildiği gibi hesaplayın:
    Katlama değişikliği = Test numunelerindeki ortalama mavi hücre sayısı/Kontrol numunesindeki ortalama mavi hücre sayısı.

Sonuçlar

Bu çalışmada, T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonu üzerine in vitro ER stresi ve UPR aktivasyonunu incelemek için ayrıntılı bir protokol tanımladık (Şekil 2). Bu çalışma aynı zamanda UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesinde fonksiyonel önemini analiz etmek için yöntemleri de açıklamaktadır (Şekil 3).

Bu amaçla, HIV-1 enfeksiyonunun neden olduğu ER stresini, T...

Tartışmalar

Bu protokolün kapsamı şunları içerir: (i) HIV-1 virüs stoklarının işlenmesi ve virüs konsantrasyonunun ve virion enfektivitesinin ölçülmesi, (ii) T-hücrelerinin HIV-1 ile enfeksiyonu ve bunun ER stresi ve farklı UPR belirteçleri üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi, (iii) UPR belirteçlerinin yıkılmasının etkisi ve bunların HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi üzerindeki etkisi, virüs üretimi ve virion enfektivitesi ve (iv) Farmakolojik molekül kullanarak UPR...

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Hindistan Hükümeti Ulusal Hücre Bilimi Merkezi, Biyoteknoloji Bölümü'ne okul içi desteği için teşekkür ederiz. AT ve AD, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü, Ulusal Hücre Bilimi Merkezi'nden alınan doktora araştırma desteği için minnettardır. DM, Hindistan Hükümeti SERB'den JC Bose Ulusal Bursu için müteşekkirdir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

Referanslar

  1. Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Endoplazmik Retikulum ER StresiKatlanmam Protein Yan t UPRHIV 1 EnfeksiyonuT h creleriThioflavin T ThT BoyamaUPR Belirte leriBiPIRE1PERKEIF2XBP1ATF6ATF4CHOPGADD34HIV 1 replikasyonuGen ekspresyonuVir s retimiVirion enfektivitesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır