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要約

ここでは、特にHIV-1感染に重点を置いて、小胞体(ER)ストレスとアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)の活性化を決定するためのいくつかの確立された方法について説明します。この記事では、ER ストレス/UPR が HIV-1 の複製とビリオン感染性に及ぼす影響を調査するための一連のプロトコルについても説明します。

要約

ウイルス感染は、異常なタンパク質蓄積により小胞体(ER)ストレスを引き起こし、アンフォールデッドタンパク質応答(UPR)を引き起こす可能性があります。ウイルスは宿主のUPRを操作する戦略を開発してきましたが、HIV-1感染中のUPR調節とその機能的意義についての詳細な理解は文献に欠けています。これに関連して、現在の記事では、T細胞のHIV-1感染中の小胞体ストレスレベルとUPRを測定するために私たちの研究室で使用されているプロトコルと、ウイルスの複製と感染性に対するUPRの影響について説明します。

チオフラビンT(ThT)染色は、タンパク質凝集体を検出することにより細胞内の小胞体ストレスを検出するために使用される比較的新しい方法です。ここでは、小胞体ストレスを検出および定量化するためのHIV-1感染細胞におけるThT染色のプロトコルを示しました。さらに、小胞体ストレスは、従来の免疫ブロッティングおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、HIV-1感染細胞におけるBiP、リン酸化IRE1、PERK、eIF2αなどのUPRマーカーのレベル、XBP1のスプライシング、ATF6、ATF4、CHOP、およびGADD34の切断を測定することにより、間接的にも検出されました。ThT蛍光はUPR活性化の指標と相関していることを発見しました。この記事では、ノックダウン実験による小胞体ストレスとUPR調節がHIV-1複製に与える影響を分析するためのプロトコル、および薬理学的分子の使用についても説明します。HIV-1遺伝子の発現/複製およびウイルス産生に対するUPRの影響は、それぞれLuciferase reporter assaysおよびp24抗原捕捉ELISAによって解析されましたが、ビリオン感染性への影響は、感染したレポーター細胞の染色によって解析されました。これらの方法群を総合すると、HIV-1感染時のアンフォールデッドタンパク質応答経路を包括的に理解し、その複雑なダイナミクスを明らかにすることができます。

概要

後天性免疫不全症候群(AIDS)は、CD4+ Tリンパ球の数が徐々に減少することを特徴とし、免疫応答の進行性の失敗につながります。ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)は、エイズの原因物質です。これは、ウイルス粒子ごとに2つのRNAのコピーを持つ包み込まれたポジティブな感覚の一本鎖RNAウイルスであり、レトロウイルス科に属します。宿主細胞内での高濃度のウイルスタンパク質の産生は、細胞のタンパク質折り畳み機構に過度のストレスを与えます1。ERは、真核細胞の分泌経路の最初のコンパートメントです。タンパク質の産生、変更、および分泌経路と細胞外空間標的部位への送達を担当しています。タンパク質は、アスパラギン結合グリコシル化や分子内および分子間ジスルフィド結合の産生など、多数の翻訳後変化を経て、小胞体内で自然なコンフォメーションに折り畳まれます2。したがって、高濃度のタンパク質がER内腔に存在し、これらは凝集やミスフォールディングが非常に起こりやすいです。熱ショック、微生物感染、ウイルス感染など、タンパク質合成の促進やタンパク質の突然変異を必要とするさまざまな生理学的条件は、ERでのタンパク質蓄積の増加によるERストレスを引き起こし、ER内腔の恒常性を乱します。小胞体ストレスは、高度に保存された適応シグナル伝達経路であるアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)3のネットワークを活性化します。UPRは、折り畳まれていないタンパク質の負荷と折り畳み能力を調整することにより、正常なER生理学的状態を取り戻すために使用されます。これは、小胞体のサイズと小胞体に常在する分子シャペロンとフォールダーゼを大きくすることでもたらされ、小胞体の折り畳み能力が向上します。また、UPRは、翻訳レベルでの全球的なタンパク質合成の減衰を通じてERのタンパク質負荷を減少させ、ER関連分解(ERAD)をアップレギュレーションすることにより、ERからのアンフォールドタンパク質のクリアランスを増加させます4,5。

小胞体ストレスは、プロテインキナーゼR(PKR)様小胞体キナーゼ(PERK)、活性化転写因子6(ATF6)、およびイノシトール要求酵素1型(IRE1)の3つの小胞体常在膜貫通タンパク質によって感知されます。これらのエフェクターはすべて、結合タンパク質(BiP)/78-kDaグルコース調節タンパク質(GRP78)としても知られるシャペロンヒートショックタンパク質ファミリーA(Hsp70)メンバー5(HSPA5)に結合することにより不活性に保たれます。小胞体ストレスとアンフォールド/ミスフォールドタンパク質の蓄積により、HSPA5は解離してこれらのエフェクターを活性化し、その後、小胞体ストレスの解消に役立つ一連の下流標的を活性化し、極限状態では細胞死を促進します6。HSPA5から解離すると、PERKは自己リン酸化し、そのキナーゼ活性が活性化されます7。そのキナーゼ活性はeIF2αをリン酸化し、翻訳減衰を引き起こし、小胞体8のタンパク質負荷を低下させます。しかし、リン酸化真核生物の開始因子2α(eIF2α)の存在下では、特定のmRNA上の非翻訳オープンリーディングフレームが優先的に翻訳され、ATF4のようにストレス誘発遺伝子を調節します。ATF4およびC/EBP相同タンパク質(CHOP)は、ストレス誘発性遺伝子を調節し、アポトーシスおよび細胞死経路を調節する転写因子である9,10。ATF4およびCHOPの標的の1つは、増殖停止およびDNA損傷誘導性タンパク質(GADD34)であり、これはタンパク質ホスファターゼ1とともにpeIF2αを脱リン酸化し、並進減衰のフィードバック調節因子として作用する11。小胞体ストレス下では、ATF6はHSPA5から解離し、そのゴルジ体局在化信号が露出し、ゴルジ体への転座につながります。ゴルジ装置では、ATF6はサイト1プロテアーゼ(S1P)およびサイト2プロテアーゼ(S2P)によって切断され、切断された形態のATF6(ATF6 P50)が放出されます。その後、ATF6 p50は核に移され、そこでタンパク質のフォールディング、成熟、分泌、およびタンパク質分解に関与する遺伝子の発現を誘導します12,13。小胞体ストレス中、IRE1はHSPA5から解離し、多量体化し、自己リン酸化する14。IRE1のリン酸化は、そのRNaseドメインを活性化し、X-box結合タンパク質1(XBP1)のmRNAの中央部分からの26ヌクレオチドのスプライシングを特異的に媒介します15,16。これにより、トランス活性化機能を付与する新規のC末端が生成され、機能的なXBP1sタンパク質、いくつかの小胞体ストレス誘発遺伝子を制御する強力な転写因子が生成されます17,18。これらの転写因子の複合的な活性は、ERの恒常性を回復することを目的とした遺伝的プログラムのスイッチを入れます。

小胞体ストレスとUPRを検出するには、さまざまな方法があります。これらには、UPRマーカーを分析する従来の方法が含まれる19,20。従来とは異なるさまざまな方法には、UPRの酸化還元状態と小胞体内腔内のカルシウム分布の測定、小胞体構造の評価などがあります。電子顕微鏡法を使用して、細胞や組織の小胞体ストレスに応答して小胞体内腔がどれだけ拡大するかを確認できます。ただし、この方法は時間がかかり、電子顕微鏡の利用可能性に依存しており、すべての研究グループが利用できるとは限りません。また、小胞体のカルシウムフラックスと酸化還元状態の測定は、試薬が入手可能であるため困難です。さらに、これらの実験から読み取られたものは非常に感度が高く、細胞代謝の他の要因の影響を受ける可能性があります。

UPR出力をモニタリングするための強力でシンプルな手法は、UPRのさまざまなシグナル伝達経路の活性化を測定することであり、さまざまなストレスシナリオで何十年にもわたって使用されてきました。これらの従来の方法でUPRの活性化を測定する方法は、経済的で実現可能であり、他の既知の方法と比較して短時間で情報を得ることができます。これには、IRE1、PERK、eIF2αのリン酸化、P50型のATF6を測定することによるATF6の切断、HSPA5、スプライシングXBP1、ATF4、CHOP、GADD34などの他のマーカーのタンパク質発現など、UPRマーカーのタンパク質レベルでの発現を測定するためのイムノブロッティング、mRNAレベルを測定するためのRT-PCRやXBP1 mRNAのスプライシングなどが含まれます。

この記事では、HIV-1感染細胞における小胞体ストレスとUPRの活性化をモニタリングし、HIV-1の複製と感染性におけるUPRの機能的関連性を判断するための、検証済みで信頼性の高い一連のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、入手が容易で経済的な試薬を利用し、UPR出力に関する説得力のある情報を提供します。小胞体ストレスは、折り畳まれていない/誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積の結果であり、タンパク質凝集体21を形成する傾向がある。ここでは、HIV-1感染細胞におけるこれらのタンパク質凝集体を検出する方法について説明する。チオフラビンT染色は、これらのタンパク質凝集体を検出および定量するために使用されている比較的新しい方法である22。BeriaultとWerstuckは、タンパク質凝集体、つまり生細胞の小胞体ストレスレベルを検出および定量するためのこの手法について説明しました。低分子の蛍光分子チオフラビンT(ThT)は、タンパク質凝集体、特にアミロイド線維に選択的に結合することが実証されています。

この記事では、ThTを使用してHIV-1感染細胞のERストレスを検出および定量化し、UPRのさまざまなシグナル伝達経路の活性化を測定することにより、UPRを従来のモニタリング方法と関連付ける方法について説明します。

HIV-1感染時のUPRの役割に関する包括的な情報も不足しているため、HIV-1の複製とビリオン感染性におけるUPRの役割を理解するための一連のプロトコルを提供します。これらのプロトコルには、レンチウイルスを介したUPRマーカーのノックダウン、および薬理学的ERストレス誘導剤による治療が含まれます。この記事では、長末端反復(LTR)ベースのルシフェラーゼアッセイ、p24酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、β-galレポーター染色アッセイなど、HIV-1遺伝子発現、ウイルス産生、および産生されたビリオンの感染性を測定するために使用できるリードアウトの種類も示しています。

これらのプロトコルの大部分を使用して、我々は最近、HIV-1感染がT細胞23のUPRに対する機能的意味合いを報告しており、その論文の結果は、ここで述べた方法の信頼性を示唆している。したがって、この記事では、HIV-1と小胞体ストレスおよびUPR活性化との相互作用に関する包括的な情報を提供する一連の方法を提供します。

プロトコル

注:ここで使用される細胞株は、HEK-293TおよびJurkat J6(CD4 + T細胞株)であり、これらはインドのプネーにあるNCCSのCell Repositoryから入手しました。TZM-blは、HIV-1長末端反復(LTR)プロモーター24 およびCEM-GFP(別のCD4+ Tレポーター細胞株)25 の下にβ-ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ遺伝子のコピーを統合したHeLa由来細胞株であり、NIH AIDS Repository(米国)から入手した。

1. HIV-1ウイルスストックの調製と保管

  1. HIV-1ウイルスストックの調製
    注:HIV-1を含むすべての実験において、世界保健機関(WHO)または疾病管理予防センター(CDC)のマニュアルに記載されているバイオセーフティ関連の国際ガイドラインを実践することをお勧めします。ウイルスの取り扱いおよび生きたウイルスの実験は、少なくともBSL2レベルの封じ込め実験室に収容された適切なバイオセーフティキャビネットでのみ行われるべきです。リン酸カルシウム哺乳類トランスフェクションキットを使用した感染性HIV-1粒子の産生は、プロトコルのこのセグメントで説明されています。
    1. HEK-293T細胞を90 mm皿に10 mLの完全(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)DMEM(ダルベッコの改変イーグル培地)をクラスIIタイプA2バイオセーフティキャビネットに播種し、細胞のコンフルエンスが50%〜60%になるように37°Cの組織培養インキュベーターで約12時間保持します。
    2. 翌日、トランスフェクションミックスを調製します:滅菌バッファーに25 μgのpNL4.3(HIV-1の分子クローン)プラスミドDNAを含む溶液A、86.8 μLの2 M CaCl2、 および残りの滅菌水を含む溶液Aを調製して、各プレートの最終容量を700 μLにします。1プレートに対して、2x HEPES緩衝生理食塩水(HBS)700 μLを含む溶液Bを調製します。次に、プレートの合計数の計算を調整します。
    3. 次に、ソリューション B をソリューション A にドロップワイズ方式で追加し、ソリューション A を連続的にボルテックスします。トランスフェクションミックスの総容量は、1プレートあたり1.4 mLになります。
      注:溶液Bを溶液Aに正確に滴下しながら連続的にボルテックスすると、完全なトランスフェクション複合体が形成されます。
    4. この混合物を室温(RT)で約20分間インキュベートします。次に、新鮮な9 mLの完全なDMEMを含む各プレートに混合物をゆっくりと滴下し、プレートをCO2 インキュベーターに移します。8〜10時間後、既存の培地を新鮮な10 mLの完全なDMEMと交換します。
    5. メディア交換後24時間後、円錐形のチューブ内のすべてのプレートから上清(ウイルス粒子を含む)を収集します。.低速卓上遠心分離機(Table of Materials)を使用して、600 x gで5分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。
    6. 上清をポリアロマー超遠心チューブに移し、超遠心分離機のスイングアウトローターに入れます(材料表)。チューブホルダーの重量のバランスを確認し、必要に応じて滅菌培地で調整します。
    7. 1,41,000 x g で4°Cで2.5時間超遠心分離します。 この後、チューブを慎重に取り出し、バイオセーフティキャビネット内で上清をゆっくりとデカントします。
    8. 各チューブ内のペレット(現在は濃縮されたウイルス)に、不完全なRPMI(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート)1640培地1mLを加え、激しいピペッティングを行ってペレットを取り除きます。
      注:超遠心分離後のペレットは、肉眼ではほとんど見えません。そのため、ペレットが適切に外れるように、チューブの中央にRPMI 1640を追加する必要があります。
    9. 次に、1 mLのウイルス懸濁液に25 μLの1 M HEPES pH 7.4を加えます。懸濁液50μLを1.5 mLの遠心分離チューブに分注し、すぐに-80°Cの冷凍庫に保管して長期保存します。
  2. ウイルス濃度とビリオン感染力の定量
    注:ウイルスの感染力を計算するには、まずその濃度を定量化することが不可欠であり、これはp24抗原捕捉ELISAによって行われます(製造元の指示に従っているため、ここでは説明されていません; 資料の表を参照)。このプロセスは、ウイルスの濃度をストックのマイクロリットル当たりナノグラム(ng/μL)で与え、次いで、TZM-blレポーター細胞26における以下の実験を通じてストック中の感染性ビリオン数を同定するために使用される。
    1. 各ウェルに500 μLの完全なDMEMを使用して、24ウェルプレートで0.1 x 106 TZM-bl細胞をカウントして播種し、細胞培養インキュベーターで10〜12時間保持します。
    2. ウイルス定量のための感染を開始する前に、細胞が50%〜60%コンフルエントであることを確認してください。既存の培地を250 μLの新鮮な完全DMEMで各ウェルに交換します。
      注意: 実験的な障害を除外するために、ポジティブコントロールをしっかりと保ちます。
    3. 感染に必要なストックウイルスの量を1 ng、0.1 ng、0.01 ngの重複で計算します。ウェルに適切な量のウイルスを加え、プレートをインキュベーター内で37°Cに4時間保持します。
    4. 細胞を500 μLの不完全なDMEMで2回洗浄し、次に500 μLの完全DMEMを添加します。
    5. 培地交換の36時間後にβガロン染色手順に進みます。
      1. 既存の培地を廃棄し、1mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに500μLの固定溶液(PBS中の0.25%グルタルアルデヒド)を加えて細胞を固定し、バイオセーフティキャビネット内でRTで5〜7分間インキュベートします。
      2. 表1に示すように染色液を調製します。X-galは光に弱いため、光から遠ざけてください。
      3. 細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。調製したばかりの染色液500μLで細胞を覆い、暗所で37°Cで2〜18時間インキュベートします。
      4. その後反応を停止するには、PBS中の500 μLの3%ジメチルスルホキシド(DMSO)で細胞を2回すすぎ、その後、細胞を500 μLの新鮮なPBSに保ちます。
      5. 青色の感染細胞( 図1Aを参照)を顕微鏡下で10倍に拡大し、5つのランダムフィールドをカウントします。5 つのフィールドの平均カウントを取り、それにフィールド係数と希釈係数を掛けます。これにより、ウイルスストック中の感染性ビリオン粒子が定量化されます。
        注:24ウェルプレートの場合、電界係数は75です。
コンポーネント準備必要量
PBSの10x PBSのストックから1x PBSを調製します14ミリリットル
カリウムフェリフェロシアン化物0.82 gのフェリシアン化カリウムと1.06 gのフェロシアン化カリウムを25 mLの1x PBSに溶解します0.75ミリリットル
塩化マグネシウム1 mL 中 1 M の 1x PBS15μL
X-ギャル30 mgを0.6 mLのN、N-ジメチルホルムアミド(暗所)に溶解します0.3ミリリットル
合計 = 15 mL

表1:TZM-bl細胞のβ-gal染色に必要な成分のリスト。

2. T細胞株のHIV-1感染

  1. 不死化T細胞株を解凍し、培養します。この研究では、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 500 μg/mL G418 を添加した完全 RPMI 1640 培地で培養した CEM-GFP 細胞株を使用しました。
  2. 各時点(未感染、24時間、48時間、72時間、96時間)で200万個の細胞をカウントして採取します。100 x g で5分間遠心分離して未感染の細胞を直ちに回収し、細胞溶解バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.12 M NaCl、5 mM EDTA、0.5% NP40、0.5 mM NaF、1 mM DTT)を添加し、プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)および1xホスファターゼ阻害剤(1〜300万細胞で50 μL)を添加するか、Trizol試薬(1〜300万細胞で1 mL)で溶解してRNA単離( 表を参照)します(表を参照)。マテリアル)。
  3. ポリブレン(5 μg/mL)を含む1 mLの完全RPMI 1640培地で1 mL、100 x g 、室温で5分間、細胞を1 mLの完全培地に再懸濁します。
    注:ポリブレンは、哺乳動物細胞のレトロウイルス感染を促進するために使用されるカチオン性ポリマーです。
  4. 800万個の細胞を、完全培地を含むポリブレン1 mLに再懸濁します。次に、400万個のビリオン粒子に必要なウイルスストックの量を計算し、ウイルスストックを添加し、完全な培地を追加することで総量を2 mLにします。これにより、MOI は 0.5 になります。
  5. CO2 インキュベーター内の細胞を37°Cで4時間保持し、30〜45分ごとに断続的にタッピングします。
  6. 4時間後、細胞をスピンダウンし、上清をバイオセーフティキャビネット内に慎重に廃棄し、適切な廃棄方法を使用します。
    注:このステップ以降、細胞を100 x g でRTで5分間遠心分離します。
  7. 細胞を1 mLの不完全培地で2回洗浄します。細胞を8 mLの完全培地に再懸濁し、100万細胞/mLにします。
  8. 6ウェル組織培養プレートで、必要な数のウェルに同数の細胞を播種し、プレートを37°Cに維持されたCO2 インキュベーターに保持します。
  9. 次の4日間は、細胞溶解バッファーを添加して、24時間ごとに細胞を回収します。また、上澄み液を回収し、すぐに-80°Cの冷凍庫に移します。
  10. 感染が起こったかどうかを確認するには、すべての時点のp24抗原捕捉ELISAに進みます。その時点に対して適切な希釈、すなわち、最初の時点に対しては低く、1:50から1:500までの範囲の後の時点に対しては高い希釈を行います。感染の進行を示すグラフに測定値をプロットします(図1B)。

3. 小胞体ストレスを測定するためのチオフラビンT染色

  1. 非感染細胞と 0.5 MOI 感染した CEM-GFP 細胞 (72 時間感染細胞を採取) をそれぞれ 100 万個ずつ、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド 200 μL で RT で 20 分間固定します。
  2. 細胞を100 x g で5分間ペレット化し、500 μLの0.1 Mグリシンで5分間処理した後、500 μLのPBSで2回洗浄します。細胞を100 μLのPBSに再懸濁します。
  3. スライドガラス、フィルターカード、サンプルチャンバーを組み立てます。100 μLの再懸濁細胞をサンプルチャンバーに加え、細胞を1000 x g で4分間回転させて、細胞遠心分離機で細胞をスライドに接着します(材料表)。
    注:細胞懸濁液が希釈されすぎると、細胞遠心分離後のスライド上に十分な細胞が固定化されません。細胞懸濁液が非常に濃縮されている場合、細胞は凝集し、細胞遠心分離後に分布しなくなる可能性があります。
  4. 0.1% Triton-X-100 in PBS(細胞が付着した領域を覆うのに十分)を滴下して細胞を10分間透過処理し、滴下PBSを入れて細胞を2回洗浄し、スライドを傾けてPBSを組織で拭き取ります。
  5. 細胞を10 μLの5 μMチオフラビンTと30分間インキュベートします。
    注:ThTでインキュベートした後は洗わないでください。
  6. 5 μLの封入剤(80% glycerol v/v、20% PBS v/v、および8 mg/mL 1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン[DABCO])を使用してスライドをマウントし、カバースリップを入れ、マニキュアを使用してカバースリップを密封します。スライドを乾かしておきます。
    注意: これらすべての手順で、セルが乾かないようにしてください。
  7. 共焦点顕微鏡で63倍グリセロール液浸レンズを使用して、固定細胞の共焦点画像を撮影します( 材料の表を参照)。GFP(Ex.494 nm, Em. 519 nm)およびThT(Ex.458 nm, Em.480-520 nm)の励起および発光設定を調整します。
    注:各蛍光チャンネルは、チャンネルのオーバーラップを避けるために、同時にではなく、順番にイメージングする必要があります。CEM-GFP細胞は、HIV-1感染時に発火するLTRプロモーターの調節下でGFPを持っているため、GFPはHIV-1感染の指標として採用されました25。
  8. 蛍光画像を8ビットに変換してから、閾値解析で定量化します。Image J (~50 cells) 27 のようなソフトウェアを使用して、各細胞の強度を手動で定量化します。各セルの強度を Y 軸上の点として、非感染および感染の基準に対するグラフをプロットします。
  9. このプロトコルの有効性を実証するために、ポジティブコントロール、例えば、この場合はタプシガルギン治療(既知のERストレス誘導剤)を取ります28。100万個のCEM-GFP細胞を、それぞれ1μLのDMSO(ビヒクルコントロール)と100nMのタプシガルギンで12時間処理します。
  10. 細胞を採取し、感染したサンプルについて述べたようにThT染色を処理します(ステップ3.1-3.8)。
    注:これらのサンプルでは、GFP蛍光は必要ありません。したがって、共焦点顕微鏡ではThT蛍光のみが捕捉されます。

4. 各種UPRマーカーの活性化と発現の判定

注:UPRマーカーの発現を決定するために、イムノブロッティングとRT-PCRの2つの方法が使用されます。イムノブロッティングでは、感染後さまざまな時点(感染後24時間、48時間、72時間、96時間)で0.5 MOI HIV-1に感染したCEM-GFP細胞を回収し、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁します(ステップ2.2で述べたとおり)。あるいは、RT-PCRの場合、細胞ペレットをTrizol試薬(1〜300万個の細胞に対して1mL)で溶解します( 材料の表を参照)。溶解バッファーおよびTrizol試薬に再懸濁した細胞は、さらに使用するまで-80°Cで保存できます。

  1. UPRマーカーの分析のためのイムノブロッティング。
    1. 再懸濁した細胞を氷上の溶解バッファーに45分間保持し、ボルテックスを使用して断続的に混合します。
    2. ベンチトップ高速遠心分離機を使用して、細胞を18000 x g で15分間ペレット化します( 材料の表を参照)。上清を新しいチューブに集めます。
    3. Bradfordまたは類似の試薬を使用して、各サンプル中のタンパク質濃度を定量します。
    4. 各サンプルに等濃度のタンパク質を採取し、Laemmli バッファー (6x バッファー: 250 mM Tris-Cl pH 6.8、10% SDS、30% グリセロール、0.02% ブロモフェノール ブルー、5% β-メルカプトエタノール) でタンパク質サンプルを調製します。
      注:各UPRマーカーのイムノブロッティングには、最低60〜80μgのタンパク質を使用しました。
    5. タンパク質サンプルを96°Cで5分間煮沸し、短時間遠心します。
    6. タンパク質サンプルを10%-12%SDS-PAGEゲルで分離し、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します( 材料の表を参照)。
    7. 5%脱脂粉乳またはウシ血清アルブミン(BSA)で1〜2時間ブロックし、TBST(20 mM Tris pH7.4および0.137 M NaCl、0.1% Tween 20)で2回洗浄し、UPRマーカーに対するタンパク質特異的一次抗体( 材料表を参照)をロッカーで4°Cで一晩プローブします。 TBSTでブロットを2回洗浄した翌日、それぞれの二次抗体で1.5時間プローブします。
    8. TBSTでブロットを再度洗浄し、ウェスタンブロットイメージング装置で化学発光検出基質( 材料表を参照)を使用してタンパク質バンドを可視化します。
  2. RTのPCR
    1. Trizol試薬を使用して細胞から全RNAを単離します( 材料の表を参照)。
    2. Moloney Mouseine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT) を使用して、等濃度の RNA から cDNA を調製します ( 資料の表を参照)。
    3. 遺伝子特異的プライマーを用いたqRT-PCRを用いて、HSPA5、スプライシングXBP1、ATF4、CHOP、GADD34のmRNA発現の調節を解析します(表2)。簡単に説明すると、cDNAテンプレート(100 ng)、5 μLのSYBR Green色素( 材料表を参照)、および各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーペアの10 pmolを含む10 μLの反応混合物を調製します。滅菌H2Oを使用して容量を調整します。
    4. 次のプログラムを使用して、リアルタイムPCRマシンで混合物を実行します:初期変性を95°Cで3分間、95°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで30秒間の40サイクル、その後、メルトカーブ分析を行います。ハウスキーピング遺伝子(β-Actinなど)に対する標的遺伝子発現の倍率変化を次のように計算します。
      倍率変化 = 2-Δ(ΔCT)
      ここで、ΔCT = CT (ターゲット) − CT (ハウスキーピング遺伝子)
      およびΔ(ΔCT)=ΔCT(処理済み)-ΔCT(コントロール)
    5. XBP1のスプライシングをさらに確認するには、非感染サンプルと72時間感染サンプルで半定量的RT-PCRを実施します。
      注:XBP-1 mRNAのスプライシングは、スプライス部位全体でRT-PCRを使用して研究されます。
    6. 以下の条件下で、ハイフィデリティPCRマスターミックス(材料表を参照)を用いてXBP1プライマー(表2)でcDNAを増幅します:98 °Cで30秒、続いて98 °Cで15秒、65*Δ-5 °Cで30秒、72 °Cで30秒、続いて98 °Cで15秒のサイクルを30回行い、続いて98 °Cを30サイクルで15秒、 55 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒、その後 72 °C で 10 分間延長し、4 °C で保持します。
    7. 50 ng のエチジウムブロマイド/mL を含む 2.5% アガロースゲルでアンプリコンを分離し、ゲル doc 装置で可視化します。スプライシングされたXBP1バンドは、26ヌクレオチド小さくなります。

5. UPRマーカーのノックダウンとHIV-1 LTRによる遺伝子発現とウイルス産生の解析

  1. UPRマーカーのノックダウンのためのshRNAコンストラクトの調製
    1. pLKO.1-TRCベクターバックボーン(レンチウイルスクローニングベクター)を使用してshRNAコンストラクトを作製する29。
    2. 各遺伝子(IRE1、PERK、ATF6、HSPA5)に対して2つのshRNAコンストラクトを構築します。それぞれの遺伝子のmRNAを標的とするセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAiコンソーシアム(https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library)によって設計されています(表3)。
      注:同様に、shRNAコンストラクトは他のUPRマーカーに対して作製することができます。
    3. プライマー(順方向と逆方向各100 nM)を95°Cでアニールし、続いてRTまで徐々に冷却します。
    4. 次に、T4 DNAリガーゼを使用して、pLKO.1ベクターの Age1 および EcoRI 部位にライゲーションします( 材料の表を参照)。DNAシーケンシングにより配列を確認します。
      注:LacZ遺伝子を標的とするshRNAコンストラクトは、非標的制御として使用されます。
  2. HEK-293T細胞におけるPERK、ATF6、IRE1、HSPA5のノックダウン、ルシフェラーゼアッセイ、p24 ELISA
    1. shRNAコンストラクト(0.9 μg)とトランスフェクション試薬様ポリエチレンイミン(PEI)(DNA1 μgに対してPEI3 μL)( 材料表を参照)を50 μLの無血清培地にボルテックスして調製し、20分間インキュベートします。
    2. フラスコを含むコンフルエントHEK-293T細胞から、トランスフェクションミックスとともに~0.25 x 106 細胞をトリプシン化して播種し、24ウェルプレートでトランスフェクションミックスを行い、総容量を125 μLにし、CO2 インキュベーターで37°Cで6時間インキュベートします。この方法はリバーストランスフェクションと呼ばれ、トランスフェクション混合物とともに細胞に播種されます。
    3. 6時間後、125 μLの完全培地をウェルに加え、細胞を再懸濁して均一に播種します。
      注:ノックダウン実験では、リバーストランスフェクション(ステップ5.2.1-5.2.3)により、shRNAとsiRNAの両方で効率が向上します。
    4. 24時間後、2回目のトランスフェクションを行います。pNL4-3 (100 ng)、pLTR-Luc (100 ng)、および pEGFP-N1 (50 ng) コンストラクトを PEI (1 μg の DNA に対して 3 μL の PEI) と混合した pNL4-3 (100 ng)、および pEGFP-N1 (50 ng) の混合物をボルテックスにより調製します。ミックスを室温で20分間インキュベートし、既存の培地を250μLの新鮮な不完全培地と交換し、ミックスを細胞に加えます。
      注:HIV−1 LTRのレポーターベクターは、pU3RIII30,31からpGL3basicへのLTRを以前の研究室でサブクローニングすることによって開発された32。pEGFP-N1を用いたGFP発現を利用して、トランスフェクション効率を正常化した32。
    5. トランスフェクション後6時間後に、500 μLの完全DMEMで培地を交換します。36時間後に細胞を回収し、イムノブロッティングおよびルシフェラーゼアッセイを行います。
    6. ルシフェラーゼアッセイでは、細胞をペレット化し、市販のルシフェラーゼ基質(50 μL)に再懸濁します( 材料の表を参照)。再懸濁した細胞ライセートを不透明な96ウェルプレートに加え、10〜15分間インキュベートします。ルシフェラーゼの読み取り値をルミノメーターで取得します。また、同じサンプル中のGFP蛍光を測定し、マイクロプレートマイクロモードプレートリーダー(例:494 nm、Em:519 nm)でルシフェラーゼの読み取り値を正規化します。
    7. グラフをY軸上にルシフェラーゼユニット/GFPとしてプロットします。
      注:それぞれのUPRマーカーのノックダウンはチェックする必要があり、それはそれぞれ遺伝子特異的抗体またはプライマーを使用したイムノブロッティングまたはqRT-PCRのいずれかによって行うことができます。
    8. 上記のように、p24 ELISAを処理するために上清を収集します。
  3. UPRマーカーのノックダウンとHIV-1感染による安定細胞の作製。
    1. 6ウェルプレートに播種したHEK-293T細胞に、それぞれのshRNA(1 μg)コンストラクト、pMD2.G(VSV-Gエンベロープベクター)(0.75 μg)、およびpsPAX2(レンチウイルスパッケージングプラスミド)(0.25 μg)( 材料表を参照)をトランスフェクションし、DNA1 μg:PEI3 μLの比率でPEIを使用して、レンチウイルス粒子を調製します。100 μLの不完全DMEMに混合物を調製し、室温で20分間インキュベートし、播種したHEK-293T細胞の1.8 mLの完全培地に混合物を加えます。
      注:トランスフェクションの少なくとも12時間前に、HEK-293T細胞を6ウェルプレートに播種し、形態を獲得し、約60〜70%コンフルエントになるまで投与します。
    2. トランスフェクションの24時間後、各ウェルに1 mLの完全DMEMを添加します。
    3. 48時間後に上清を回収し、-80°C冷凍庫で保存し、p24 ELISAを実行してこれらの上清中のウイルスの存在を確認します。この粗レンチウイルス上清は、J6細胞の形質導入に使用します。
    4. 200万個の細胞を6ウェルプレートに同量のレンチウイルス上清(500 μL)を各コントロールおよび遺伝子特異的ノックダウンレンチウイルスでインキュベートし、ポリブレン(5 μg/mL)の存在下で新鮮な完全RPMI 1640培地を添加して容量を2 mLにします。
    5. 24時間後、各ウェルにピューロマイシン(1 μg/mL)を添加して、安定な細胞を選択します。ピューロマイシンを添加した後、24時間ごとに細胞をペレット化し、ピューロマイシンを含む2mLの新鮮な培地を添加します。
    6. これを細胞死がなくなるまで(~1週間)行います。生き残った細胞は、目的の遺伝子ノックダウンを持つ安定した細胞です。
      注:それぞれの遺伝子のノックダウンは、定期的にチェックでき、最後に、イムノブロッティングまたはqRT-PCRを使用して、ピューロマイシン含有培地で生存細胞のみが見える場合にチェックできます。
    7. セクション2で説明したように、LacZおよび遺伝子特異的ノックダウン細胞に0.5 MOIのHIV-1を感染させ、感染後48時間で細胞を採取します。
    8. 各サンプルから上清を採取し、前述のようにp24-ELISAを処理し、細胞を処理してイムノットダウンレベルを確認します。

6. 小胞体ストレス誘発剤による治療とHIV-1複製への影響の解析

注:HIV-1複製中のUPRの過剰刺激の影響を判断するために、薬理学的誘導分子であるThapsigarginを使用することができます。

  1. Thapsigargin処理時の細胞生存率の決定。
    注:タプシガルギンの細胞毒性は、MTT試薬によって決定されます( 材料の表を参照)。
    1. 100 μLの完全RPMI 1640を含む96ウェルプレートに、ウェルあたり25,000〜30,000個のCEM-GFP細胞を播種します。100 nM Thapsigarginを培地に加え、インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
      注:1 μL の DMSO で処理した細胞をビヒクルコントロールとして採取しました。
    2. 48時間後、各ウェルに10 μLのMTT(5 mg/mL)を加え、暗所で4時間インキュベートして、37°Cで5% CO2を含むホルマザン結晶を形成します。
    3. 4時間後、100 μLのイソプロパノールを使用して結晶を溶解して紫色を形成し、分光光度計を使用して570 nmでの吸光度を測定します。
    4. 以下の式に基づいて細胞生存率を計算します
      % 細胞生存率 = (コントロールOD570 - 処理OD570)/コントロールOD570 x 100
  2. タプシガルギンの前処理とp24ELISAによるHIV-1感染進行の分析。
    1. 1 mLの完全RPMI 1640を含む12ウェルプレートに100万個のCEM-GFP細胞を播種し、37°Cに維持したCO2 インキュベーターで100 nMのThapsigarginまたは1 μLのDMSO(ビヒクルコントロール)で細胞を12時間処理します。 12時間後、細胞を完全なRPMI 1640で洗浄し、前述のように0.5MOIのHIV-1に感染させる。
    2. 感染後24時間、48時間、72時間など、さまざまな時点で細胞を回収し、イムノブロッティングを行います。
    3. 各サンプルから上清を採取し、前述のようにp24 ELISAを実行します。
    4. サンプル中のp24濃度をY軸、それぞれの時点をX軸としてグラフをプロットします。
    5. イムノブロッティングを使用して、任意のUPRマーカーのレベルを測定することにより、タプシガルギン治療による小胞体ストレス誘導を分析します。この研究では、マーカーとしてHSPA5を使用しました。

7. ビリオン感染性に対するUPRの効果を決定するためのTZM-bl β-gal感染性アッセイ

注:ビリオン感染性におけるUPRの役割を理解するために、ノックダウンからの上清およびThapsigarginによる治療は、p24 ELISAによって決定されたp24濃度に基づいて、セクション1.2に記載されているようにTZM-bl β-gal感染性アッセイに使用できます。

  1. 各サンプルから同濃度のp24をTZM-bl細胞に感染させ、βガロン染色を行います。顕微鏡下で青色の感染細胞を10倍の拡大で5つのランダムフィールドに対してカウントします。
  2. 上記の手順から、各サンプルの 5 つのフィールドの数を平均します。
  3. 以下で説明するように、フォールドチェンジを計算します。
    倍率の変化 = テストサンプルの青いセルの平均数/コントロールサンプルの青いセルの平均数。

結果

この研究では、T細胞におけるHIV-1感染時の in vitro ERストレスとUPR活性化を研究するための詳細なプロトコルについて説明しました(図2)。この研究では、HIV-1複製とビリオン感染性におけるUPRの機能的関連性を分析する方法についても説明しています(図3)。

そのために、HIV-1感染による小胞体スト...

ディスカッション

本プロトコルの範囲には、(i)HIV-1ウイルスストックの取り扱いとウイルス濃度とビリオン感染力の測定、(ii)T細胞のHIV-1感染と小胞体ストレスおよびUPRのさまざまなマーカーに対するその影響の評価、(iii)UPRマーカーのノックダウンの影響とHIV-1 LTR駆動遺伝子活性への影響、 ウイルス産生とビリオン感染性、および(iv)薬理学的分子を使用したUPRの過剰刺激とHIV-1複製に...

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

インド政府バイオテクノロジー局国立細胞科学センター(National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of Institutional)の学内支援に感謝いたします。ATとADは、インド政府のバイオテクノロジー部門の国立細胞科学センターから博士号の研究支援を受けたことに感謝しています。DMは、インド政府のSERBからのJCボーズナショナルフェローシップに感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

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