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Résumé

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Résumé

Les infections virales peuvent provoquer un stress du réticulum endoplasmique (RE) en raison d’une accumulation anormale de protéines, conduisant à une réponse protéique dépliée (UPR). Les virus ont développé des stratégies pour manipuler l’UPR de l’hôte, mais il y a un manque de compréhension détaillée de la modulation de l’UPR et de son importance fonctionnelle pendant l’infection par le VIH-1 dans la littérature. Dans ce contexte, le présent article décrit les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour mesurer les niveaux de stress du RE et l’UPR pendant l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T et l’effet de l’UPR sur la réplication virale et l’infectiosité.

La coloration à la thioflavine T (ThT) est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter le stress du RE dans les cellules en détectant les agrégats de protéines. Ici, nous avons illustré le protocole de coloration ThT dans les cellules infectées par le VIH-1 pour détecter et quantifier le stress du RE. De plus, le stress du RE a également été détecté indirectement en mesurant les niveaux de marqueurs UPR tels que BiP, IRE1 phosphorylé, PERK et eIF2α, l’épissage de XBP1, le clivage de ATF6, ATF4, CHOP et GADD34 dans les cellules infectées par le VIH-1, en utilisant l’immunoblot conventionnel et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (RT-PCR). Nous avons constaté que la fluorescence ThT est en corrélation avec les indicateurs d’activation de l’UPR. Cet article présente également les protocoles permettant d’analyser l’impact du stress RE et de la modulation UPR sur la réplication du VIH-1 par des expériences d’inactivation ainsi que l’utilisation de molécules pharmacologiques. L’effet de l’UPR sur l’expression/réplication du gène VIH-1 et la production de virus a été analysé par des tests rapporteurs de la luciférase et par ELISA de capture de l’antigène p24, respectivement, tandis que l’effet sur l’infectiosité du virion a été analysé par coloration des cellules rapporteures infectées. Collectivement, cet ensemble de méthodes fournit une compréhension complète des voies de réponse protéique dépliée pendant l’infection par le VIH-1, révélant sa dynamique complexe.

Introduction

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) se caractérise par une réduction progressive du nombre de lymphocytes T CD4+, ce qui entraîne une défaillance progressive de la réponse immunitaire. Le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est l’agent causal du sida. Il s’agit d’un virus à ARN simple brin enveloppé, de sens positif, avec deux copies d’ARN par virion et appartenant à la famille des rétroviridae. La production de fortes concentrations de protéines virales dans la cellule hôte exerce une pression excessive sur la machinerie de repliement des protéines de la cellule1. Le RE est le premier compartiment de la voie sécrétoire des cellules eucaryotes. Il est chargé de produire, de modifier et de délivrer des protéines à la voie sécrétoire et aux sites cibles de l’espace extracellulaire. Les protéines subissent de nombreux changements post-traductionnels et se replient dans leur conformation naturelle dans le RE, y compris la glycosylation liée à l’asparagine et la création de liaisons disulfure intra- et intermoléculaires2. Par conséquent, de fortes concentrations de protéines sont présentes dans la lumière du RE et celles-ci sont très sujettes à l’agrégation et au mauvais repliement. Diverses conditions physiologiques, telles que les chocs thermiques, les infections microbiennes ou virales, qui exigent une synthèse accrue des protéines ou une mutation des protéines, entraînent un stress du RE en raison de l’accumulation accrue de protéines dans le RE, perturbant ainsi l’homéostasie de la lumière du RE. Le stress du RE active un réseau de voies de transduction de signal adaptatives hautement conservées, la réponse protéique dépliée (UPR)3. L’UPR est utilisé pour ramener l’état physiologique normal du RE en alignant sa charge protéique dépliée et sa capacité de repliement. Ceci est provoqué par l’augmentation de la taille du RE et des chaperons et foldases moléculaires résidents du RE, ce qui entraîne une augmentation de la capacité de pliage du RE. L’UPR diminue également la charge protéique du RE grâce à l’atténuation globale de la synthèse des protéines au niveau traductionnel et augmente l’élimination des protéines dépliées du RE en régulant à la hausse la dégradation associée au RE (ERAD)4,5.

Le stress du RE est détecté par trois protéines transmembranaires résidentes du RE : la protéine kinase R (PKR) du réticulum endoplasmique kinase (PERK), le facteur de transcription activateur 6 (ATF6) et l’enzyme de type 1 nécessitant l’inositol (IRE1). Tous ces effecteurs sont maintenus inactifs en se liant à la famille des protéines de choc thermique A (Hsp70) membre 5 (HSPA5), également connue sous le nom de protéine de liaison (BiP)/protéine régulée par le glucose de 78-kDa (GRP78). Lors d’un stress RE et d’une accumulation de protéines dépliées/mal repliées, HSPA5 se dissocie et conduit à l’activation de ces effecteurs, qui activent ensuite une série de cibles en aval qui aident à résoudre le stress RE et, dans des conditions extrêmes, favorisent la mort cellulaire6. Lors de la dissociation de HSPA5, PERK s’autophosphoryle et son activité kinase est activée7. Son activité kinase phosphoryle eIF2α, ce qui conduit à une atténuation translationnelle, abaissant la charge protéique de l’ER8. Cependant, en présence du facteur d’initiation phospho-eucaryote 2α (eIF2α), les cadres de lecture ouverts non traduits sur des ARNm spécifiques deviennent préférentiellement traduits, tels que ATF4, régulant les gènes induits par le stress. ATF4 et la protéine homologue C/EBP (CHOP) sont des facteurs de transcription qui régulent les gènes induits par le stress et régulent les voies d’apoptose et de mort cellulaire 9,10. L’une des cibles d’ATF4 et de CHOP est la protéine d’arrêt de croissance et inductible par des dommages à l’ADN (GADD34), qui, avec la protéine phosphatase 1, déphosphoryle peIF2α et agit comme un régulateur de rétroaction pour l’atténuation translationnelle11. Sous stress RE, ATF6 se dissocie de HSPA5 et son signal de localisation de Golgi est exposé, ce qui entraîne sa translocation vers l’appareil de Golgi. Dans l’appareil de Golgi, ATF6 est clivé par la protéase du site 1 (S1P) et la protéase du site 2 (S2P) pour libérer la forme clivée de l’ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 est ensuite transloqué dans le noyau, où il induit l’expression de gènes impliqués dans le repliement, la maturation et la sécrétion de protéines ainsi que dans la dégradation des protéines12,13. Pendant le stress RE, IRE1 se dissocie de HSPA5, se multimérise et s’auto-phosphoryle14. La phosphorylation d’IRE1 active son domaine RNase, médiant spécifiquement l’épissage de 26 nucléotides à partir de la partie centrale de l’ARNm de la protéine de liaison X-box 1 (XBP1)15,16. Cela génère un nouveau C-terminus conférant une fonction de transactivation, générant la protéine XBP1s fonctionnelle, un puissant facteur de transcription contrôlant plusieurs gènes induits par le stress du RE17,18. L’activité combinée de ces facteurs de transcription active les programmes génétiques visant à restaurer l’homéostasie du RE.

Il existe différentes méthodes pour détecter le stress du RE et l’UPR. Il s’agit notamment des méthodes conventionnelles d’analyse des marqueurs UPR19,20. Diverses méthodes non conventionnelles comprennent la mesure de l’état redox de l’UPR et de la distribution du calcium dans la lumière du RE, ainsi que l’évaluation de la structure du RE. La microscopie électronique peut être utilisée pour voir dans quelle mesure la lumière du RE s’agrandit en réponse au stress du RE dans les cellules et les tissus. Cependant, cette méthode prend du temps et dépend de la disponibilité d’un microscope électronique, qui peut ne pas être disponible pour tous les groupes de recherche. De plus, la mesure du flux de calcium et de l’état redox du RE est difficile en raison de la disponibilité des réactifs. De plus, les résultats de ces expériences sont très sensibles et pourraient être affectés par d’autres facteurs du métabolisme cellulaire.

Une technique puissante et simple pour surveiller les sorties de l’UPR consiste à mesurer l’activation des différentes voies de signalisation de l’UPR et est utilisée depuis des décennies dans divers scénarios de stress. Ces méthodes conventionnelles de mesure de l’activation de l’UPR sont économiques, réalisables et fournissent les informations en moins de temps que d’autres méthodes connues. Il s’agit notamment de l’immunoblot pour mesurer l’expression des marqueurs UPR au niveau des protéines, tels que la phosphorylation de IRE1, PERK et eIF2α et le clivage d’ATF6 en mesurant la forme P50 d’ATF6 et l’expression protéique d’autres marqueurs tels que HSPA5, XBP1 épissé, ATF4, CHOP et GADD34, ainsi que la RT-PCR pour déterminer les niveaux d’ARNm ainsi que l’épissage de l’ARNm XBP1.

Cet article décrit un ensemble validé et fiable de protocoles pour surveiller le stress du RE et l’activation de l’UPR dans les cellules infectées par le VIH-1 et pour déterminer la pertinence fonctionnelle de l’UPR dans la réplication et l’infectivité du VIH-1. Les protocoles utilisent des réactifs facilement disponibles et économiques et fournissent des informations convaincantes sur les résultats de l’UPR. Le stress du RE est le résultat de l’accumulation de protéines dépliées/mal repliées, qui ont tendance à former des agrégats de protéines21. Nous décrivons ici une méthode pour détecter ces agrégats de protéines dans les cellules infectées par le VIH-1. La coloration à la thioflavine T est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter et quantifier ces agrégats de protéines22. Beriault et Werstuck ont décrit cette technique pour détecter et quantifier les agrégats de protéines et, par conséquent, les niveaux de stress du RE dans les cellules vivantes. Il a été démontré que la petite molécule fluorescente thioflavine T (ThT) se lie sélectivement aux agrégats de protéines, en particulier aux fibrilles amyloïdes.

Dans cet article, nous décrivons l’utilisation de ThT pour détecter et quantifier le stress du RE dans les cellules infectées par le VIH-1 et le corrélons à la méthode conventionnelle de surveillance de l’UPR en mesurant l’activation de différentes voies de signalisation de l’UPR.

Étant donné qu’il y a également un manque d’informations complètes concernant le rôle de l’UPR pendant l’infection par le VIH-1, nous fournissons un ensemble de protocoles pour comprendre le rôle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion. Ces protocoles comprennent l’inhibition des marqueurs UPR par les lentivirus ainsi que le traitement avec des inducteurs de stress pharmacologiques du RE. Cet article montre également les types de lecture qui peuvent être utilisés pour mesurer l’expression du gène VIH-1, la production virale ainsi que l’infectivité des virions produits, tels que le test de luciférase basé sur la répétition terminale longue (LTR), le test d’immuno-absorption enzymatique p24 (ELISA) et le test de coloration rapporteur β-gal, respectivement.

En utilisant la majorité de ces protocoles, nous avons récemment rapporté l’implication fonctionnelle de l’infection par le VIH-1 sur l’UPR dans les cellules T23, et les résultats de cet article suggèrent la fiabilité des méthodes décrites ici. Ainsi, cet article fournit un ensemble de méthodes pour obtenir des informations complètes sur l’interaction du VIH-1 avec le stress du RE et l’activation de l’UPR.

Protocole

REMARQUE : Les lignées cellulaires utilisées ici sont HEK-293T et Jurkat J6 (une lignée cellulaire CD4+T), qui ont été obtenues à partir du Cell Repository, NCCS, Pune, Inde ; TZM-bl, une lignée cellulaire dérivée de HeLa qui a intégré des copies des gènes de la β-galactosidase et de la luciférase sous le promoteur de la longue répétition terminale (LTR) du VIH-124 et CEM-GFP (une autre lignée cellulaire rapporteuse de CD4+ T)25 a été obtenue du NIH AIDS Repository, aux États-Unis.

1. Préparation et stockage des stocks du virus VIH-1

  1. Préparation du stock de virus VIH-1
    REMARQUE : Il est conseillé de suivre les directives internationales relatives à la biosécurité telles qu’elles sont disponibles dans le manuel de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) ou des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dans toutes les expériences impliquant le VIH-1. La manipulation du virus et toute expérience avec le virus vivant ne doivent être effectuées que dans une enceinte de biosécurité appropriée située dans un laboratoire de confinement d’au moins niveau BSL2. La production de particules infectieuses du VIH-1 à l’aide d’un kit de transfection de mammifères à base de phosphate de calcium est décrite dans cette partie du protocole.
    1. Semez les cellules HEK-293T dans des boîtes de 90 mm avec 10 ml de DMEM (10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) dans une enceinte de biosécurité de classe II de type A2 et conservez-les pendant environ 12 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C de sorte que la confluence des cellules soit entre 50 % et 60 %.
    2. Le lendemain, préparez le mélange de transfection : Préparez la solution A contenant 25 μg d’ADN plasmidique pNL4.3 (un clone moléculaire du VIH-1) dans un tampon stérile, 86,8 μL de 2 M de CaCl2 et le reste de l’eau stérile pour obtenir le volume final de 700 μL pour chaque plaque. Préparez la solution B contenant 700 μL de solution saline tamponnée à HEPES (HBS) pour 1 plaque. Ensuite, ajustez le calcul pour le nombre total de plaques.
    3. Ajoutez maintenant la solution B à la solution A de manière goutte à goutte tout en vortex continuellement la solution A. Le volume total du mélange de transfection passe maintenant à 1,4 mL pour une plaque.
      REMARQUE : L’addition précise goutte à goutte de la solution B à la solution A tandis que le vortex continu conduit à la formation de complexes de transfection parfaits.
    4. Incuber ce mélange à température ambiante (RT) pendant environ 20 min. Ensuite, ajoutez lentement le mélange goutte à goutte à chaque assiette contenant 9 ml de DMEM complet et transférez les plaques dans l’incubateur de CO2 . Après 8 à 10 h, remplacez le support existant par 10 mL de DMEM complet.
    5. Après 24 heures après le changement de milieu, prélever le surnageant (qui contient les particules virales) de toutes les plaques dans des tubes coniques. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à basse vitesse (Table des matériaux) pour éliminer les débris cellulaires.
    6. Transférez le surnageant dans des tubes d’ultracentrifugeuse polyallomères et placez-les dans le rotor pivotant d’une ultracentrifugeuse (Table des matériaux). Vérifiez l’équilibre du poids des supports de tube et ajustez-le avec un milieu stérile si nécessaire.
    7. Ultracentrifugeuse à 1,41,000 x g pendant 2,5 h à 4 °C. Après cela, retirez soigneusement les tubes et décantez lentement le surnageant à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
    8. À la pastille (qui est maintenant le virus concentré) dans chaque tube, ajoutez 1 ml de milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incomplet et effectuez un pipetage vigoureux pour déloger la pastille.
      REMARQUE : La pastille après l’ultracentrifugeuse est presque invisible à l’œil nu. Il faut donc veiller à ajouter du RPMI 1640 au milieu du tube afin que la pastille soit correctement délogée.
    9. Ensuite, ajoutez 25 μL de 1 M HEPES pH 7,4 à 1 mL de suspension virale. Aliquote 50 μL de la suspension dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et les stocker immédiatement dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
  2. Quantification de la concentration virale et de l’infectiosité du virion
    REMARQUE : Pour calculer l’infectiosité du virus, il est essentiel de quantifier d’abord sa concentration, ce qui est fait par ELISA de capture d’antigène p24 (selon les instructions du fabricant et n’est donc pas décrit ici ; voir le tableau des matériaux). Ce processus donne la concentration du virus en nanogrammes par microlitre (ng/μL) de stock, qui est ensuite utilisé pour identifier le nombre de virions infectieux dans le stock grâce à l’expérience suivante dans des cellules rapporteures TZM-bl26.
    1. Compter et ensemencer 0,1 x 10cellules de 6 TZM-bl dans une plaque de 24 puits à l’aide de 500 μL de DMEM complet pour chaque puits et le conserver dans un incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 12 h.
    2. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 50 % ou 60 % avant de commencer l’infection pour la quantification du virus. Remplacer le milieu existant par 250 μL de DMEM complet frais dans chaque puits.
      REMARQUE : Gardez bien une commande positive pour exclure toute défaillance expérimentale.
    3. Calculez la quantité de virus de stock nécessaire pour les infections de 1 ng, 0,1 ng et 0,01 ng en double. Ajoutez la quantité appropriée de virus dans les puits et maintenez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 h.
    4. Lavez les cellules deux fois avec 500 μL de DMEM incomplet, puis ajoutez 500 μL de DMEM complet.
    5. Procéder à la procédure de coloration à β-gal après 36 h de changement de support.
      1. Jetez le milieu existant et lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Fixez les cellules en ajoutant 500 μL de la solution de fixation (0,25 % de glutaraldéhyde dans le PBS) dans chaque puits et incubez à RT à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité pendant 5 à 7 min.
      2. Préparez la solution de coloration comme indiqué dans le tableau 1. Gardez-le à l’abri de la lumière car X-gal est sensible à la lumière.
      3. Lavez les cellules une fois avec 1 ml de PBS. Recouvrir les cellules de 500 μL de solution de coloration fraîchement préparée et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 2 à 18 h.
      4. Pour arrêter la réaction par la suite, rincez les cellules avec 500 μL de diméthylsulfoxyde à 3 % (DMSO) dans du PBS deux fois, puis conservez les cellules dans 500 μL de PBS frais.
      5. Comptez les cellules infectées bleues (comme illustré à la figure 1A) au microscope avec un grossissement de 10x pour 5 champs aléatoires. Prenez un décompte moyen des 5 champs et multipliez-le par le facteur de champ et le facteur de dilution. Cela permet de quantifier les particules de virion infectieuses dans le stock de virus.
        REMARQUE : Pour une plaque de 24 puits, le facteur de champ est de 75.
ComposantsPréparationVolume requis
PBSPréparez 1x PBS à partir d’un stock de 10x PBS14 ml
Cyanure de potassium ferri-ferroDissoudre 0,82 g de ferricyanure de potassium et 1,06 g de ferrocyanure de potassium dans 25 ml de 1x PBS0,75 mL
Chlorure de magnésium1 M dans 1 mL de 1x PBS15 μL
Gal XDissoudre 30 mg dans 0,6 mL de N,N-diméthylformamide (dans l’obscurité)0,3 mL
Total = 15 mL

Tableau 1 : Liste des composants requis pour la coloration à l’β-gal dans les cellules TZM-bl.

2. Infection par le VIH-1 des lignées de cellules T

  1. Décongeler et cultiver une lignée de lymphocytes T immortalisée. Cette étude a utilisé une lignée cellulaire CEM-GFP cultivée dans un milieu RPMI 1640 complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine et 500 μg/mL de G418.
  2. Comptez et prélevez 2 millions de cellules pour chaque point temporel (Non infecté, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h). Récolter immédiatement les cellules non infectées par centrifugation à 100 x g pendant 5 min et ajouter un tampon de lyse cellulaire (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M de NaCl, 5 mM d’EDTA, 0,5 % de NP40, 0,5 mM de NaF, 1 mM de DTT), complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase, 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 1x inhibiteur de la phosphatase (50 μL pour 1 à 3 millions de cellules) ou lyser dans le réactif Trizol (1 mL pour 1 à 3 millions de cellules) pour l’isolement de l’ARN (voir le tableau des Matériaux).
  3. Lavez les cellules une fois avec 1 mL de milieu RPMI 1640 complet contenant du polybrène (5 μg/mL) à 100 x g pendant 5 min à RT. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet.
    REMARQUE : Le polybrène est un polymère cationique qui est utilisé pour améliorer l’infection rétrovirale dans les cellules de mammifères.
  4. Remettez en suspension les 8 millions de cellules dans 1 mL de polybrène contenant du milieu complet. Calculez maintenant le volume de stock viral requis pour 4 millions de particules de virion, ajoutez le stock de virus et portez le volume total à 2 ml en ajoutant un milieu complet. Cela en fait un MOI de 0,5.
  5. Maintenez les cellules à l’intérieur de l’incubateur de CO2 à 37 °C pendant 4 h, avec des tapotements intermittents toutes les 30 à 45 minutes.
  6. Après 4 h, faites tourner les cellules et jetez soigneusement le surnageant à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité avec des méthodes d’élimination appropriées.
    REMARQUE : À partir de cette étape, centrifugez les cellules à 100 x g pendant 5 min à RT.
  7. Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de milieu incomplet. Remettez les cellules en suspension dans 8 mL de milieu complet, ce qui donne 1 million de cellules/mL.
  8. Dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits, ensemencez un nombre égal de cellules dans le nombre requis de puits et conservez la plaque dans un incubateur de CO2 maintenu à 37 °C.
  9. Pendant les 4 prochains jours, récoltez les cellules toutes les 24 h en ajoutant un tampon de lyse cellulaire. Récupérez également le surnageant et transférez-le immédiatement dans le congélateur à -80 °C.
  10. Pour vérifier s’il y a eu infection, procédez à l’ELISA de capture de l’antigène p24 pour tous les points temporels. Faites des dilutions appropriées pour les points temporels, c’est-à-dire une dilution plus faible pour les points temporels initiaux et plus élevée pour les points temporels ultérieurs allant de 1:50 à 1:500. Tracez les lectures dans un graphique qui illustre la progression de l’infection (figure 1B).

3. Coloration à la thioflavine T pour déterminer la contrainte RE

  1. Fixez 1 million de cellules CEM-GFP non infectées et 0,5 cellule CEM-GFP infectée (cellules infectées prélevées 72 h) avec 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 min à RT.
  2. Réduire les cellules en granulés à 100 x g pendant 5 minutes et traiter avec 500 μL de glycine 0,1 M pendant 5 minutes, puis laver deux fois avec 500 μL de PBS. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS.
  3. Assemblez les lames de verre, les cartes de filtre et les chambres d’échantillonnage. Ajoutez les 100 μL de cellules remises en suspension dans les chambres d’échantillonnage et faites tourner les cellules à 1000 x g pendant 4 min pour faire adhérer les cellules aux lames dans une cytocentrifugeuse (tableau des matériaux).
    REMARQUE : Il n’y aurait pas assez de cellules immobilisées sur la lame après la centrifugation par cytocentrifugation si la suspension cellulaire est trop diluée. Les cellules sont susceptibles de s’agglutiner et d’être mal réparties après la cytocentrifugation, si la suspension cellulaire est très concentrée.
  4. Perméabilisez les cellules pendant 10 minutes à l’aide de gouttes de Triton-X-100 à 0,1 % dans du PBS (suffisamment pour couvrir la zone où les cellules ont adhéré) et lavez les cellules deux fois en mettant du PBS goutte à goutte et en essuyant le PBS avec du tissu en inclinant la lame.
  5. Incuber les cellules avec 10 μL de 5 μM de Thioflavin T pendant 30 min.
    REMARQUE : Ne pas laver après l’incubation avec ThT.
  6. Monter les lames à l’aide d’un support de montage de 5 μL (80 % de glycérol v/v, 20 % de PBS v/v et 8 mg/mL de 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane [DABCO]), mettre en place la lamelle et sceller la lamelle à l’aide de vernis à ongles. Laissez sécher les lames.
    REMARQUE : À toutes ces étapes, assurez-vous que les cellules ne se dessèchent pas.
  7. Prenez les images confocales de cellules fixes avec une lentille d’immersion glycérol 63x sur un microscope confocal (voir Tableau des matériaux). Ajustez les paramètres d’excitation et d’émission suivants : GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) et ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    REMARQUE : Chaque canal fluorescent doit être imagé séquentiellement, plutôt que simultanément, pour éviter le chevauchement des canaux. La GFP a été considérée comme l’indication de l’infection par le VIH-1, car les cellules CEM-GFP ont une GFP sous la régulation du promoteur LTR, qui se déclenche lors de l’infection par le VIH-125.
  8. Convertissez les images fluorescentes en 8 bits avant de les quantifier par analyse de seuil. Quantifiez manuellement l’intensité de chaque cellule à l’aide d’un logiciel comme Image J (~50 cellules)27. Tracez le graphique avec l’intensité de chaque cellule sous forme de points sur l’axe des Y par rapport aux critères non infectés et infectés.
  9. Pour démontrer l’efficacité de ce protocole, prenez un contrôle positif, par exemple, le traitement à la Thapsigargin (inducteur de stress connu du RE) dans ce cas28. Traitez 1 million de cellules CEM-GFP, chacune avec 1 μL de DMSO (contrôle du véhicule) et 100 nM de Thapsigargin pendant 12 h.
  10. Récoltez les cellules et procédez à la coloration ThT comme mentionné pour les échantillons infectés (étapes 3.1-3.8).
    REMARQUE : Pour ces échantillons, la fluorescence GFP n’est pas requise. Par conséquent, seule la fluorescence ThT est capturée en microscopie confocale.

4. Détermination de l’activation et de l’expression de divers marqueurs UPR

REMARQUE : Pour déterminer l’expression des marqueurs UPR, deux méthodes sont utilisées : l’immunobuvard et la RT-PCR. Pour l’immunotransfert, prélever les cellules CEM-GFP infectées par le VIH-1 à 0,5 MOI à divers moments après l’infection (24 h, 48 h, 72 h et 96 h après l’infection) et remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse (comme mentionné à l’étape 2.2). Alternativement, pour la RT-PCR, les pastilles cellulaires sont lysées dans un réactif Trizol (1 mL pour 1 à 3 millions de cellules) (voir le tableau des matériaux). Les cellules remises en suspension dans un tampon de lyse et un réactif Trizol peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.

  1. Immunoblot pour l’analyse des marqueurs UPR.
    1. Maintenir les cellules remises en suspension dans le tampon de lyse sur de la glace pendant 45 min avec un mélange intermittent à l’aide d’un vortex.
    2. Granulez les cellules à 18000 x g pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse de paillasse (voir le tableau des matériaux). Recueillir le surnageant dans un tube frais.
    3. Quantifiez la concentration en protéines dans chaque échantillon à l’aide de Bradford ou d’un réactif similaire.
    4. Prélever une concentration égale de protéines pour chaque échantillon et préparer les échantillons de protéines dans le tampon Laemmli (tampon 6x : 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10 % SDS, 30 % de glycérol et 0,02 % de bleu de bromophénol ; 5 % de β-Mercaptoéthanol).
      REMARQUE : Pour l’immunotransfert de chaque marqueur UPR, un minimum de 60 à 80 μg de protéines a été utilisé.
    5. Faites bouillir les échantillons de protéines à 96 °C pendant 5 minutes et faites-les tourner brièvement.
    6. Résolvez les échantillons de protéines sur un gel SDS-PAGE à 10 % à 12 % et transférez les protéines sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir le tableau des matériaux).
    7. Bloquer avec du lait écrémé en poudre à 5 % ou de l’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 à 2 h, laver deux fois avec du TBST (20 mM Tris pH7,4 et 0,137 M NaCl ; 0,1 % Tween 20) et sonder avec des anticorps primaires spécifiques des protéines contre les marqueurs UPR (voir le tableau des matières) dans un transat, toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, après avoir lavé les tampons deux fois avec du TBST, sondez avec les anticorps secondaires respectifs pendant 1,5 h.
    8. Lavez à nouveau les transferts avec du TBST et visualisez les bandes de protéines à l’aide d’un substrat de détection de chimiluminescence (voir le tableau des matériaux) dans un instrument d’imagerie par transfert Western.
  2. RT PCR
    1. Isolez l’ARN total des cellules à l’aide du réactif Trizol (voir le tableau des matériaux).
    2. Préparez l’ADNc à partir d’une concentration égale d’ARN à l’aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV-RT) (voir le tableau des matériaux).
    3. Analyser la modulation de l’expression de l’ARNm de HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP et GADD34 à l’aide de la qRT-PCR avec des amorces spécifiques au gène (Tableau 2). Préparez brièvement des mélanges réactionnels de 10 μL contenant une matrice d’ADNc (100 ng), 5 μL de colorant SYBR Green (voir le tableau des matériaux) et 10 pmol de chaque paire d’amorces oligonucléotidiques spécifiques du gène. Réglez le volume à l’aide de H2O stérile.
    4. Exécutez les mélanges sur une machine de PCR en temps réel à l’aide du programme suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min et 40 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de l’analyse de la courbe de fusion. Calculez la variation du pli de l’expression du gène cible par rapport au gène d’entretien (par exemple β-Actine) comme suit :
      Changement de pli = 2-Δ(ΔCT)
      Où ΔCT = CT (cible) − CT (gène d’entretien)
      et Δ(ΔCT) = ΔCT (traité) -ΔCT (témoin)
    5. Pour confirmer davantage l’épissage de XBP1, effectuez une RT-PCR semi-quantitative avec des échantillons non infectés et infectés à 72 heures.
      REMARQUE : L’épissage de l’ARNm XBP-1 est étudié à l’aide de la RT-PCR sur le site d’épissage.
    6. Amplifier l’ADNc avec des amorces XBP1 (Tableau 2) à l’aide d’un master mix PCR haute fidélité (voir Tableau des matières) dans les conditions suivantes : 1 cycle à 98 °C pendant 30 s, suivi de 5 cycles à 98 °C pendant 15 s, 65*Δ-5 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivi de 30 cycles à 98 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis d’une extension finale de 72 °C pendant 10 min et d’un maintien à 4 °C.
    7. Séparez les amplicons sur un gel d’agarose à 2,5 % contenant 50 ng de bromure d’éthidium/mL et visualisez-les dans un instrument de mesure en gel. La bande XBP1 épissée est plus petite de 26 nucléotides.

5. Inactivation des marqueurs UPR et analyse de l’expression des gènes et de la production de virus induites par le VIH-1 LTR

  1. Préparation de constructions shRNA pour l’inactivation de marqueurs UPR
    1. Créer des constructions shRNA à l’aide du squelette du vecteur pLKO.1-TRC (vecteur de clonage lentiviral)29.
    2. Construisez deux constructions shRNA pour chaque gène (IRE1, PERK, ATF6 et HSPA5). Les oligonucléotides sens et antisens ciblant l’ARNm du gène respectif sont conçus par le Consortium ARNi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tableau 3).
      REMARQUE : De la même manière, des constructions shRNA peuvent être faites pour d’autres marqueurs UPR.
    3. Recuit les amorces (100 nM pour l’avant et pour l’arrière) à 95 °C, suivi d’un refroidissement progressif à RT.
    4. Ensuite, ligaturez-le dans les sites Age1 et EcoRI du vecteur pLKO.1 à l’aide d’une ADN ligase T4 (voir Tableau des matériaux). Confirmez la séquence par séquençage de l’ADN.
      REMARQUE : Une construction shRNA ciblant le gène LacZ est utilisée comme contrôle non ciblant.
  2. Inactivation de PERK, ATF6, IRE1 et HSPA5 dans les cellules HEK-293T, dosage de la luciférase et ELISA p24
    1. Préparez un mélange de construction shRNA (0,9 μg) et d’un réactif de transfection comme la polyéthylénimine (PEI) (3 μL de PEI pour 1 μg d’ADN) (voir le tableau des matériaux) dans 50 μL de milieu sans sérum par vortex et incubez pendant 20 min.
    2. À partir d’un confluent de cellules HEK-293T contenant un flacon, trypsiniser et ensemencer ~0,25 x 106 cellules avec le mélange de transfection dans une plaque à 24 puits, ce qui fait le volume total de 125 μL et incuber pendant 6 h à 37 °C dans un incubateur de CO2 . Cette méthode est appelée transfection inverse où les cellules sont ensemencées avec le mélange de transfection.
    3. Après 6 h, ajouter 125 μL de milieu complet dans les puits et remettre les cellules en suspension pour un ensemencement uniforme.
      REMARQUE : Pour les expériences de knockdown, la transfection inverse (étapes 5.2.1-5.2.3) donne une meilleure efficacité avec les shRNA et les siRNA.
    4. Après 24 h, effectuez une deuxième transfection. Préparez un mélange de constructions pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) et pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3 :pLTR-Luc :pEGFPN1-1:1:0.5) avec du PEI (3 μL de PEI pour 1 μg d’ADN) dans 50 μL de milieu incomplet par vortex. Incuber le mélange pendant 20 min à RT. Remplacer le milieu existant par 250 μL de milieu frais incomplet et ajouter le mélange dans les cellules.
      REMARQUE : Un vecteur rapporteur pour le LTR du VIH-1 a été mis au point par sous-clonage du LTR de pU3RIII30,31 dans pGL3basic en laboratoire précédemment32. L’expression de la GFP à l’aide de pEGFP-N1 a été utilisée pour normaliser l’efficacité de transfection32.
    5. Changez le support après 6 h après la transfection avec 500 μL de DMEM complet. Récoltez les cellules après 36 h pour l’immunobuvard et le dosage de la luciférase.
    6. Pour le dosage de la luciférase, granulez les cellules et mettez-les en suspension dans un substrat de luciférase (50 μL) obtenu dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Ajouter le lysat cellulaire remis en suspension dans une plaque opaque à 96 puits et incuber pendant 10-15 min. Obtenez la lecture de la luciférase dans un luminomètre. Mesurez également la fluorescence GFP dans les mêmes échantillons pour normaliser la lecture de la luciférase dans un lecteur de plaques micromodes sur microplaques (Ex : 494 nm, Em : 519 nm).
    7. Tracez le graphique en tant qu’unité de luciférase/GFP sur l’axe Y.
      REMARQUE : L’inactivation des marqueurs UPR respectifs doit être vérifiée, et cela peut être fait par immunoblot ou qRT-PCR en utilisant des anticorps ou des amorces spécifiques au gène, respectivement.
    8. Collectez les surnageants à traiter pour l’ELISA p24 comme mentionné ci-dessus.
  3. Création de cellules stables avec inhibition des marqueurs UPR et de l’infection par le VIH-1.
    1. Préparez les particules de lentivirus en transfectant des cellules HEK-293T ensemences dans une plaque à 6 puits, avec les constructions shRNA respectives (1 μg) ainsi que pMD2.G (vecteur d’enveloppe VSV-G) (0,75 μg) et psPAX2 (plasmide d’emballage lentiviral) (0,25 μg) (voir le tableau des matériaux) en utilisant le PEI dans le rapport 1 μg d’ADN : 3 μL de PEI. Préparez le mélange dans 100 μL de DMEM incomplet et incubez pendant 20 min à RT. Ajoutez le mélange à 1,8 mL de milieu complet dans les cellules HEK-293T ensemencées.
      REMARQUE : Ensemencer les cellules HEK-293T dans une plaque à 6 puits au moins 12 h avant la transfection jusqu’à ce qu’elles acquièrent une morphologie et soient confluentes à environ 60-70 %.
    2. Après 24 h de transfection, ajoutez 1 mL de DMEM complet dans chaque puits.
    3. Recueillir les surnageants après 48 h, les conserver au congélateur à -80 °C et effectuer l’ELISA p24 pour confirmer la présence du virus dans ces surnageants. Utilisez ce surnageant lentiviral brut pour transduire les cellules J6.
    4. Incuber 2 millions de cellules dans une plaque à 6 puits avec un volume égal de surnageant lentiviral (500 μL) pour chaque lentivirus témoin et knockdown spécifique au gène et ajouter un milieu RPMI 1640 complet frais en présence de polybrène (5 μg/mL) pour porter le volume à 2 mL.
    5. Après 24 h, ajouter Puromycine (1 μg/mL) dans chaque puits pour sélectionner des cellules stables. Après avoir ajouté Puromycin, granulez les cellules toutes les 24 h et ajoutez 2 ml de milieu frais avec Puromycin.
    6. Faites-le jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de mort cellulaire (~1 semaine). Les cellules survivantes sont les cellules stables avec l’inactivation génétique souhaitée.
      REMARQUE : L’inactivation des gènes respectifs peut être vérifiée à intervalles réguliers et, enfin, lorsque seules les cellules survivantes sont visibles dans les milieux contenant de la puromycine en utilisant l’immunobuvardage ou la qRT-PCR.
    7. Infecter les cellules knockdown LacZ et spécifiques du gène avec 0,5 MOI de VIH-1 comme décrit dans la rubrique 2 et récolter les cellules 48 heures après l’infection.
    8. Prélever le surnageant de chaque échantillon et traiter p24-ELISA comme décrit précédemment et traiter les cellules pour vérifier le niveau d’inactivation par immunobuvardage.

6. Traitement par inducteur de stress RE et analyse de son effet sur la réplication du VIH-1

REMARQUE : Pour déterminer l’effet de la surstimulation de l’UPR pendant la réplication du VIH-1, la molécule inductrice pharmacologique, la thapsigargin, peut être utilisée.

  1. Détermination du pourcentage de viabilité cellulaire lors du traitement par Thapsigargin.
    REMARQUE : La cytotoxicité de la thapsigargine est déterminée par le réactif MTT (voir tableau des matériaux).
    1. Amorcez de 25 000 à 30 000 cellules CEM-GFP par puits dans une plaque de 96 puits contenant 100 μL de RPMI 1640 complet. Ajoutez 100 nM de Thapsigargin dans le milieu et incubez à 37 °C dans un incubateur.
      REMARQUE : Les cellules traitées avec 1 μL de DMSO ont été prises comme contrôle du véhicule.
    2. Après 48 h, ajouter 10 μL de MTT (5 mg/mL) dans chaque puits et incuber dans l’obscurité pendant 4 h pour la formation de cristaux de formazan à 37 °C avec 5% de CO2.
    3. Après 4 h, dissoudre les cristaux à l’aide de 100 μL d’isopropanol pour former une couleur violette et mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    4. Calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de l’équation ci-dessous
      % de viabilité cellulaire = (OD570 de contrôle -OD570 de traitement)/OD570 de contrôle x 100
  2. Prétraitement de Thapsigargin et analyse de la progression de l’infection par le VIH-1 par ELISA p24.
    1. Ensemencez 1 million de cellules CEM-GFP dans une plaque de 12 puits contenant 1 mL de RPMI 1640 complet et traitez les cellules avec 100 nM de Thapsigargin ou 1 μL de DMSO (contrôle du véhicule) pendant 12 h dans un incubateur de CO2 maintenu à 37 °C. Après 12 h, laver les cellules avec du RPMI 1640 complet et les infecter avec 0,5 MOI de VIH-1 comme décrit précédemment.
    2. Récoltez les cellules à différents moments, par exemple 24 h, 48 h et 72 h après l’infection, pour l’immunoblottage.
    3. Prélevez les surnageants de chaque échantillon et effectuez l’ELISA p24 comme décrit précédemment.
    4. Tracez le graphique avec la concentration de p24 dans l’échantillon sur l’axe des Y et les points temporels respectifs sur l’axe des X.
    5. À l’aide de l’immunoblotting, analysez l’induction du stress du RE due au traitement à la thapsigargine en mesurant le niveau de tous les marqueurs UPR. Cette étude a utilisé HSPA5 comme marqueur.

7. Essai d’infectiosité TZM-bl β-gal pour déterminer l’effet de l’UPR sur l’infectiosité du virion

REMARQUE : Pour comprendre le rôle de l’UPR dans l’infectiosité du virion, le surnageant issu de l’inactivation ainsi que le traitement à la thapsigargine peuvent être utilisés pour le test d’infectivité TZM-bl β-gal tel que décrit à la section 1.2, sur la base de la concentration p24 déterminée par l’ELISA p24.

  1. Infectez les cellules TZM-bl avec une concentration égale de p24 dans chaque échantillon et effectuez une coloration β-gal. Comptez les cellules infectées bleues au microscope avec un grossissement de 10x pour 5 champs aléatoires.
  2. Faites la moyenne du comptage des 5 champs pour chaque échantillon à partir des étapes ci-dessus.
  3. Calculez le changement de pli comme mentionné ci-dessous :
    Changement de pli = Nombre moyen de cellules bleues dans les échantillons de test/Nombre moyen de cellules bleues dans l’échantillon de contrôle.

Résultats

Dans ce travail, nous avons décrit un protocole détaillé pour étudier in vitro le stress du RE et l’activation de l’UPR lors de l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T (Figure 2). Cette étude décrit également des méthodes d’analyse de la pertinence fonctionnelle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion (Figure 3).

Dans ce but, nous avons ...

Discussion

Le champ d’application du présent protocole comprend (i) la manipulation des stocks de virus VIH-1 et la mesure de la concentration virale et de l’infectiosité du virion, (ii) l’infection des lymphocytes T par le VIH-1 et l’évaluation de son effet sur le stress du RE et différents marqueurs de l’UPR, (iii) l’effet de l’inactivation des marqueurs de l’UPR et leur effet sur l’activité du gène LTR du VIH-1, la production de virus et l’infectiosité du virion et (i...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Centre national des sciences cellulaires, Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde, pour son soutien intra-muros. AT et AD sont reconnaissants du soutien à la recherche doctorale reçu du Centre national des sciences cellulaires, Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde. DM est reconnaissant pour la bourse nationale JC Bose du SERB, gouvernement de l’Inde.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

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