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摘要

在这里，我们描述了一些确定内质网 （ER） 应激和未折叠蛋白反应 （UPR） 激活的成熟方法，特别强调 HIV-1 感染。本文还介绍了一组研究 ER 应激/UPR 对 HIV-1 复制和病毒粒子传染性影响的方案。

摘要

由于蛋白质积累异常，病毒感染会导致内质网 （ER） 应激，从而导致未折叠蛋白质反应 （UPR）。病毒已经开发出操纵宿主 UPR 的策略，但在文献中缺乏对 HIV-1 感染期间 UPR 调节及其功能意义的详细理解。在此背景下，本文描述了我们实验室用于测量 T 细胞 HIV-1 感染期间 ER 应激水平和 UPR 的方案，以及 UPR 对病毒复制和传染性的影响。

硫黄素 T （ThT） 染色是一种相对较新的方法，用于通过检测蛋白质聚集体来检测细胞中的 ER 应激。在这里，我们说明了在 HIV-1 感染细胞中进行 ThT 染色以检测和量化 ER 应激的方案。此外，通过测量 HIV-1 感染细胞中 UPR 标志物如 BiP 、磷酸化 IRE1、PERK 和 eIF2α、XBP1 剪接、ATF6、ATF4、CHOP 和 GADD34 的切割水平，还间接检测 ER 应激使用常规免疫印迹和定量逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR）。我们发现 ThT 荧光与 UPR 激活的指标相关。本文还演示了通过敲低实验以及使用药理分子分析 ER 应激和 UPR 调节对 HIV-1 复制影响的方案。分别通过荧光素酶报告基因测定和 p24 抗原捕获 ELISA 分析 UPR 对 HIV-1 基因表达/复制和病毒产生的影响，而通过对感染的报告细胞进行染色来分析对病毒粒子感染性的影响。总的来说，这套方法提供了对 HIV-1 感染期间未折叠蛋白反应通路的全面理解，揭示了其错综复杂的动力学。

引言

获得性免疫缺陷综合症 （AIDS） 的特征是 CD4+ T 淋巴细胞数量逐渐减少，导致免疫反应进行性衰竭。人类免疫缺陷病毒 1 （HIV-1） 是艾滋病的病原体。它是一种有包膜的正义单链 RNA 病毒，每个病毒体有两个 RNA 拷贝，属于逆转录病毒科。宿主细胞内高浓度病毒蛋白的产生会给细胞的蛋白质折叠机制带来过大的压力1。ER 是真核细胞分泌途径中的第一个隔室。它负责产生、改变和递送蛋白质到分泌途径和细胞外空间靶位点。蛋白质在内质网中经历许多翻译后变化并折叠成其自然构象，包括天冬酰胺连接的糖基化以及分子内和分子间二硫键的产生2。因此，内质网腔中存在高浓度的蛋白质，这些蛋白质很容易聚集和错误折叠。各种生理状况，如热休克、微生物或病毒感染，需要增强蛋白质合成或蛋白质突变，由于内质网中蛋白质积累增加，导致内质网应激，从而扰乱内质网管腔稳态。ER 应激激活了一个高度保守的适应性信号转导通路网络，即未折叠蛋白反应 （UPR）3。UPR 用于通过调整其未折叠的蛋白质负荷和折叠能力来恢复正常的 ER 生理状况。这是通过增加 ER 大小和 ER 驻留分子伴侣和折叠酶来实现的，从而导致 ER 折叠能力的提高。UPR 还通过在翻译水平的整体蛋白质合成衰减来降低 ER 的蛋白质载量，并通过上调 ER 相关降解 （ERAD） 来增加未折叠蛋白质从 ER 中的清除率4,5。

ER 应激由三种驻留在 ER 上的跨膜蛋白感知:蛋白激酶 R （PKR） 样内质网激酶 （PERK）、激活转录因子 6 （ATF6） 和肌醇需求酶 1 型 （IRE1）。所有这些效应子都通过与伴侣热休克蛋白家族 A （Hsp70） 成员 5 （HSPA5） 结合而保持失活，也称为结合蛋白 （BiP）/78-kDa 葡萄糖调节蛋白 （GRP78）。在 ER 应激和未折叠/错误折叠蛋白积累时，HSPA5 解离并导致这些效应子激活，然后激活一系列下游靶标，这些靶标有助于解决 ER 应激，并在极端条件下促进细胞死亡6。与 HSPA5 解离后，PERK 自磷酸化，其激酶活性被激活7。其激酶活性磷酸化 eIF2α，导致翻译衰减，从而降低 ER 的蛋白载量8。然而，在磷酸化真核起始因子 2α （eIF2α） 存在的情况下，特定 mRNA 上的非翻译开放阅读框（如 ATF4）会优先翻译，从而调节应激诱导的基因。ATF4 和 C/EBP 同源蛋白 （CHOP） 是调节应激诱导基因并调节细胞凋亡和细胞死亡通路的转录因子 9,10。ATF4 和 CHOP 的靶标之一是生长停滞和 DNA 损伤诱导蛋白 （GADD34），它与蛋白磷酸酶 1 一起使 peIF2α 去磷酸化，并充当翻译衰减的反馈调节因子11。在 ER 应激下，ATF6 与 HSPA5 解离，其高尔基体定位信号暴露，导致其易位到高尔基体。在高尔基体中，ATF6 被 1 位点蛋白酶 （S1P） 和 2 位点蛋白酶 （S2P） 切割，以释放 ATF6 （ATF6 P50） 的切割形式。然后，ATF6 p50 易位到细胞核，在那里它诱导参与蛋白质折叠、成熟和分泌以及蛋白质降解的基因的表达12,13。在 ER 应激期间，IRE1 与 HSPA5 解离、多聚化和自磷酸化14。IRE1 的磷酸化会激活其 RNase 结构域，特异性介导 X-box 结合蛋白 1 （XBP1） mRNA 中心部分的 26 个核苷酸剪接15,16。这会产生一个新的 C 端，赋予反式激活功能，产生功能性 XBP1s 蛋白，这是一种有效的转录因子，控制多个 ER 应激诱导的基因17,18。这些转录因子的联合活性会开启旨在恢复 ER 稳态的遗传程序。

有多种方法可以检测 ER 压力和 UPR。这些方法包括分析 UPR 标志物的常规方法 19,20。各种非常规方法包括测量 UPR 的氧化还原状态和 ER 腔中的钙分布以及评估 ER 结构。电子显微镜可用于观察细胞和组织中 ER 管腔因 ER 应激而增大的程度。然而，这种方法很耗时，并且取决于电子显微镜的可用性，而电子显微镜可能并非每个研究小组都可用。此外，由于试剂的可用性，测量 ER 的钙通量和氧化还原状态也具有挑战性。此外，这些实验的读数非常敏感，可能会受到细胞代谢其他因素的影响。

监测 UPR 输出的一种强大而简单的技术是测量 UPR 不同信号通路的激活，并且已经在各种压力场景中使用了几十年。这些测量 UPR 激活的常规方法经济、可行，并且与其他已知方法相比，可以在更短的时间内提供信息。这些包括免疫印迹，用于测量蛋白质水平上 UPR 标志物的表达，例如 IRE1、PERK 和 eIF2α 的磷酸化以及 ATF6 的切割，通过测量 ATF6 的 P50 形式和其他标志物（如 HSPA5、剪接 XBP1、ATF4、CHOP 和 GADD34）的蛋白表达，以及 RT-PCR，以确定 mRNA 水平以及 XBP1 mRNA 的剪接。

本文介绍了一套经过验证的可靠方案，用于监测 HIV-1 感染细胞中的 ER 应激和 UPR 激活，并确定 UPR 在 HIV-1 复制和感染性中的功能相关性。这些方案使用易得且经济的试剂，并提供有关 UPR 输出的令人信服的信息。ER 应激是未折叠/错误折叠蛋白质积累的结果，这些蛋白质容易形成蛋白质聚集体21。我们特此描述了一种在 HIV-1 感染的细胞中检测这些蛋白质聚集体的方法。硫黄素 T 染色是一种相对较新的方法，用于检测和定量这些蛋白质聚集体22。Beriault 和 Werstuck 描述了这种技术来检测和量化活细胞中的蛋白质聚集体，从而检测和量化 ER 应激水平。已经证明，小荧光分子硫黄素 T （ThT） 选择性地与蛋白质聚集体结合，尤其是淀粉样蛋白原纤维。

在本文中，我们描述了使用 ThT 检测和量化 HIV-1 感染细胞中的 ER 应激，并通过测量 UPR 不同信号通路的激活，将其与监测 UPR 的常规方法相关联。

由于也缺乏关于 UPR 在 HIV-1 感染过程中的作用的全面信息，因此我们提供了一套方案来了解 UPR 在 HIV-1 复制和病毒粒子感染性中的作用。这些方案包括慢病毒介导的 UPR 标志物敲低以及用药理学 ER 应激诱导剂治疗。本文还介绍了可用于测量 HIV-1 基因表达、病毒产生以及产生的病毒粒子的感染性的读出类型，例如基于长末端重复序列 （LTR） 的荧光素酶测定、p24 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和 β-gal 报告基因染色测定。

使用其中的大部分方案，我们最近报道了 HIV-1 感染对 T 细胞23 中 UPR 的功能影响，该文章的结果表明此处描述的方法的可靠性。因此，本文提供了一组关于 HIV-1 与 ER 应激和 UPR 激活相互作用的综合信息方法。

研究方案

注意:此处使用的细胞系是 HEK-293T 和 Jurkat J6（一种 CD4 + T 细胞系），它们来自印度浦那 NCCS 的细胞储存库;TZM-bl 是一种 HeLa 衍生细胞系，在 HIV-1 长末端重复序列 （LTR） 启动子24 和 CEM-GFP（另一种 CD4+ T 报告细胞系）25 下整合了 β-半乳糖苷酶和荧光素酶基因的拷贝，购自美国 NIH 艾滋病储存库。

1. HIV-1 病毒原液制备和储存

  1. HIV-1 病毒原液制备
    注意:建议在所有涉及 HIV-1 的实验中遵循世界卫生组织 （WHO） 或疾病控制和预防中心 （CDC） 手册中提供的与生物安全相关的国际指南。病毒的处理和任何活病毒实验都应在至少位于 BSL2 级收容实验室的适当生物安全柜中进行。使用磷酸钙哺乳动物转染试剂盒生产传染性 HIV-1 颗粒在方案的这一部分进行了描述。
    1. 将 HEK-293T 细胞接种在 90 mm 培养皿中，其中含有 10 mL 完全（补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素）DMEM（Dulbecco 改良的 Eagle 培养基）在 II 类 A2 型生物安全柜中，并在 37 °C 的组织培养箱中保存约 12 小时，以使细胞的汇合度在 50%-60% 之间。
    2. 第二天，制备转染混合物:在无菌缓冲液中制备含有 25 μg pNL4.3（HIV-1 的分子克隆）质粒 DNA、86.8 μL 2 M CaCl2 和剩余无菌水的溶液 A，使每个板的最终体积为 700 μL。为 1 个板准备含有 700 μL 2x HEPES 缓冲盐水 （HBS） 的溶液 B。然后，调整板总数的计算。
    3. 现在以逐滴方式将溶液 B 添加到溶液 A 中，同时连续涡旋溶液 A。现在，每块板的转染混合物总体积变为 1.4 mL。
      注:在连续涡旋的同时，将溶液 B 精确逐滴添加到溶液 A 中，可形成完美的转染复合物。
    4. 在室温 （RT） 下孵育该混合物约 20 分钟。接下来，将混合物缓慢滴加到每个含有新鲜 9 mL 完整 DMEM 的板中，然后将板转移到 CO2 培养箱中。8-10 小时后，用新鲜的 10 mL 完整 DMEM 更换现有培养基。
    5. 更换培养基后 24 小时后，从锥形管中的所有板中收集上清液（含有病毒颗粒）。使用低速台式离心机（材料表）以 600 x g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。
    6. 将上清液转移到多聚体超速离心管中，并将它们放入超速离心机的摆动转子中（材料表）。检查试管架的重量是否平衡，并在需要时使用无菌培养基进行调整。
    7. 在 4 °C 下以 1,41,000 x g 超速离心 2.5 小时。 之后，小心地取出试管，并在生物安全柜内缓慢倒出上清液。
    8. 向每管中的沉淀（现在是浓缩的病毒）中加入 1 mL 不完全的 RPMI（罗斯威尔公园纪念研究所）1640 培养基，并用力移液以去除沉淀。
      注意:超速离心后的沉淀几乎是肉眼看不见的。因此，必须确保在管的中间添加 RPMI 1640，以便颗粒正确脱落。
    9. 接下来，将 25 μL 的 1 M HEPES pH 7.4 添加到 1 mL 病毒悬浮液中。将 50 μL 悬浮液分装到 1.5 mL 离心管中，并立即将其储存在 -80 °C 冰箱中以便长期储存。
  2. 病毒浓度和病毒粒子感染性的定量
    注:为了计算病毒的传染性，必须首先量化其浓度，这是通过 p24 抗原捕获 ELISA 完成的（根据制造商的说明，因此不在此处描述;参见 材料表）。该过程以纳克/微升 （ng/μL） 原液为单位给出病毒浓度，然后通过以下在 TZM-bl 报告细胞26 中的实验用于鉴定原液中的感染性病毒粒子数。
    1. 在 24 孔板中计数和接种 0.1 x 106 个 TZM-bl 细胞，每个孔使用 500 μL 完整的 DMEM，并将其在细胞培养箱中保存 10-12 小时。
    2. 在开始感染病毒之前，确保细胞汇合 50%-60%。将现有培养基更换为每个孔中 250 μL 新鲜的完整 DMEM。
      注意:保持阳性对照井以排除任何实验错误。
    3. 计算感染所需的原病毒量，一式两份为 1 ng、0.1 ng 和 0.01 ng。向孔中加入适量的病毒，并将板在培养箱中于 37 °C 保持 4 小时。
    4. 用 500 μL 不完全 DMEM 洗涤细胞两次，然后加入 500 μL 完全 DMEM。
    5. 更换培养基 36 小时后，继续进行 β 加仑染色程序。
      1. 丢弃现有培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞两次。向每个孔中加入 500 μL 固定液（PBS 中的 0.25% 戊二醛溶液）来固定细胞，并在生物安全柜内的 RT 下孵育 5-7 分钟。
      2. 如 表 1 所示准备染色溶液。请避光，因为 X-gal 对光敏感。
      3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞一次。用 500 μL 新鲜制备的染色溶液覆盖细胞，并在 37 °C 下避光孵育 2-18 小时。
      4. 为了在此后停止反应，用 500 μL 3% 二甲基亚砜 （DMSO） 的 PBS 溶液冲洗细胞两次，然后将细胞保存在 500 μL 新鲜 PBS 中。
      5. 在显微镜下以 10 倍放大 5 个随机视野对蓝色感染细胞（如图 1A 所示）进行计数。取 5 个字段的平均计数，并将其乘以字段因子和稀释因子。这量化了病毒原液中的感染性病毒粒子颗粒。
        注:对于 24 孔板，磁场因子为 75。
组件制备所需体积
PBS 系列从 10 x PBS 的原液中制备 1 x PBS14 毫升
氰化铁钾将 0.82 g 铁氰化钾和 1.06 g 亚铁氰化钾溶于 25 mL 1x PBS 中0.75 毫升
氯化镁1 M 在 1 mL 1x PBS 中15 微升
X-gal将 30 mg 溶于 0.6 mL N，N-二甲基甲酰胺中（避光）0.3 毫升
总计 = 15 mL

表 1:在 TZM-bl 细胞中进行 β-gal 染色所需的组分列表。

2. T 细胞系的 HIV-1 感染

  1. 解冻并培养永生化 T 细胞系。本研究使用在补充有 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 500 μg/mL G418 的 RPMI 1640 完全培养基中培养的 CEM-GFP 细胞系。
  2. 每个时间点（未感染、24 小时、48 小时、72 小时和 96 小时）计数并取 200 万个细胞。立即以 100 x g 离心 5 分钟收获未感染的细胞，并加入细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.12 M NaCl、5 mM EDTA、0.5% NP40、0.5 mM NaF、1 mM DTT），补充蛋白酶抑制剂混合物、0.5 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和 1x 磷酸酶抑制剂（50 μL 用于 1-300 万个细胞）或在 Trizol 试剂（1 mL 用于 1-300 万个细胞）中裂解用于 RNA 分离（见 表材料）。
  3. 在 RT 下，用 1 mL 含有聚凝胺 （5 μg/mL） 的 RPMI 1640 完全培养基以 100 x g 的速度洗涤细胞一次，持续 5 分钟。将细胞重悬于 1 mL 完全培养基中。
    注:聚凝胺是一种阳离子聚合物，用于增强哺乳动物细胞中的逆转录病毒感染。
  4. 将 800 万个细胞重悬于 1 mL 含聚凝胺的完全培养基中。现在计算 400 万个病毒粒子颗粒所需的病毒原液体积，加入病毒原液，并通过添加完全培养基将总体积补足至 2 mL。这使得它的 MOI 为 0.5。
  5. 将细胞在 CO2 培养箱中在 37 °C 下保持 4 小时，每 30-45 分钟间歇敲击一次。
  6. 4 小时后，旋转细胞，并以适当的处理方法小心地丢弃生物安全柜内的上清液。
    注:从此步骤开始，在 RT 下以 100 x g 离心细胞 5 分钟。
  7. 用 1 mL 不完全培养基洗涤细胞两次。将细胞重悬于 8 mL 完全培养基中，使其为 100 万个细胞/mL。
  8. 在 6 孔组织培养板中，在所需数量的孔中接种相同数量的细胞，并将板保持在维持在 37 °C 的 CO2 培养箱中。
  9. 在接下来的 4 天里，通过添加细胞裂解缓冲液每 24 小时收获一次细胞。另外，收集上清液并立即将其转移到-80°C冰箱中。
  10. 为了检查是否发生了感染，请在所有时间点进行 p24 抗原捕获 ELISA。对时间点进行适当的稀释，即初始时间点的稀释度较低，后续时间点的稀释度较高，范围为 1:50 至 1:500。将读数绘制在描述感染进展的图表中（图 1B）。

3. 硫黄素 T 染色确定 ER 应激

  1. 在 RT 下用 200 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定 100 万个未感染和 0.5 MOI 感染的 CEM-GFP 细胞（取 72 小时感染的细胞）20 分钟。
  2. 以 100 x g 的离心沉淀细胞 5 分钟，然后用 500 μL 的 0.1 M 甘氨酸处理 5 分钟，然后用 500 μL 的 PBS 洗涤两次。将细胞重悬于 100 μL PBS 中。
  3. 组装载玻片、滤光片卡和样品室。将 100 μL 重悬的细胞添加到样品室中，并以 1000 x g 的速度旋转细胞 4 分钟，以将细胞粘附在细胞离心机中的载玻片上（材料表）。
    注:如果细胞悬液太稀释，则细胞离心离心后，载玻片上将没有足够的细胞固定。如果细胞悬液非常浓缩，细胞离心后细胞可能会聚集并且分布不良。
  4. 使用 PBS 中的 0.1% Triton-X-100 滴透化细胞 10 分钟（足以覆盖细胞粘附的区域），然后通过滴加 PBS 洗涤细胞两次，并通过倾斜载玻片用组织擦去 PBS。
  5. 将细胞与 10 μL 5 μM 硫黄素 T 一起孵育 30 分钟。
    注意:与 ThT 孵育后不要洗涤。
  6. 使用 5 μL 安装介质（80% 甘油 v/v、20% PBS v/v 和 8 mg/mL 1,4-二氮杂双环 [2.2.2] 辛烷 [DABCO]）安装载玻片，放入盖玻片并使用指甲油密封盖玻片。让载玻片晾干。
    注意:在所有这些步骤中，确保细胞不会干涸。
  7. 在共聚焦显微镜上使用 63 倍甘油浸没透镜拍摄固定细胞的共聚焦图像（参见 材料表）。调整以下激发和发射设置:GFP（Ex. 494 nm，Em. 519 nm）和 ThT（Ex. 458 nm，Em. 480-520 nm）。
    注:每个荧光通道应按顺序成像，而不是同时成像，以避免通道重叠。GFP 被视为 HIV-1 感染的标志，因为 CEM-GFP 细胞在 LTR 启动子的调节下具有 GFP，LTR 启动子在 HIV-1 感染时触发25。
  8. 在通过阈值分析进行量化之前，将荧光图像转换为 8 位。使用 Image J 等软件手动量化每个细胞的强度（~50 个细胞）27。将每个细胞的强度作为 Y 轴上针对未感染和感染标准的点绘制图表。
  9. 为了证明该方案的有效性，采用阳性对照，例如，在这种情况下，Thapsigargin 治疗（已知的 ER 应激诱导剂）28。处理 100 万个 CEM-GFP 细胞，每个细胞用 1 μL DMSO（载体对照）和 100 nM Thapsigargin 处理 12 小时。
  10. 收获细胞并按照感染样品的上述进行 ThT 染色（步骤 3.1-3.8）。
    注:对于这些样品，不需要 GFP 荧光。因此，共聚焦显微镜中仅捕获 ThT 荧光。

4. 确定各种 UPR 标志物的激活和表达

注意:为了确定 UPR 标志物的表达，使用了两种方法:免疫印迹和 RT-PCR。对于免疫印迹，在感染后的不同时间点（感染后 24 小时、48 小时、72 小时和 96 小时）收获 0.5 MOI HIV-1 感染的 CEM-GFP 细胞，并将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中（如步骤 2.2 中所述）。或者，对于 RT-PCR，将细胞沉淀在 Trizol 试剂（1-300 万个细胞为 1 mL）中裂解（参见 材料表）。重悬于裂解缓冲液和 Trizol 试剂中的细胞可以储存在 -80 °C 直至进一步使用。

  1. 用于分析 UPR 标志物的免疫印迹。
    1. 将重悬的细胞在裂解缓冲液中置于冰上 45 分钟，并使用涡旋间歇混合。
    2. 使用台式高速离心机以 18000 x g 的离心力沉淀细胞 15 分钟（参见 材料表）。将上清液收集在新管中。
    3. 使用 Bradford 或类似试剂定量每个样品中的蛋白质浓度。
    4. 每个样品取相同浓度的蛋白质，并在 Laemmli 缓冲液（6x 缓冲液:250 mM Tris-Cl pH 6.8、10% SDS、30% 甘油和 0.02% 溴酚蓝;5% β-巯基乙醇）中制备蛋白质样品。
      注:对于每个 UPR 标记物的免疫印迹，至少使用 60-80 μg 蛋白质。
    5. 将蛋白质样品在 96 °C 下煮沸 5 分钟，然后短暂旋转。
    6. 在 10%-12% SDS-PAGE 凝胶上分离蛋白质样品，并将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上（参见 材料表）。
    7. 用 5% 脱脂奶粉或牛血清白蛋白 （BSA） 封闭 1-2 小时，用 TBST（20 mM Tris pH7.4 和 0.137 M NaCl;0.1% 吐温 20）洗涤两次，并用针对 UPR 标志物的蛋白质特异性一抗探测（参见 材料表）在摇床中，在 4 °C 下过夜。 第二天，用 TBST 洗涤印迹两次后，用相应的二抗探测 1.5 小时。
    8. 用 TBST 再次洗涤印迹，并在 western blot 成像仪器中使用化学发光检测底物（参见 材料表）观察蛋白质条带。
  2. RT PCR
    1. 使用 Trizol 试剂从细胞中分离总 RNA（参见 材料表）。
    2. 使用 Moloney 鼠白血病病毒逆转录酶 （MMLV-RT） 从等浓度的 RNA 中制备 cDNA（参见 材料表）。
    3. 使用带有基因特异性引物的 qRT-PCR 分析 HSPA5、剪接的 XBP1、ATF4、CHOP 和 GADD34 的 mRNA 表达的调节（表 2）。简而言之，制备 10 μL 反应混合物，其中包含 cDNA 模板 （100 ng）、5 μL SYBR Green 染料（参见 材料表）和 10 pmol 的每个基因特异性寡核苷酸引物对。使用无菌 H2O 调节体积。
    4. 使用以下程序在实时 PCR 机器上运行混合物:在 95 °C 下初始变性 3 分钟，并在 95 °C 下 30 秒、55 °C 30 秒和 72 °C 40 秒的 30 个循环，然后进行熔解曲线分析。计算靶基因表达相对于管家基因（例如 β-肌动蛋白）的倍数变化，如下所示:
      倍数变化 = 2-Δ（ΔCT）
      其中 ΔCT = CT （靶标） − CT （看家基因）
      和 Δ（ΔCT） = ΔCT（处理）-ΔCT（对照）
    5. 为了进一步确认 XBP1 的剪接，对未感染和 72 小时感染的样品进行半定量 RT-PCR。
      注意:通过使用 RT-PCR 跨剪接位点研究 XBP-1 mRNA 的剪接。
    6. 在以下条件下，使用高保真 PCR 预混液（参见材料表）用 XBP1 引物（表 2）扩增 cDNA:1 个 98 °C 循环 30 秒，然后是 5 个 98 °C 循环 15 秒，65*Δ-5 °C 30 秒和 72 °C 30 秒，然后是 30 个 98 °C 循环 15 秒， 55 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 30 秒，然后最终延长 72 °C 10 分钟并保持在 4 °C。
    7. 在含有 50 ng 溴化乙锭/mL 的 2.5% 琼脂糖凝胶上分离扩增子，并在凝胶 doc 仪器中观察。剪接的 XBP1 条带小 26 个核苷酸。

5. 敲低 UPR 标志物并分析 HIV-1 LTR 驱动的基因表达和病毒生产

  1. 制备用于敲低 UPR 标记物的 shRNA 构建体
    1. 使用 pLKO.1-TRC 载体骨架（慢病毒克隆载体）创建 shRNA 构建体29。
    2. 为每个基因构建两个 shRNA 构建体 （IRE1、PERK、ATF6 和 HSPA5）。靶向相应基因 mRNA 的正义和反正义寡核苷酸由 RNAi Consortium （https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library） 设计（表 3）。
      注:以类似的方式，可以为其他 UPR 标记物制备 shRNA 构建体。
    3. 在95°C下对引物（正向和反向各100 nM）进行退火，然后逐渐冷却至RT。
    4. 然后，使用 T4 DNA 连接酶将其连接到 pLKO.1 载体的 Age1 和 EcoRI 位点（参见 材料表）。通过 DNA 测序确认序列。
      注:靶向 LacZ 基因的 shRNA 构建体用作非靶向对照。
  2. 敲低 HEK-293T 细胞中的 PERK、ATF6、IRE1 和 HSPA5、荧光素酶测定和 p24 ELISA
    1. 涡旋在 50 μL 无血清培养基中制备 shRNA 构建体 （0.9 μg） 和转染试剂如聚乙烯亚胺 （PEI）（1 μg DNA 为 3 μL PEI）（参见 材料表）的混合物，并孵育 20 分钟。
    2. 从含有培养瓶的汇合 HEK-293T 细胞中，胰蛋白酶消化并将 ~0.25 x 106 个细胞连同转染混合物一起接种在 24 孔板中，使总体积为 125 μL，并在 CO2 培养箱中于 37 °C 下孵育 6 小时。这种方法称为反向转染，其中细胞与转染混合物一起接种。
    3. 6 小时后，向孔中加入 125 μL 完全培养基并重悬细胞以实现均匀接种。
      注意:对于敲低实验，反向转染（步骤 5.2.1-5.2.3）对 shRNA 和 siRNA 均具有更好的效率。
    4. 24 小时后，进行第二次转染。涡旋在 50 μL 不完全培养基中制备 pNL4-3 （100 ng）、pLTR-Luc （100 ng） 和 pEGFP-N1 （50 ng） （pNL4:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5） 构建体与 PEI（3 μL PEI 对应 1 μg DNA）的混合物。在 RT 下孵育混合物 20 分钟。用 250 μL 新鲜的不完全培养基更换现有培养基，并将混合物添加到细胞中。
      注:HIV-1 LTR 的报告载体是通过在实验室早期将 LTR 从 pU3RIII30,31 亚克隆到 pGL3basic 中来开发的32。使用 pEGFP-N1 的 GFP 表达用于标准化转染效率32。
    5. 转染后 6 小时后，用 500 μL 完全 DMEM 更换培养基。36 小时后收获细胞用于免疫印迹和荧光素酶测定。
    6. 对于荧光素酶测定，将细胞沉淀并重悬于市售的荧光素酶底物 （50 μL） 中（参见 材料表）。将重悬的细胞裂解物添加到不透明的 96 孔板中，孵育 10-15 分钟。在光度计中获取荧光素酶读数。此外，测量相同样品中的 GFP 荧光，以使微孔板微模式读板机中的荧光素酶读数正常化（例如:494 nm，Em:519 nm）。
    7. 将图表绘制为 Y 轴上的荧光素酶单位/GFP。
      注:应检查相应 UPR 标记物的敲低，并且可以分别使用基因特异性抗体或引物通过免疫印迹或 qRT-PCR 来完成。
    8. 如上所述，收集上清液以进行 p24 ELISA 处理。
  3. 通过敲低 UPR 标志物和 HIV-1 感染创造稳定细胞。
    1. 通过转染接种在 6 孔板中的 HEK-293T 细胞来制备慢病毒颗粒，其中包含相应的 shRNA （1 μg） 构建体以及 pMD2.G（VSV-G 包膜载体）（0.75 μg）和 psPAX2（慢病毒包装质粒）（0.25 μg）（参见 材料表），使用 PEI 以 1 μg DNA:3 μL PEI 的比例。在 100 μL 不完全 DMEM 中制备混合物，并在室温下孵育 20 分钟。将混合物添加到接种的 HEK-293T 细胞中的 1.8 mL 完全培养基中。
      注:转染前至少 12 小时将 HEK-293T 细胞接种在 6 孔板中，直到它们获得形态并达到大约 60-70% 汇合。
    2. 转染 24 小时后，向每个孔中加入 1 mL 完全 DMEM。
    3. 48小时后收集上清液，储存在-80°C冰箱中，并进行p24 ELISA以确认这些上清液中存在病毒。使用这种粗慢病毒上清液转导 J6 细胞。
    4. 将 200 万个细胞放入 6 孔板中，每种对照和基因特异性敲低慢病毒加入等体积的慢病毒上清液 （500 μL），并在聚凝胺 （5 μg/mL） 存在下加入新鲜的 RPMI 1640 完全培养基，使体积补足至 2 mL。
    5. 24 小时后，向每个孔中加入嘌呤霉素 （1 μg/mL） 以选择稳定细胞。加入嘌呤霉素后，每 24 小时沉淀一次细胞，并加入 2 mL 含嘌呤霉素的新鲜培养基。
    6. 这样做直到没有细胞死亡（~1 周）。存活的细胞是具有所需基因敲低的稳定细胞。
      注:可以定期检查各个基因的敲低，最后，当使用免疫印迹或 qRT-PCR 在含嘌呤霉素的培养基中仅可见存活的细胞时。
    7. 如第 2 节所述，用 0.5 MOI 的 HIV-1 感染 LacZ 和基因特异性敲低细胞，并在感染后 48 小时收获细胞。
    8. 如前所述，从每个样品中收集上清液并进行 p24-ELISA 处理，并通过免疫印迹处理细胞以检查敲低水平。

6. ER 应激诱导剂治疗及其对 HIV-1 复制的影响

注意:为了确定 HIV-1 复制过程中 UPR 过度刺激的影响，可以使用药理诱导剂分子 Thapsigargin。

  1. 确定 Thapsigargin 处理后的细胞活力百分比。
    注:Thapsigargin 的细胞毒性由 MTT 试剂决定（参见 材料表）。
    1. 在含有 100 μL 完整 RPMI 1640 的 96 孔板中每孔接种 25,000-30,000 个 CEM-GFP 细胞。向培养基中加入 100 nM Thapsigargin，并在 37 °C 下在培养箱中孵育。
      注:取用 1 μL DMSO 处理的细胞作为载体对照。
    2. 48 小时后，在每个孔中加入 10 μL MTT （5 mg/mL），并在 37 °C 和 5% CO2 下避光孵育 4 小时以形成甲臜晶体。
    3. 4 小时后，使用 100 μL 异丙醇溶解晶体以形成紫色，并使用分光光度计测量 570 nm 处的吸光度。
    4. 根据下面给出的方程式计算细胞活力百分比
      % 细胞活力 = （对照OD570 - 处理OD570）/对照OD570 x 100
  2. Thapsigargin 的预处理和 p1 ELISA 分析 HIV-24 感染进展。
    1. 将 100 万个 CEM-GFP 细胞接种在含有 1 mL 完整 RPMI 1640 的 12 孔板中，并在维持在 37 °C 的 CO2 培养箱中用 100 nM Thapsigargin 或 1 μL DMSO（载体对照）处理细胞 12 小时。 12 小时后，用完整的 RPMI 1640 洗涤细胞，并如前所述用 0.5 MOI 的 HIV-1 感染。
    2. 在不同时间点收获细胞，例如感染后 24 小时、48 小时和 72 小时，用于免疫印迹。
    3. 从每个样品中收集上清液并如前所述进行 p24 ELISA。
    4. 以样品中的 p24 浓度作为 Y 轴，以相应的时间点作为 X 轴绘制图表。
    5. 使用免疫印迹，通过测量任何 UPR 标志物的水平来分析由于 Thapsigargin 处理引起的 ER 应激诱导。本研究以 HSPA5 为标志物。

7. TZM-bl β-gal 感染性测定确定 UPR 对病毒粒子感染性的影响

注:为了了解 UPR 在病毒粒子感染性中的作用，来自 Thapsigargin 处理的敲除上清液可用于 TZM-bl β-gal 感染性测定，如第 1.2 节所述，基于 p24 ELISA 测定的 p24 浓度。

  1. 用每个样品中相同浓度的 p24 感染 TZM-bl 细胞，并进行 β-gal 染色。在显微镜下以 10 倍放大 5 个随机视野对蓝色感染细胞进行计数。
  2. 从上述步骤中取每个样本的 5 个字段计数的平均值。
  3. 计算 fold 变化，如下所述:
    倍数变化 = 测试样品中蓝色细胞的平均数量/对照样品中蓝色细胞的平均数量。

结果

在这项工作中，我们描述了一个详细的方案，用于研究 T 细胞中 HIV-1 感染后的 体外 ER 应激和 UPR 激活（图 2）。本研究还描述了分析 UPR 在 HIV-1 复制和病毒粒子感染性中的功能相关性的方法（图 3）。

为此，我们通过用硫黄素 T 染色观察细胞内的蛋白质聚集体，分析了 HIV-1 感染引起的 ER 应激。如?...

讨论

本方案的范围包括 （i） HIV-1 病毒储备的处理以及病毒浓度和病毒粒子感染性的测量，（ii） HIV 1 感染 T 细胞并评估其对 ER 应激和 UPR 不同标志物的影响，（iii） UPR 标志物敲除的影响及其对 HIV-1 LTR 驱动基因活性的影响， 病毒产生和病毒粒子感染性和 （iv） 使用药理分子过度刺激 UPR 并分析其对 HIV-1 复制的影响。使用目前的一套方案，可以获得有关 HIV-1 和 UPR 相互作用...

披露声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心的校内支持。AT 和 AD 感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的博士研究支持。DM 感谢印度政府 SERB 的 JC Bose 国家奖学金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

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