JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

Abstract

זיהומים נגיפיים עלולים לגרום ללחץ של רטיקולום אנדופלסמי (ER) עקב הצטברות חלבון חריגה, מה שמוביל לתגובת חלבון מקופלת (UPR). וירוסים פיתחו אסטרטגיות כדי לתפעל את UPR המארח, אבל יש חוסר הבנה מפורטת של אפנון UPR ואת המשמעות התפקודית שלה במהלך זיהום HIV-1 בספרות. בהקשר זה, המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו למדידת רמות לחץ בחדר מיון ו- UPR במהלך זיהום HIV-1 בתאי T ואת ההשפעה של UPR על שכפול ויראלי והדבקה.

צביעת תיאופלבין T (ThT) היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי עקה בחדר מיון בתאים על ידי איתור צברי חלבונים. כאן, הדגמנו את הפרוטוקול לצביעת ThT בתאים נגועים ב- HIV-1 כדי לזהות ולכמת לחץ במיון. יתר על כן, מתח ER זוהה גם בעקיפין על ידי מדידת רמות של סמני UPR כגון BiP, IRE1 זרחני, PERK ו- eIF2α, שחבור של XBP1, מחשוף של ATF6, ATF4, CHOP ו- GADD34 בתאים נגועים ב- HIV-1, באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-PCR). מצאנו כי ThT-fluorescence מתואם עם האינדיקטורים של הפעלת UPR. מאמר זה גם מדגים את הפרוטוקולים לניתוח ההשפעה של לחץ ER ומודולציית UPR על שכפול HIV-1 על ידי ניסויי הפלה, כמו גם שימוש במולקולות פרמקולוגיות. ההשפעה של UPR על ביטוי / שכפול גנים של HIV-1 וייצור וירוסים נותחה על ידי מבחני כתב Luciferase ו- p24 antigen capture ELISA, בהתאמה, ואילו ההשפעה על זיהום ויריונים נותחה על ידי צביעה של תאי דיווח נגועים. באופן קולקטיבי, קבוצה זו של שיטות מספקת הבנה מקיפה של מסלולי תגובת החלבונים שנפרשו במהלך זיהום HIV-1, וחושפת את הדינמיקה המורכבת שלה.

Introduction

תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) מאופיינת בירידה הדרגתית במספר לימפוציטים מסוג CD4+ T, מה שמוביל לכישלון מתקדם של התגובה החיסונית. וירוס הכשל החיסוני האנושי -1 (HIV-1) הוא הגורם הסיבתי לאיידס. זהו וירוס RNA חד-גדילי עטוף וחיובי עם שני עותקים של RNA לכל ויריון, והוא שייך למשפחת הרטרו-ויריים. ייצור ריכוזים גבוהים של חלבונים נגיפיים בתוך התא המארח יוצר לחץ מוגזם על מנגנון קיפול החלבונים של התא1. ER הוא התא הראשון במסלול ההפרשה של תאים אאוקריוטים. הוא אחראי על ייצור, שינוי והעברת חלבונים למסלול ההפרשה ולאתרי המטרה בחלל החוץ-תאי. חלבונים עוברים שינויים רבים לאחר התרגום ומתקפלים לקונפורמציה הטבעית שלהם בחדר המיון, כולל גליקוזילציה הקשורה לאספרגין ויצירת קשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים ובין-מולקולריים2. לכן, ריכוזים גבוהים של חלבונים נמצאים בלומן ER ואלה נוטים מאוד לצבירה וקיפול שגוי. מצבים פיזיולוגיים שונים, כגון הלם חום, זיהומים מיקרוביאליים או נגיפיים, הדורשים סינתזת חלבון משופרת או מוטציה חלבונית, מובילים ללחץ בחדר המיון עקב הצטברות חלבון מוגברת בחדר המיון, ובכך מפריעים להומאוסטזיס לומן במיון. הלחץ בחדר המיון מפעיל רשת של מסלולי העברת אותות אדפטיביים שמורים ביותר, תגובת החלבון המקופלת (UPR)3. UPR משמש כדי להחזיר את המצב הפיזיולוגי הרגיל של ER על ידי יישור נטל החלבון הפתוח ויכולת הקיפול שלו. הדבר בא לידי ביטוי בהגדלת גודל חדר המיון והמלווים המולקולריים והקיפולים המתקפלים של חדר המיון, וכתוצאה מכך ניתן להעלות את יכולת הקיפול של חדר המיון. UPR גם מפחית את עומס החלבונים של חדר המיון באמצעות הנחתת סינתזת חלבונים גלובלית ברמת התרגום ומגביר את פינוי החלבונים המקופלים מהמיון על ידי ויסות פירוק הקשור ל- ER (ERAD)4,5.

לחץ ER מורגש על ידי שלושה חלבונים טרנסממברניים תושבי ER: חלבון קינאז R (PKR) דמוי רטיקולום קינאז (PERK), גורם שעתוק מפעיל 6 (ATF6), ואנזים דורש אינוסיטול מסוג 1 (IRE1). כל המשפיעים הללו נשמרים לא פעילים על ידי קשירה למלווה משפחת חלבוני הלם חום A (Hsp70) חבר 5 (HSPA5), הידוע גם בשם חלבון קושר (BiP)/78-kDa חלבון מווסת גלוקוז (GRP78). עם עקה בחדר מיון והצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, HSPA5 מתנתק ומוביל להפעלה של גורמים אלה, אשר לאחר מכן מפעילים סדרה של מטרות במורד הזרם המסייעות בפתרון הלחץ בחדר המיון, ובתנאים קיצוניים, מקדמות מוות תאי6. עם דיסוציאציה מ- HSPA5, PERK autophosphorylates, ופעילות הקינאז שלו מופעלת7. פעילות הקינאז שלו פוספורילטים eIF2α, מה שמוביל להנחתה תרגומית, ומוריד את עומס החלבון של ER8. עם זאת, בנוכחות גורם אתחול פוספו-אאוקריוטי 2α (eIF2α), מסגרות קריאה פתוחות שאינן מתורגמות על mRNA ספציפי הופכות לעדיפות מתורגמות, כגון ATF4, המווסתות גנים הנגרמים על ידי לחץ. ATF4 וחלבון הומולוגי C/EBP (CHOP) הם גורמי שעתוק המווסתים גנים הנגרמים על ידי לחץ ומווסתים אפופטוזיס ומסלולי מוות תאי 9,10. אחת המטרות של ATF4 ו- CHOP היא עצירת גדילה וחלבון המושרה נזק ל- DNA (GADD34), אשר, יחד עם חלבון phosphatase 1 dephosphorylate peIF2α ופועל כמווסת משוב עבור הנחתה תרגומית11. תחת לחץ ER, ATF6 מתנתק מ-HSPA5, ואות הלוקליזציה של גולג'י שלו נחשף, מה שמוביל לטרנסלוקציה שלו למנגנון גולג'י. במנגנון גולג'י, ATF6 נבקע על ידי פרוטאז Site-1 (S1P) ופרוטאז Site-2 (S2P) כדי לשחרר את הצורה החתוכה של ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 מועבר לאחר מכן לגרעין, שם הוא גורם לביטוי של גנים המעורבים בקיפול, הבשלה והפרשה של חלבונים, כמו גם פירוק חלבונים12,13. במהלך לחץ ER, IRE1 מתנתק מ- HSPA5, מכפיל ופוספורילטים אוטומטיים14. זרחן של IRE1 מפעיל את תחום ה-RNase שלו, ובמיוחד מתווך את השחבור של 26 נוקלאוטידים מהחלק המרכזי של ה-mRNA של חלבון קושר X-box 1 (XBP1)15,16. זה יוצר C-terminus חדשני המעניק פונקציית טרנסאקטיבציה, יצירת חלבון XBP1s פונקציונלי, גורם שעתוק רב עוצמה השולט במספר גנים הנגרמים על ידי לחץ ER17,18. הפעילות המשולבת של גורמי שעתוק אלה מפעילה תוכניות גנטיות שמטרתן לשחזר הומאוסטזיס במיון.

ישנן שיטות שונות לזיהוי מתח ER ו- UPR. אלה כוללים את השיטות המקובלות לניתוח סמני UPR19,20. שיטות לא קונבנציונליות שונות כוללות מדידת מצב חמצון-חיזור של UPR ופיזור סידן בלומן ER, כמו גם הערכת מבנה המיון. ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לראות עד כמה לומן המיון גדל בתגובה ללחץ ER בתאים וברקמות. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן רב ותלויה בזמינותו של מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר עשוי שלא להיות זמין לכל קבוצת מחקר. כמו כן, מדידת שטף הסידן ומצב החיזור של חדר המיון מאתגרת בשל זמינותם של ריאגנטים. יתר על כן, הקריאה מניסויים אלה רגישה מאוד ועשויה להיות מושפעת מגורמים אחרים של חילוף החומרים התאי.

טכניקה רבת עוצמה ופשוטה לניטור יציאות ה- UPR היא למדוד את ההפעלה של מסלולי האיתות השונים של ה- UPR ושימשה במשך עשרות שנים בתרחישי לחץ שונים. שיטות קונבנציונליות אלה למדידת הפעלת UPR הן חסכוניות, ישימות ומספקות את המידע בפחות זמן בהשוואה לשיטות ידועות אחרות. אלה כוללים immunoblotting כדי למדוד את הביטוי של סמני UPR ברמת החלבון, כגון זרחן של IRE1, PERK, ו eIF2α ו מחשוף של ATF6 על ידי מדידת צורת P50 של ATF6 וביטוי חלבון של סמנים אחרים כגון HSPA5, שחבור XBP1, ATF4, CHOP ו GADD34, כמו גם RT-PCR כדי לקבוע את רמות mRNA, כמו גם שחבור של XBP1 mRNA.

מאמר זה מתאר קבוצה מאומתת ואמינה של פרוטוקולים לניטור לחץ בחדר מיון והפעלת UPR בתאים נגועים ב- HIV-1 ולקביעת הרלוונטיות התפקודית של UPR בשכפול HIV-1 והדבקה. הפרוטוקולים משתמשים בריאגנטים זמינים וחסכוניים ומספקים מידע משכנע על תפוקות UPR. לחץ ER הוא תוצאה של הצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, אשר נוטים ליצור צברי חלבונים21. אנו מתארים בזאת שיטה לאיתור צברי חלבונים אלה בתאים נגועים ב- HIV-1. צביעת תיאופלבין T היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי וכימות צברי חלבונים אלה22. Beriault ו Werstuck תיארו טכניקה זו כדי לזהות ולכמת אגרגטים חלבונים, ומכאן רמות העקה ER בתאים חיים. הוכח כי המולקולה הפלואורסצנטית הקטנה תיופלבין T (ThT) נקשרת באופן סלקטיבי לצברי חלבונים, במיוחד סיבי עמילואיד.

במאמר זה, אנו מתארים את השימוש ב- ThT כדי לזהות ולכמת לחץ ER בתאים נגועים ב- HIV-1 ומתאמים אותו לשיטה הקונבנציונלית של ניטור UPR על ידי מדידת ההפעלה של מסלולי איתות שונים של UPR.

מכיוון שחסר גם מידע מקיף לגבי תפקידו של UPR במהלך הידבקות ב- HIV-1, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים להבנת תפקידו של UPR בשכפול HIV-1 ובהדבקה בנגיף. פרוטוקולים אלה כוללים את ההפלה בתיווך lentivirus של סמני UPR, כמו גם טיפול עם גורמי לחץ פרמקולוגיים במיון. מאמר זה מציג גם את סוגי הקריאה שניתן להשתמש בהם כדי למדוד את ביטוי הגן HIV-1, ייצור ויראלי, כמו גם את ההדבקה של הנגיפים המיוצרים, כגון בדיקת לוציפראז מבוססת לוציפראז מסוף ארוך (LTR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים p24 (ELISA) ובדיקת צביעה של כתב β-גל בהתאמה.

באמצעות רוב הפרוטוקולים הללו, דיווחנו לאחרונה על המשמעות התפקודית של זיהום HIV-1 על UPR בתאי T23, והתוצאות של מאמר זה מצביעות על אמינות השיטות המתוארות כאן. לפיכך, מאמר זה מספק סדרה של שיטות למידע מקיף לגבי יחסי הגומלין של HIV-1 עם מתח ER והפעלת UPR.

Protocol

הערה: קווי התאים המשמשים כאן הם HEK-293T ו- Jurkat J6 (קו תאים CD4+T), שהתקבלו ממאגר התא, NCCS, פונה, הודו; TZM-bl, קו תאים הנגזר מ- HeLa ששילב עותקים של גנים β-גלקטוזידאז ולוציפראז תחת מקדם החזרה הטרמינלית הארוכה של HIV-1 (LTR)24 ו- CEM-GFP (קו תאים נוסף של כתב CD4+ T)25 התקבלו ממאגר האיידס של NIH, ארה"ב.

1. הכנה ואחסון מלאי וירוס HIV-1

  1. הכנת מלאי וירוס HIV-1
    הערה: מומלץ לתרגל הנחיות בינלאומיות הקשורות לבטיחות ביולוגית כפי שהן זמינות במדריך ארגון הבריאות העולמי (WHO) או המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) בכל הניסויים הקשורים ל- HIV-1. הטיפול בנגיף וכל ניסוי עם הנגיף החי צריך להיעשות רק בארון בטיחות ביולוגית מתאים השוכן לפחות במעבדת הכלה ברמת BSL2. ייצור חלקיקי HIV-1 זיהומיים באמצעות ערכת העברת יונקים סידן פוספט מתואר בסעיף זה של הפרוטוקול.
    1. זרעו תאי HEK-293T בצלחות של 90 מ"מ עם 10 מ"ל של שלם (בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) DMEM (מדיום הנשר המעובד של דולבקו) בארון בטיחות ביולוגית מסוג A2 מסוג II ושמרו כ-12 שעות באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C כך שמפגש התאים הוא בין 50%-60%.
    2. למחרת, הכינו את תערובת הטרנספקציה: הכינו תמיסה A המכילה 25 מיקרוגרם של pNL4.3 (שיבוט מולקולרי של HIV-1) DNA פלסמיד בחיץ סטרילי, 86.8 μL של 2 M CaCl2, ואת המים הסטריליים הנותרים כדי ליצור את הנפח הסופי 700 μL עבור כל צלחת. הכינו תמיסה B המכילה 700 מיקרוליטר של 2x מלח חוצץ HEPES (HBS) עבור צלחת אחת. לאחר מכן, התאם את החישוב עבור המספר הכולל של הלוחות.
    3. כעת הוסף את פתרון ב' לתמיסה א' באופן טיפתי תוך ערבול מתמשך של פתרון א'. הנפח הכולל של תערובת transfection עכשיו הופך 1.4 מ"ל עבור צלחת אחת.
      הערה: הוספה מדויקת של פתרון B לתמיסה A מבחינת טיפה בזמן שמערבולות רציפות מובילות להיווצרות קומפלקסים מושלמים של טרנספקציה.
    4. דוגרים על תערובת זו בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ-20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לאט את התערובת טיפה לכל צלחת המכילה 9 מ"ל טריים של DMEM מלא והעבירו את הצלחות לאינקובטור CO2 . לאחר 8-10 שעות, שנה את המדיה הקיימת עם טרי 10 מ"ל של DMEM מלא.
    5. לאחר 24 שעות לאחר שינוי במדיה, אספו את הסופרנאטנט (המכיל את חלקיקי הנגיף) מכל הלוחות בצינורות חרוטיים. צנטריפוגה במהירות של 600 x גרם למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה (רשימת חומרים) לסילוק פסולת תאים.
    6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליאלומרים ומניחים אותם ברוטור המתנדנד של אולטרה-צנטריפוגה (טבלה של חומרים). בדקו את משקל מחזיקי הצינוריות לאיזון והתאימו עם מדיום סטרילי במידת הצורך.
    7. אולטרה-צנטריפוגה ב 1,41,000 x גרם במשך 2.5 שעות ב 4 °C (75 °F). לאחר מכן, בזהירות להוציא את הצינורות ולרוקן את supernatant לאט בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    8. לגלולה (שהיא הנגיף המרוכז כעת) בכל צינור, הוסף 1 מ"ל של RPMI לא שלם (Roswell Park Memorial Institute) 1640 בינוני ובצע פיפטינג נמרץ כדי לעקור את הכדור.
      הערה: הגלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה כמעט בלתי נראית לעין בלתי. לכן, יש להקפיד להוסיף RPMI 1640 באמצע הצינור, כך שהגלולה תסולק כראוי.
    9. לאחר מכן, להוסיף 25 μL של 1 M HEPES pH 7.4 ל 1 מ"ל של השעיית וירוס. Aliquot 50 μL של התרחיף לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל ואחסן אותם במקפיא -80 °C באופן מיידי לאחסון לטווח ארוך.
  2. כימות ריכוז הנגיף והדבקת הנגיפים
    הערה: לצורך חישוב ההדבקה של הנגיף, חיוני תחילה לכמת את ריכוזו, אשר נעשה על ידי p24 Antigen Capture ELISA (על פי הוראות היצרן ולכן אינו מתואר כאן; ראה טבלת חומרים). תהליך זה נותן את ריכוז הנגיף בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) של המלאי, אשר משמש לאחר מכן לזיהוי מספר הנגיפים הזיהומיים במלאי באמצעות הניסוי הבא בתאי כתב TZM-bl26.
    1. לספור ולזרוע 0.1 x 106 תאי TZM-bl בצלחת 24 באר באמצעות 500 μL של DMEM מלא עבור כל באר ולשמור אותו באינקובטור תרבית תאים במשך 10-12 שעות.
    2. יש לוודא שהתאים נמצאים במפגש של 50%-60% לפני תחילת ההדבקה לצורך כימות הנגיף. שנה את המדיה הקיימת עם 250 μL של DMEM מלא טרי לכל באר.
      הערה: שמור היטב על בקרה חיובית כדי לשלול כל תקלה ניסיונית.
    3. חשב את כמות וירוס המלאי הדרוש לזיהומים של 1 ng, 0.1 ng ו- 0.01 ng בכפילויות. הוסף את כמות הנגיף המתאימה לבארות ושמור את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    4. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של DMEM לא שלם ולאחר מכן להוסיף 500 μL של DMEM מלא.
    5. המשך בהליך צביעת β-גל לאחר 36 שעות של החלפת מדיה.
      1. השליכו את המדיה הקיימת ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 500 μL של תמיסת הקיבוע (0.25% גלוטראלדהיד ב- PBS) לכל באר ודגר ב- RT בתוך ארון הבטיחות הביולוגית למשך 5-7 דקות.
      2. הכינו את תמיסת הצביעה כמפורט בטבלה 1. הרחק אותו מאור מכיוון ש- X-gal רגיש לאור.
      3. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS. לכסות את התאים עם 500 μL של תמיסת צביעה מוכן טרי לדגור ב 37 ° C בחושך במשך 2-18 שעות.
      4. כדי לעצור את התגובה לאחר מכן, שטפו את התאים עם 500 μL של 3% dimethyl sulfoxide (DMSO) ב-PBS פעמיים ולאחר מכן שמרו את התאים ב-500 μL של PBS טרי.
      5. ספרו את התאים הכחולים הנגועים (כפי שמוצג באיור 1A) מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור 5 שדות אקראיים. קח ספירה ממוצעת של 5 השדות והכפיל אותה עם גורם השדה וגורם הדילול. זה מכמת את חלקיקי הנגיפים המזהמים במלאי הנגיף.
        הערה: עבור צלחת באר 24, מקדם השדה הוא 75.
רכיביםהכנהעוצמת קול נדרשת
PBSהכינו PBS 1x ממלאי של 10x PBS14 מ"ל
אשלגן פרי-פרו ציאנידלהמיס 0.82 גרם של אשלגן Ferricyanide ו 1.06 גרם של אשלגן Ferrocyanide ב 25 מ"ל של 1x PBS0.75 מ"ל
מגנזיום כלורי1 מ"ל ב-1 מ"ל של 1x PBS15 מיקרוליטר
אקס-גללהמיס 30 מ"ג ב 0.6 מ"ל של N,N-dimethyl formamide (בחושך)0.3 מ"ל
סה"כ = 15 מ"ל

טבלה 1: רשימת הרכיבים הדרושים לצביעה β-gal בתאי TZM-bl.

2. זיהום HIV-1 של קווי תאי T

  1. הפשרה ותרבית קו תאי T שהונצח. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי CEM-GFP בתרבית במדיום RPMI 1640 מלא בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-500 מיקרוגרם/מ"ל G418.
  2. לספור ולקחת 2 מיליון תאים עבור כל נקודת זמן (לא נגוע, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות). קצור את התאים הלא נגועים באופן מיידי על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות והוסף חיץ ליזה התא (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז, 0.5 mM פנילמתיל סולפוניל פלואוריד (PMSF) ומעכב פוספטאז 1x (50 μL עבור 1-3 מיליון תאים) או lyse במגיב Trizol (1 מ"ל עבור 1-3 מיליון תאים) לבידוד RNA (ראה טבלה של חומרים).
  3. שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 מלא המכיל פוליברן (5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-100 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם.
    הערה: פוליברן הוא פולימר קטיוני המשמש להגברת זיהום רטרו-ויראלי בתאי יונקים.
  4. להשעות מחדש את 8 מיליון התאים ב 1 מ"ל של פוליברן המכיל מדיום מלא. כעת חשבו את נפח המלאי הנגיפי הדרוש ל-4 מיליון חלקיקי נגיפים, הוסיפו את מלאי הנגיף, והרכיבו את הנפח הכולל ל-2 מ"ל על ידי הוספת מדיה שלמה. זה הופך אותו ל-MOI של 0.5.
  5. שמור את התאים בתוך אינקובטור CO2 ב 37 ° C במשך 4 שעות, עם הקשה לסירוגין כל 30-45 דקות.
  6. לאחר 4 שעות, סובבו את התאים כלפי מטה והשליכו את הסופרנאטנט בזהירות לתוך ארון הבטיחות הביולוגית עם שיטות סילוק מתאימות.
    הערה: משלב זה ואילך, בצע צנטריפוגה של התאים במהירות של 100 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
  7. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מדיום שלם. להשהות מחדש את התאים ב 8 מ"ל של תווך שלם, מה שהופך אותו 1 מיליון תאים / מ"ל.
  8. בצלחת תרבית רקמה של 6 בארות, זרעו מספר שווה של תאים במספר הבארות הנדרש ושמרו את הצלחת באינקובטור CO2 נשמר ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. במשך 4 הימים הבאים, קצרו את התאים כל 24 שעות על ידי הוספת מאגר ליזה של תאים. כמו כן, לאסוף את supernatant ומיד להעביר אותו למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  10. כדי לבדוק אם התרחשה הדבקה, המשך ללכידת אנטיגן p24 ELISA עבור כל נקודות הזמן. בצע דילול נכון עבור נקודות הזמן, כלומר, דילול נמוך יותר עבור נקודות זמן ראשוניות וגבוה יותר עבור נקודות זמן מאוחרות יותר בטווח של 1:50 עד 1:500. שרטטו את הקריאות בגרף שמתאר את התקדמות הזיהום (איור 1B).

3. צביעת תיאופלבין T לקביעת לחץ בחדר מיון

  1. תקן 1 מיליון תאי CEM-GFP נגועים ו- 0.5 MOI נגועים (נלקחו 72 שעות תאים נגועים) עם 200 μL של 4% paraformaldehyde ב- PBS למשך 20 דקות ב- RT.
  2. גלולה למטה את התאים ב 100 x גרם במשך 5 דקות ולטפל עם 500 μL של 0.1 M גליצין במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 500 μL של PBS פעמיים. להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של PBS.
  3. הרכיבו את שקופיות הזכוכית, כרטיסי הסינון ותאי הדגימה. הוסף את 100 μL של תאים מרחפים לתאי הדגימה וסובב את התאים ב 1000 x גרם במשך 4 דקות כדי להדביק את התאים לשקופיות בציטוצנטריפוגה (טבלה של חומרים).
    הערה: לא יהיו מספיק תאים משותקים בשקופית בעקבות הצנטריפוגה הציטוצנטריפוגה אם תרחיף התא מדולל מדי. התאים צפויים להתגבש ולהיות מפוזרים בצורה גרועה לאחר הציטוצנטריפוגה, אם תרחיף התא מרוכז מאוד.
  4. חדרו את התאים למשך 10 דקות באמצעות טיפות של 0.1% Triton-X-100 ב-PBS (מספיק כדי לכסות את האזור שבו התאים נצמדו) ושטפו את התאים פעמיים על ידי הנחת PBS עם טיפה וניגוב PBS עם רקמה על ידי הטיית המגלשה.
  5. לדגור על התאים עם 10 μL של 5 מיקרומטר Thioflavin T במשך 30 דקות.
    הערה: אין לשטוף לאחר הדגירה עם ThT.
  6. הרכיבו את המגלשות באמצעות 5 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה (80% גליצרול v/v, 20% PBS v/v ו-8 מ"ג/מ"ל 1,4-diazabicyclo[2.2.2]אוקטן [DABCO]), הניחו את הכיסוי ואטמו את הכיסוי באמצעות לק. השאירו את המגלשות להתייבש.
    הערה: בכל השלבים האלה, ודא שהתאים אינם מתייבשים.
  7. צלם תמונות קונפוקליות של תאים קבועים עם עדשת טבילה גליצרול 63x במיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים). התאם את הגדרות העירור והפליטה הבאות: GFP (לדוגמה 494 ננומטר, Em. 519 ננומטר) ו-ThT (לדוגמה 458 ננומטר, Em. 480-520 ננומטר).
    הערה: יש לצלם כל ערוץ פלואורסצנטי ברצף, ולא בו-זמנית, כדי למנוע חפיפת ערוץ. GFP נלקח כאינדיקציה לזיהום HIV-1 כמו תאי CEM-GFP יש GFP תחת רגולציה של מקדם LTR, אשר יורה על זיהום HIV-125.
  8. המר את התמונות הפלואורסצנטיות ל- 8 סיביות לפני כימות באמצעות ניתוח סף. כמת את העוצמה של כל תא באופן ידני באמצעות תוכנה כמו Image J (~ 50 תאים)27. התווה את הגרף עם העוצמה של כל תא כנקודות על ציר Y כנגד קריטריונים לא נגועים ונגועים.
  9. כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה, קח שליטה חיובית, למשל, טיפול Thapsigargin (ידוע ER מתח inducer) במקרה זה28. טפל במיליון תאי CEM-GFP, כל אחד עם 1 μL של DMSO (בקרת רכב) ו -100 ננומטר של Thapsigargin במשך 12 שעות.
  10. קצרו את התאים ועברו תהליך לצביעת ThT כפי שהוזכר עבור דגימות נגועות (שלבים 3.1-3.8).
    הערה: עבור דגימות אלה, פלואורסצנטיות GFP אינה נדרשת. לפיכך, רק פלואורסצנטיות ThT נלכדת במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. קביעת ההפעלה והביטוי של סמני UPR שונים

הערה: כדי לקבוע את הביטוי של סמני UPR נעשה שימוש בשתי שיטות: Immunoblotting ו- RT-PCR. עבור immunoblotting, לקצור את 0.5 MOI HIV-1 נגוע תאים CEM-GFP בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה (24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, ו 96 שעות לאחר ההדבקה) ולהשעות מחדש את גלולת התא בחיץ ליזה (כפי שהוזכר בשלב 2.2). לחלופין, עבור RT-PCR, כדורי התא הם lysed מגיב Trizol (1 מ"ל עבור 1-3 מיליון תאים) (ראה טבלה של חומרים). התאים המרחפים מחדש במאגר ליזיס ובמגיב טריזול יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

  1. Immunoblotting לניתוח של סמני UPR.
    1. שמור את התאים המרחפים מחדש במאגר הליזיס על קרח למשך 45 דקות עם ערבוב לסירוגין באמצעות מערבולת.
    2. הפילו את התאים במהירות של 18000 x גרם למשך 15 דקות באמצעות צנטריפוגה מהירה (ראו טבלת חומרים). אספו את הסופרנאטנט בצינור טרי.
    3. כמת את ריכוז החלבון בכל דגימה באמצעות ברדפורד או מגיב דומה.
    4. קח ריכוז שווה של חלבון עבור כל דגימה והכן את דגימות החלבון במאגר Laemmli (מאגר 6x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% SDS, 30% גליצרול ו-0.02% ברומופנול כחול; 5% β-מרקפטואתנול).
      הערה: עבור immunoblotting עבור כל סמן UPR, מינימום של 60-80 מיקרוגרם של חלבון שימש.
    5. מרתיחים את דגימות החלבון בטמפרטורה של 96°C למשך 5 דקות ונותנים סיבוב קצר.
    6. יש לפענח את דגימות החלבון בג'ל SDS-PAGE 10%-12% ולהעביר את החלבונים לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים).
    7. יש לחסום עם חלב יבש 5% ללא שומן או אלבומין בסרום בקר (BSA) למשך 1-2 שעות, לשטוף פעמיים עם TBST (20 mM Tris pH7.4 ו-0.137 M NaCl; 0.1% Tween 20), ולבדוק עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לחלבון כנגד סמני UPR (ראו טבלת חומרים) בנדנדה, למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת לאחר שטיפת הכתמים פעמיים עם TBST, יש לבדוק עם נוגדנים משניים מתאימים במשך שעה וחצי.
    8. שטפו שוב את הכתמים עם TBST ודמיינו את רצועות החלבונים באמצעות מצע לזיהוי כימילומינסנציה (ראו טבלת חומרים) במכשיר הדמיה מערבי של כתם.
  2. RT PCR
    1. בודדו את הרנ"א הכולל מהתאים באמצעות מגיב טריזול (ראו טבלת חומרים).
    2. הכן את cDNA מריכוז שווה של RNA באמצעות Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT) (ראה טבלת חומרים).
    3. נתח את האפנון של ביטוי mRNA של HSPA5, שחבור XBP1, ATF4, CHOP ו- GADD34 באמצעות qRT-PCR עם פריימרים ספציפיים לגן (טבלה 2). בקצרה, הכינו תערובות תגובה של 10 μL המכילות תבנית cDNA (100 ng), 5 μL של צבע ירוק SYBR (ראו טבלת חומרים), ו-10 pmol של כל זוג פריימר אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן. כוונן את עוצמת הקול באמצעות H2O סטרילי.
    4. הפעל את התערובות במכשיר PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית ב- 95 ° C למשך 3 דקות ו- 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, 55 ° C עבור 30 שניות ו- 72 ° C במשך 30 שניות ולאחר מכן ניתוח עקומת ההתכה. חישוב שינוי הקיפול בביטוי גן המטרה ביחס לגן משק הבית (לדוגמה β-Actin) כ:
      שינוי קיפול = 2-Δ(ΔCT)
      כאשר ΔCT = CT (מטרה) − CT (גן לשמירה על הבית)
      ו-Δ(ΔCT) = ΔCT (מטופל) -ΔCT (בקרה)
    5. כדי לאשר עוד יותר את השחבור של XBP1, בצע RT-PCR כמותי למחצה עם דגימות לא נגועות ו 72 שעות נגועות.
      הערה: שחבור של XBP-1 mRNA נחקר באמצעות RT-PCR ברחבי אתר החיבור.
    6. הגבירו את ה-cDNA עם פריימרים XBP1 (טבלה 2) באמצעות תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה (ראו טבלת חומרים) בתנאים הבאים: מחזור אחד של 98°C למשך 30 שניות, ואחריו 5 מחזורים של 98°C למשך 15 שניות, 65*Δ-5°C למשך 30 שניות ו-72°C למשך 30 שניות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 98°C למשך 15 שניות, 55 ° C עבור 30 s ו 72 ° C עבור 30 שניות, ואחריו הארכה סופית של 72 ° C למשך 10 דקות להחזיק ב 4 °C (75 °F).
    7. יש להפריד את האמפליקונים על ג'ל אגרוז 2.5% המכיל 50 ננוגרם של אתידיום ברומיד/מ"ל ולדמיין במכשיר ג'ל דוק. רצועת XBP1 קטנה יותר ב-26 נוקלאוטידים.

5. הפלת סמני UPR וניתוח ביטוי גנים מונע HIV-1 LTR וייצור וירוסים

  1. הכנת מבני shRNA להפלה של סמני UPR
    1. צור מבני shRNA באמצעות עמוד השדרה הווקטורי pLKO.1-TRC (וקטור שיבוט לנטיויראלי)29.
    2. בניית שני מבני shRNA לכל גן (IRE1, PERK, ATF6 ו-HSPA5). אוליגונוקלאוטידים של חושים ואנטי-סנסים המכוונים ל-mRNA של הגן בהתאמה מתוכננים על-ידי RNAi Consortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (טבלה 3).
      הערה: באופן דומה, ניתן ליצור מבני shRNA עבור סמני UPR אחרים.
    3. אנל את הפריימרים (100 ננומטר כל אחד קדימה ואחורה) ב 95 ° C ולאחר מכן קירור הדרגתי RT.
    4. לאחר מכן, הכניסו אותו לאתרי Age1 ו-EcoRI של וקטור pLKO.1 באמצעות ליגאז דנ"א T4 (ראו טבלת חומרים). אשר את הרצף על ידי ריצוף DNA.
      הערה: מבנה shRNA המכוון לגן LacZ משמש כבקרה שאינה ממוקדת.
  2. הפלת PERK, ATF6, IRE1 ו- HSPA5 בתאי HEK-293T, בדיקת Luciferase ו- p24 ELISA
    1. הכינו תערובת של מבנה shRNA (0.9 מיקרוגרם) ומגיב טרנספקציה כמו פוליאתילנימין (PEI) (3 מיקרוליטר של PEI עבור 1 מיקרוגרם DNA) (ראו טבלת חומרים) ב-50 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום על ידי ערבול ודגירת במשך 20 דקות.
    2. מתאי HEK-293T המכילים צלוחיות, טריפסיניזציה וזרעים ~ 0.25 x 106 תאים יחד עם תערובת הטרנספקציה בצלחת 24 באר, מה שהופך את הנפח הכולל של 125 μL ודגרה במשך 6 שעות ב 37 ° C באינקובטור CO2 . שיטה זו נקראת טרנספקציה הפוכה שבה התאים נזרעים יחד עם תערובת הטרנספקציה.
    3. לאחר 6 שעות, להוסיף 125 μL של מדיה מלאה לבארות ולהשעות מחדש את התאים אפילו זריעה.
      הערה: עבור ניסויי הדחה, טרנספקציה הפוכה (שלבים 5.2.1-5.2.3) מספקת יעילות טובה יותר הן עם shRNA והן עם siRNAs.
    4. לאחר 24 שעות, לבצע transfection השני. הכינו תערובת של pNL4-3 (100 ננוגרם), pLTR-Luc (100 ננוגרם) ו-pEGFP-N1 (50 ננוגרם) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) מבנים עם PEI (3 מיקרוליטר של PEI עבור 1 מיקרוגרם DNA) ב-50 מיקרוליטר של מדיה לא שלמה על ידי מערבולת. דגרו על התערובת במשך 20 דקות ב-RT. החליפו את המדיה הקיימת ב-250 μL של מדיה טרייה לא שלמה והוסיפו את התערובת לתאים.
      הערה: וקטור כתב עבור HIV-1 LTR פותח על ידי תת-שיבוט LTR מ-pU3RIII30,31 ל-pGL3basic במעבדה מוקדם יותר32. ביטוי GFP באמצעות pEGFP-N1 נוצל כדי לנרמל את יעילות הטרנספקציה32.
    5. שנה את המדיה לאחר 6 שעות לאחר הטרנספקציה עם 500 μL של DMEM מלא. לקצור את התאים לאחר 36 שעות עבור immunoblotting ו luciferase assay.
    6. לבדיקת לוציפראז, יש לתלות את התאים ולהשהות מחדש במצע לוציפראז שנרכש מסחרית (50 μL) (ראה טבלת חומרים). מוסיפים את ליזט התא המרחף לצלחת אטומה של 96 בארות ודגרים במשך 10-15 דקות. קבל את קריאת luciferase בלומינומטר. כמו כן, למדוד פלואורסצנטיות GFP באותן דגימות כדי לנרמל את קריאת לוציפראז בקורא לוחות microplate micromode (לדוגמה: 494 ננומטר, Em:519 nm).
    7. התווה את הגרף כיחידת לוציפראז/GFP על ציר Y.
      הערה: יש לבדוק את ההפלה של סמני UPR המתאימים, וניתן לעשות זאת על ידי immunoblotting או qRT-PCR באמצעות נוגדנים או פריימרים ספציפיים לגן, בהתאמה.
    8. אספו את הסופרנאטנטים לעיבוד עבור p24 ELISA כפי שהוזכר לעיל.
  3. יצירת תאים יציבים עם הפלת סמני UPR וזיהום HIV-1.
    1. הכן את חלקיקי Lentivirus על ידי הדבקת תאי HEK-293T שנזרעו בצלחת 6 בארות, עם מבני shRNA (1 מיקרוגרם) המתאימים יחד עם pMD2.G (וקטור מעטפת VSV-G) (0.75 מיקרוגרם), ו- psPAX2 (פלסמיד אריזה לנטיויראלי) (0.25 מיקרוגרם) (ראה טבלת חומרים) באמצעות PEI ביחס של 1 מיקרוגרם DNA: 3 μL של PEI. הכינו את התערובת ב-100 מיקרוליטר של DMEM לא שלם ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. הוסיפו את התערובת ל-1.8 מ"ל של מדיה מלאה בתאי HEK-293T שנזרעו.
      הערה: זרעו תאי HEK-293T בצלחת 6 בארות לפחות 12 שעות לפני הטרנספקציה עד שהם מקבלים מורפולוגיה והם בערך 60-70% במפגש.
    2. לאחר 24 שעות של transfection, להוסיף 1 מ"ל של DMEM מלא לכל באר.
    3. יש לאסוף את הסופרנאטנטים לאחר 48 שעות, לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C, ולבצע p24 ELISA כדי לאשר את נוכחות הנגיף בסופרנאטנטים אלה. השתמש בסופרנאטנט לנטיויראלי גולמי זה להמרת תאי J6.
    4. לדגור על 2 מיליון תאים בצלחת 6 בארות עם נפח שווה של סופרנאטנט לנטיויראלי (500 μL) עבור כל לנטיוירוס בקרה והגנה ספציפי לגן ולהוסיף תווך RPMI 1640 שלם טרי בנוכחות פוליברן (5 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להשלים את הנפח ל -2 מ"ל.
    5. לאחר 24 שעות, הוסף Puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר כדי לבחור תאים יציבים. לאחר הוספת Puromycin, גלולה את התאים כל 24 שעות ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה טרייה עם Puromycin.
    6. עשו זאת עד שלא יהיה מוות תאי (~ שבוע). התאים ששרדו הם התאים היציבים עם הפלה גנטית רצויה.
      הערה: ניתן לבדוק את הפלת הגנים בהתאמה במרווחי זמן קבועים, ולבסוף, כאשר רק תאים ששרדו נראים במדיה המכילה פורומיצין באמצעות אימונובלוטינג או qRT-PCR.
    7. להדביק את LacZ ואת תאי knockdown ספציפיים לגן עם 0.5 MOI של HIV-1 כמתואר בסעיף 2 ולקצור את התאים 48 שעות לאחר ההדבקה.
    8. לאסוף את supernatant מכל דגימה ותהליך עבור p24-ELISA כפי שתואר קודם לכן, ולעבד את התאים כדי לבדוק את רמת knockdown על ידי immunoblotting.

6. טיפול בגורם מתח במיון וניתוח השפעתו על שכפול HIV-1

הערה: כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי יתר של UPR במהלך שכפול HIV-1, ניתן להשתמש במולקולת השראות הפרמקולוגית, Thapsigargin.

  1. קביעת אחוזי הכדאיות של התא לאחר טיפול ב- Thapsigargin.
    הערה: ציטוטוקסיות של Thapsigargin נקבעת על ידי מגיב MTT (ראה טבלת חומרים).
    1. זרע 25,000-30,000 תאי CEM-GFP לכל באר בצלחת 96 באר המכילה 100 μL של RPMI מלא 1640. הוסף 100 ננומטר Thapsigargin למדיה ודגור ב 37 ° C באינקובטור.
      הערה: תאים שטופלו עם 1 μL של DMSO נלקחו כבקרת רכב.
    2. לאחר 48 שעות, להוסיף 10 μL של MTT (5 מ"ג / מ"ל) בכל באר לדגור בחושך במשך 4 שעות עבור היווצרות גבישי formazan ב 37 ° C עם 5% CO2.
    3. לאחר 4 שעות, ממיסים את הגבישים באמצעות 100 μL של איזופרופנול ליצירת צבע סגול ומודדים את הספיגה ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    4. חישוב אחוז הכדאיות של התא בהתבסס על המשוואה המופיעה להלן
      % כדאיות התא = (שליטהOD570 -OD570 טיפול) / שליטהOD570 x 100
  2. טיפול מקדים ב- Thapsigargin וניתוח התקדמות זיהום HIV-1 על ידי p24 ELISA.
    1. זרעו מיליון תאי CEM-GFP בצלחת באר 12 המכילה 1 מ"ל של RPMI מלא 1640 וטפלו בתאים עם 100 ננומטר של Thapsigargin או 1 μL של DMSO (בקרת רכב) במשך 12 שעות באינקובטור CO2 הנשמר ב 37 ° C. לאחר 12 שעות, לשטוף את התאים עם RPMI מלא 1640 ולהדביק עם 0.5 MOI של HIV-1 כפי שתואר קודם לכן.
    2. קצרו את התאים בנקודות זמן שונות, כגון 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה, לצורך אימונובלוטינג.
    3. אספו את הסופרנאטנטים מכל דגימה ובצעו p24 ELISA כפי שתואר קודם לכן.
    4. התווה את הגרף עם ריכוז p24 במדגם כציר Y ונקודות הזמן בהתאמה כציר X.
    5. באמצעות immunoblotting, לנתח את השראת מתח ER עקב טיפול Thapsigargin על ידי מדידת הרמה של כל סמני UPR. מחקר זה השתמש ב- HSPA5 כסמן.

7. בדיקת זיהום TZM-bl β-gal לקביעת ההשפעה של UPR על הידבקות בנגיפים

הערה: כדי להבין את התפקיד של UPR בהדבקה של הנגיף, ניתן להשתמש בסופרנאטנט מהדפיקה כמו גם בטיפול ב- Thapsigargin, לבדיקת זיהום TZM-bl β-gal כמתואר בסעיף 1.2, בהתבסס על ריכוז p24 שנקבע על ידי p24 ELISA.

  1. להדביק תאי TZM-bl בריכוז שווה של p24 מכל דגימה ולבצע צביעה β-gal. ספרו את התאים הכחולים הנגועים תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור 5 שדות אקראיים.
  2. קח ממוצע של הספירה של 5 השדות עבור כל דגימה מהשלבים לעיל.
  3. חשב את שינוי הקיפול כמפורט להלן:
    שינוי קיפול = מספר ממוצע של תאים כחולים בדגימות הבדיקה/מספר ממוצע של תאים כחולים בדגימת הבקרה.

תוצאות

בעבודה זו תיארנו פרוטוקול מפורט לחקר עקה במיון חוץ גופי והפעלת UPR בעת הידבקות ב-HIV-1 בתאי T (איור 2). מחקר זה מתאר גם שיטות לניתוח הרלוונטיות התפקודית של UPR בשכפול HIV-1 ובהדבקת נגיפים (איור 3).

לשם כך, ניתחנו את הלחץ בחדר המיון ...

Discussion

היקף הפרוטוקול הנוכחי כולל (i) טיפול במלאי נגיף HIV-1 ומדידת ריכוז הנגיף והדבקה בנגיף, (ii) זיהום תאי T ב- HIV-1 והערכת השפעתו על לחץ ER וסמנים שונים של UPR, (iii) השפעת הפלת סמני UPR והשפעתם על פעילות גנים מונעת HIV-1 LTR, ייצור וירוסים והדבקה בנגיפים ו-(iv) גירוי יתר של ה-UPR באמצעות מולקולה פר?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים למרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, על התמיכה הפנימית. AT ו- AD אסירי תודה על תמיכת המחקר לתואר שלישי שהתקבלה מהמרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. DM אסירת תודה על המלגה הלאומית של JC Bose מ- SERB, ממשלת הודו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

References

  1. Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ERUPRHIV 1TT ThTUPRBiPIRE1PERKEIF2XBP1ATF6ATF4CHOPGADD34HIV 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved